Name: histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

وأيد هذه الدراسة في جزء من "إنديانا جامعة مدرسة من الطب البحوث تعزيز منحة" ومن المعاهد الوطنية للصحة-نييد 1R03AI122127-01. N.A. جزئيا تدعمها خلال هذه الفترة مهن في "زمالة علم المناعة" من "الرابطة الأمريكية للمناعة".

<ol>
	<li>Hohl, T. M., Feldmesser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus:+principles+of+pathogenesis+and+host+defense.">Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense.</a> Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus--what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen?.">Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).</li><li>Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+antifungal+pipeline:+selected+new+molecules+and+beyond.">An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).</li><li>Desoubeaux, G., Cray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Models+of+Invasive+Aspergillosis+due+to+Aspergillus+fumigatus:+Still+a+Long+Path+toward+Standardization.">Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization.</a> Front Microbiol. 8, 841 (2017).</li><li>Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+vertebrate+animal+models+of+fungal+infection.">Overview of vertebrate animal models of fungal infection.</a> J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).</li><li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis.">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li><li>Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+animal+models+of+invasive+aspergillosis.">The future of animal models of invasive aspergillosis.</a> Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).</li><li>Amarsaikhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspofungin+Increases+Fungal+Chitin+and+Eosinophil+and+gammadelta+T+Cell-Dependent+Pathology+in+Invasive+Aspergillosis.">Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis.</a> J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).</li><li>Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+germination+in+murine+airway+CD8++T-cell+responses+to+Aspergillus+conidia.">Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia.</a> PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).</li><li>Brunel, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Antifungal+Activity+by+Human+Primary+Neutrophils+and+Monocytes+in+Response+to+A.+fumigatus.">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Rao, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+technique+for+exposing+the+mouse+lung+to+particles+aspirated+from+the+pharynx.">Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx.</a> J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).</li><li>Bowman, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+assay+to+measure+Aspergillus+fumigatus+burden+in+a+murine+model+of+disseminated+aspergillosis:+demonstration+of+efficacy+of+caspofungin+acetate.">Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RacA+mediates+intracellular+reactive+oxygen+species+production,+polarized+growth,+and+virulence+in+the+human+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).</li><li>Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandins:+the+newest+class+of+antifungals.">Echinocandins: the newest class of antifungals.</a> Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).</li><li>Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+variation+in+18S+ribosomal+DNA+Copy+numbers+in+Aspergillus+fumigatus.">Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus.</a> J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).</li><li>Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+caspofungin+alone+and+in+combination+with+voriconazole+in+a+Guinea+pig+model+of+invasive+aspergillosis.">Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).</li><li>Petraitiene, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+efficacy+of+caspofungin+(MK-0991)+in+experimental+pulmonary+aspergillosis+in+persistently+neutropenic+rabbits:+pharmacokinetics,+drug+disposition,+and+relationship+to+galactomannan+antigenemia.">Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).</li><li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis.">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li><li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein.">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وكان الغرض من هذه المادة الأخذ بأسلوب لتحديد عبء الرئة الفطرية في الفئران مع IA باستخدام مقاطع نسيجية الرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى لتحليل الصور والقياس الكمي. في هذه الدراسة، العلاج بالمخدرات المضادة للفطور β-غلوكان-توليف-استهداف caspofungin14 لم يحسن البقاء على قيد الحياة أو عبء الفطرية في الفئران البرية من نوع نيوتروبينيك مع IA8. ومع ذلك، في غياب الحمضات أو خلايا γδ T، البقاء على قيد الحياة وعبء الفطرية تحسنت. وأظهرت نتائج الدراسة أيضا أن عبء الفطرية منطقة الميكونج الكبرى بالمقارنة تستخدم على نطاق واسع الفطرية الحمض النووي qPCR الأسلوب6ويمكن الحصول على نتائج قابلة للمقارنة.
هناك فوائد عديدة لاستخدام منطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي. أولاً، العملية قد تستخدم عينات نسيجية القائمة، وبالتالي يحتمل أن خفض عدد التجارب اللازمة لتحديد الاختلافات الهامة. وثانيا، في هذه الدراسة، كانت أقل الحيوانات المطلوبة لمنطقة الميكونج الكبرى الفطرية العبء الكمي لتحقيق فروق كبيرة بالمقارنة مع قبكر الفطرية الحمض النووي (الشكل 6، رقم 7). ثالثا، مقارنة بين عبء الفطرية في يعزل مختلفة من قبكر قد تتأثر تعتمد على عزل الاختلافات في نسخة الحمض النووي ريبوسومال رقم15. وفي المقابل، التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى لا يتأثر بعدد النسخ، كما يتحدد عبء الفطرية بالمستويات النسبية لنمو الفطريات الرئة. وهكذا، استخدام منطقة الميكونج الكبرى التقدير الكمي لعبء الفطرية يقلل من استخدام الحيوانات الفقارية ولا تتطلب قبل تحديد عدد النسخ المتاشب. وأخيراً، بالإضافة إلى تعديل مورفولوجيا الفطرية، العلاج كاسبوفونجين يزيد من تجزئة الفطرية، وبالتالي قد مصطنع زيادة عبء الفطرية عندما تقاس بعزل الوحدات تشكيل مستعمرة من الرئة هوموجيناتيس12،16 ،17. وهكذا يتجنب الكمي GMS لعبء الفطرية العديد من القيود المتأصلة مع أساليب أخرى شائعة الاستخدام.
بيد أن القيود المفروضة على منطقة الميكونج الكبرى القياس الكمي و/أو هذه الدراسة من المهم ملاحظة. أولاً، الكتاب يفترض توزيع النمو أصله في جميع أنحاء الرئتين لكل مجموعة تجريبية بصورة قابلة لمقارنة، وهكذا تستخدم الكمي من الممثل 4 10 × حقول موضوعية كقياس تمثيلي لعبء الفطرية في الرئة كاملة (الشكل 6B). فمن الممكن أن في بعض الحالات التوزيع النسبي، وحجم وكثافة من البؤر أصله بما فيه الكفاية تختلف حيث أن عبء الفطرية تبدو مختلفة مع هذا الأسلوب وما يعادلها بواسطة الأسلوب قبكر. ومع ذلك، لدينا نتائج إضافية مع الرئة كله قسم الكمي باستخدام مجالات موضوعية X 4 أظهرت مماثلة، وأن كانت أقل فروق معتد بها إحصائيا، بين المجموعات (الشكل 6). الخطأ المعياري للتقدير الكمي هذا زيد مع هذه الاستراتيجية، يرجح أن سبب انخفاض القرار أصله مع 4 × الهدف والخلفية زيادة في الحقول دون الحد الأمثل. لذلك، إجراء تقييم كمي ممثل لحقول أقل في أعلى التكبير المفضل. وثانيا، استخدمت فقط قسم واحد، وسط لكل عينة. فمن الممكن، استناداً إلى يعزل الفطرية أو استخدام سلالات الفئران، أن بعض الدراسات قد تؤدي إلى توزيع غير متكافئ للنمو أصله. وفي تلك الحالات، ينبغي كمياً مقاطع إضافية في جميع أنحاء كل كتلة البارافين للحصول على عبئا أكثر تمثيلاً. ثالثا، في التجارب التي تحفز إنتاج كبيرة من موكنيس (أي، تحديد مجرى الهواء نمو الفطريات في الحساسية القصبية الرئوية aspergillosis (ABPA)18 أو التليف الكيسي (CF)18)، منطقة الميكونج الكبرى تفاعلية مع يمكن غير محددة إلى منطقة الميكونج الكبرى + نتائج الغنية السكاريد موكنيس19 وهكذا انحراف بعض العينات صالح أعلى عبء الفطرية. منذ فقط نموذج نيوتروبينيك IA استخدمت في هذه الدراسة، فمن الممكن أن استخدام النماذج المختصة أو القمعية الأخرى محصنة يمكن أن يسفر عن نتائج أقل قابلة للمقارنة. وعلى الرغم من هذه المحاذير، والكمي GMS يوفر تقنية قابلة لمقارنة لتحديد عبء الفطرية، واستعماله المستمر في إجراء دراسات إضافية قد كذلك التحقق من فائدة هذا الأسلوب متسقة وموثوق بها وفعالة من حيث التكلفة.

IA هو عدوى الانتهازية التي قد تتطور في الأفراد عرضه مع القصور المناعي الخلقية أو المكتسبة بسبب العلاج المناعي القمعية أو العدوى المزمنة1،2. الإصابة الأولية غالباً ما يحدث في الرئتين، على الرغم من أن في بعض الحالات نشر رشاشيه دخناء إلى الكبد والكلى والقلب، وقد تحدث الدماغ، أدى غزو الأنسجة واسعة من خيوط فطرية مصحوبة بأمراض شديدة وعالية معدلات الوفيات1،2. وعلاوة على ذلك، فعالية القائمة فارماكوثيرابيس محدودة، وقد يكون زاد من ضعف بسبب ظهور سلالات مقاومة لمضاد في البيئة3. ولذلك من المهم لفهم آليات الأمراض الفطرية الفوعة والمضيفة التي تعزز التنمية أو تفاقم الأمراض الفطرية الغازية.
نماذج مورين تظل هامة الميكانيكية IA الدراسات، كما أنها تسمح للباحثين لتقييم أدوار الجينات الفوعة الفطرية واستضافة المناعي المستجيبة لإنشاء ونمو دخناء (أ) المجراة في4،5. ونتيجة لذلك، تم وضع استراتيجيات متعددة بغية قياس أو مقارنة عبء الفطرية في مجموعات من الحيوانات التجريبية6،7بشكل فعال. تشمل هذه الاستراتيجيات المناعة على أساس الثقافة، والكيمياء الحيوية، أو الأساليب قبكر، مع مميزة من مزايا وعيوب كل. وعلاوة على ذلك، كل من هذه الأساليب تنطوي على تفاني مجموعة فرعية حيوانات بالإضافة إلى تلك التي ضحى من أجل تقييم الدالة المستجيب محصنة وتحليل التعبير الجيني، والأنسجة مقارنة7. وبالتالي، غالباً ما تتطلب دراسات IA شاملة إعداد كبيرة من الحيوانات للبحث بتكلفة كبيرة. استراتيجيات فعالة لتقليل وقت التجريبية والتكاليف الحيوانية والاعتبارات الأخلاقية باستخدام الأنسجة الحيوانية لتحليلات متعددة هي بالتالي قيمة للغاية7.
في هذا التقرير، هو عرض أسلوب تصف التحديد الكمي لمنطقة الميكونج الكبرى تلطيخ في مقاطع نسيجية للمقارنة عبء الفطرية النسبي بين المجموعات التجريبية من الفئران مع IA. يتم وصف كل خطوة من الثقافة الفطرية للعدوى والأنسجة الحصاد والتجهيز، والحصول على الصور وتحليل البيانات، بالتفصيل. الأعباء الفطرية التي حصل عليها تقدير حجم منطقة الميكونج الكبرى قورنت مع قبكر في نماذج نيوتروبينيك من ألف وفي الفئران البرية من نوع أو تفتقر إلى eosinophil caspofungin تعامل مع IA8. وأظهرت النتائج تشابه مع التقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى و qPCR للحمض النووي الفطرية. وهذا يوحي بأن القياس الكمي منطقة الميكونج الكبرى قد تكون مفيدة للباحثين المشاركين في التحليل النسيجي كوسيلة تكميلية أو بديلة من المقارنة بين العبء النسبي الفطرية في الفئران مع IA، وربما في نهاية المطاف تقليل التكلفة واستخدام الحيوانات للبحث في دراسات معقدة، والميكانيكية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Center</td>
			<td>FGSC #A1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2155315</td>
			<td>White Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L11843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Dry Cabinet</td>
			<td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td>
			<td>HSFC160FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass Beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Model DME Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>13595XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td>
			<td>BioXCell</td>
			<td>BP0075-1</td>
			<td>Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>M3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pureline Oxygen Concentrator</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>OC8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slant Board Restraint</td>
			<td>Indiana State University Facilities Management</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z192406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9742754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B1000729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest&#160;Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td>
			<td>Labequip.com</td>
			<td>31930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>66630-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>116875H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT100A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC410530250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Provis AX70 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PHOTO Universal Photo System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PHOTO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-MCB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7740020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima C&#160;Plus&#160;Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-257-80</td>
			<td>Displacement- 6.1 cfm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A383-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO&#160;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&#160;DFS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9573988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-24</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0451999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482;&#160;ABsolute Blue qPCR Mixes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB4137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Probe, 5&#8242;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sense Amplification Primer, 5&#8242;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense Amplification Primer, 5&#8242;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#8482; MicroAmp&#8482; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>43-165-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Domed and Flat PCR Cap Strips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401443</td>
			<td>Stratagene is now owned by Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 (B6) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosinophil-deficient (&#916;dblGATA, BALB/c background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;&#948; T cell-deficient (TCR&#948;-/-, B6 background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spot Advanced Software</td>
			<td>Spot Imaging</td>
			<td>SPOT53A</td>
			<td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step 4.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

التحديد الكمي لعبء الرئة الفطرية أمر حاسم لتحديد المستويات النسبية للحماية المناعية وضراوة الفطرية في نماذج الماوس للرئة الفطرية. على الرغم من أن تستخدم أساليب متعددة لتقييم عبء الفطرية، برز الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (قبكر) للحمض النووي الفطرية كأسلوب مع العديد من المزايا السابقة الأساليب القائمة على الثقافة. حاليا، تقييما شاملا لأمراض الرئة وتجنيد الكريات البيض وعبء الفطرية والتعبير الجيني في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية (IA) يتطلب استخدام عدد كبير من التجارب ومراقبة الحيوانات. هنا كان درس التحديد الكمي للرئة النسيجي تلطيخ لتحديد عبء الفطرية باستخدام عدد أقل من الحيوانات بالتفصيل. أقسام الرئة كانت الملون لتحديد هياكل الفطرية مع جوموري لتعديل ميثاناميني الفضة (GMS) تلطيخ. صور مأخوذة من أقسام الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى من 4 حقول منفصلة كل الرئة جزءا لا يتجزأ من البارافين الفورمالين--الثابتة. منطقة الميكونج الكبرى الملون المناطق داخل كل صورة كانت كمياً باستخدام برنامج تحليل صورة، ومتوسط النسبة المئوية للمنطقة الملون من هذا التحديد الكمي، مصممة لكل عينة. باستخدام هذه الاستراتيجية، تفتقر إلى eosinophil الفئران أظهرت انخفض عبء الفطرية والمرض مع العلاج كاسبوفونجين، بينما لم تتحسن الفئران البرية من نوع مع IA مع كاسبوفونجين. وبالمثل، عبء الفطرية في الفئران التي تفتقر إلى خلايا γδ تي كما تحسنت ب caspofungin، مقاسا قبكر والتقدير الكمي في منطقة الميكونج الكبرى. ولذلك هو عرض التحديد الكمي في منطقة الميكونج الكبرى كوسيلة لتحديد عبء النسبي الرئة الفطرية التي يمكن في نهاية المطاف خفض كمية الحيوانات التجريبية اللازمة لإجراء دراسات شاملة ل aspergillosis الغازية.

الشكل 4 يتضمن رسم بياني للبقاء على قيد الحياة نوع البرية أو الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA تعامل مع كاسبوفونجين. وتبين النتائج أن الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل أظهرت زيادة البقاء على قيد الحياة بالمقارنة مع الفئران البرية من نوع (الوفيات 50% مقابل معدل وفيات 100%، على التوالي). يبين الشكل 5 ممثل منطقة الميكونج الكبرى تلطيخ من نيوتروبينيك البرية من نوع والفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA تعامل أو دون علاج مع كاسبوفونجين. العلاج كاسبوفونجين أدت إلى إزالة الفطريات النسبي في eosinophil-ناقصة، لكن الفئران البرية ليست من نوع (حق الألواح)، بينما كلا الفريقين تتلق caspofungin مماثلة (لوحات الأيسر). الشكل 6 يوضح المقارنة بين عبء الفطرية في التعامل مع كاسبوفونجين والسيطرة على الفئران البرية من نوع أو تفتقر إلى اوسينوفيل غير المعالجة، واستخدام كلا qPCR الفطرية الحمض النووي (الشكل 6A) وممثل منطقة الميكونج الكبرى حقول القياس الكمي 4 (10 X الهدف) ( الشكل 6B). وتظهر النتائج التي تم إنشاؤها من كلتا الطريقتين أن نتائج العلاج كاسبوفونجين في عبء الفطرية أهم انخفاض بين الفئران البرية من نوع وتفتقر إلى اوسينوفيل (الشكل 6A). ومع ذلك، أدى فقط منطقة الميكونج الكبرى الكمي في الفئران غير المعالجة، انخفاضا كبيرا في الفئران التي تفتقر إلى الحمضات (الشكل 6B). عندما تم حساب متوسط مجال أقسام الجامعة والرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى (4 X الهدف)، الفروق كانت مماثلة للنتائج التي تم الحصول عليها مع الممثل 10 4 X الحقول، ولو بأقل دلالة إحصائية (الشكل 6). يبين الشكل 7 البقاء على قيد الحياة، صور لممثل منطقة الميكونج الكبرى المصبوغة (المجالات 4 10 X)، والتقدير الكمي لعبء الفطرية بكلتا الطريقتين في γδ الفئران تفتقر إلى خلية T (TCRδKO) التي كانت تعامل مع كاسبوفونجين بالمقارنة مع التحكم، دون علاج الفئران. Caspofungin العلاج تحسين البقاء على قيد الحياة (الشكل 7 أ) وعبء الفطرية (الشكل 7-د) في الفئران TCRδKO. مماثلة لنتائج الرقم 6، عبء الفطرية مقاسا ب qPCR (الشكل 7) وممثل منطقة الميكونج الكبرى الكمي (الشكل 7) وكانت النتائج قابلة للمقارنة.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> الشكل 4: زيادة البقاء على قيد الحياة في الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل (ΔdblGATA) بألف بعد العلاج مع كاسبوفونجين- 15-30 الفئران/المجموعة. ملخص التجارب 3-6. ف < 0.0001. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> الرقم 5: صور الممثل لأقسام الرئة الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى من البرية من نوع أو eosinophil ناقصة، وتعامل كاسبوفونجين أو عنصر التحكم دون علاج الفئران مع جوعه ممثل الفئران/المجموعة 3-4. شريط مقياس ما يعادل 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> رقم 6: عبء الفطرية في البرية من نوع الفئران التي تفتقر إلى اوسينوفيل مع IA العلاج أو التحكم تعامل مع كاسبوفونجين- (أ) qPCR للحمض النووي الفطرية. 15-30 الفئران/مجموعة موجزة من تجارب 3-6. (ب) منطقة الميكونج الكبرى التحديد الكمي للمقاطع النسيجي، يعني في المائة لمنطقة الميكونج الكبرى تلطيخ من الحقول 4 (10 x الهدف). (ج) منطقة الميكونج الكبرى الكمي، % يعني قسم الرئة كاملة (4 X الهدف). B و C ملخص للفئران/المجموعة 5. ف < 0.05. ف < 0.001. ف < 0.0001. وهذا الرقم تم إنشاؤها باستخدام البيانات التي تم الإبلاغ عنها في منشور سابق8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> رقم 7: تناقص شدة IA في الفئران تفتقر إلى خلية T γδ بعد العلاج كاسبوفونجين. (أ) البقاء على قيد الحياة. (ب) qPCR للحمض النووي الفطرية. (ج) منطقة الميكونج الكبرى التحديد الكمي لعلم الأنسجة. (د) الممثل الصور الملطخة بمنطقة الميكونج الكبرى أقسام من الخلايا γδ تي مع IA، caspofungin المعالجة أو غير المعالجة. A و B ملخص لتجربتين مع 7-10 الفئران/المجموعة. ج ود ملخص للفئران/المجموعة 4. ف < 0.05. ف < 0.01. ف < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتحديد عبء الفطريات الرئوية في الفئران مع أسبيرجيلوسيس الغازية بالتحديد الكمي للفضة ميثاناميني المعدلة جوموري لتلطيخ في أقسام النسيجي. استخدام هذا الأسلوب أدى إلى نتائج قابلة للمقارنة مع الحيوانات أقل مقارنة بتقييم عبء الفطرية PCR الكمي للرئة الفطرية الحمض النووي.

القياس الكمي نسيجية لتحديد عبء الرئة الفطرية في أسبيرجيلوسيس التجريبية

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

الكشف عن الرشاشيات الرئوي الغازية في الخباثة المرضى باستخدام مكونات دم الاطراف تدفق التكنولوجيا

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

الكمي للاستعمار الفطرية، تولد الأبواغ، وإنتاج السموم الفطرية عن طريق اختبارات بيولوجية على النواة

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; العدوى

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

اختبار تحمل الجلوكوز داخل، قياس وظيفة الرئة، والتثبيت في الرئة لدراسة تأثير السمنة والايض البصر على النتائج الرئوية

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...