Name: histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Denne undersøgelse var delvist understøttet af en Indiana University skole af medicin forskning Enhancement Grant og af NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. blev delvis støttet i denne periode af en karriere i immunologi Fellowship fra American Association for Immunologists.

Alle dyr procedurer blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Indiana State University, Indiana University School of Medicine vært campus — Terre Haute.
1. forberedelse af A. fumigatus konidier for infektion
<ol><li>Mens du arbejder i et velventileret stinkskab, tilsæt 125 µL af A. fumigatus 293 stamopløsning til 900 µL celle kultur grade vand (CCGW). Derefter overføre løsningen at malt ekstrakt agar (MEA) plade via pipette og fordeles jævnt med en inoculating loop.</li>
	<li>Gemme svampe pladen i mørke ved 24 ° C i mindst 14 dage og højst 28 dage.</li>
	<li>Høst konidier bruger glasperler som tidligere beskrevet9.</li>
	<li>Hæld 1,5 g af 0,5 mm glasperler på pladen og forsigtigt VIP det frem og tilbage indtil perlerne er belagt for at udtrække konidier. Indsamle perle/konidier blandingen i en 15 mL konisk slange. Suspendere i 5 mL Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) og vortex.</li>
	<li>Tælle konidier i et 50 x fortynding af supernatanten i DPBS ved hjælp af en hemocytometer. Tæl antallet af konidier i det område, vist i figur 1 og bruge ligningen 1 til at beregne koncentrationen. #Conidia × fortynding faktor × 104= konidier/mL (ligning 1) Bemærk: Yderligere 4 x 4 firkantede hjørne områder kan medregnes, med middelværdien af disse arealer, der anvendes som #Conidia i ligningen 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg"> Figur 1: Hemocytometer repræsentative område anvendes til konidier tælle (boks, pil).
<ol start="6"><li>Fortynd konidier suspension med sterilt saltvand (DPBS) til at opnå den ønskede koncentration, 1,0 x 108 konidier/mL for infektion med 5 x 106 konidier/50 µL. forberede 50 µL af konidier løsning pr. 'n + 2' mus til at være inficeret konto for pipettering fejl. Bemærk: Standard svamp høst og forberedelse/filtrering kan være alternativt brugte10. Glas perle metode er bedst bruges til at sikre, at konidier prøver med minimal lille/opløselige hyphal antigener fremstilles for aspiration.</li>
</ol>2. immunsuppression og infektion i Murine Model
<ol><li>Bruge 7-10 uger gamle mus. Bemærk: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinofil-mangel (ΔdblGATA, BALB/c baggrund), og γδ T-celle-mangel (TCRδ-/-, B6 baggrund) mus blev brugt til denne undersøgelse. For hver eksperimentere, alder og køn-matchede blev (både hanner og hunner) mus brugt til hver gruppe.</li>
	<li>Nedbryder neutrofiler via intraperitoneal (IP) injektion af 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G antistof i sterilt saltvand ved 45° i den laterale nederste højre kvadrant (For en eksperimentel tidsplan, se figur 2).</li>
	<li>24 timer senere, inficere mus ved aspiration med 5,0 x 106A. fumigatus konidier suspenderet i 50 µL sterilt saltvand (Se trin 2.4-2.10) som tidligere beskrevet11. Efter infektion, indsprøjtes et undersæt af dyr med svampedræbende middel som 5 mg/kg caspofungin diacetat i DPBS anvendes i denne undersøgelse (dagligt, se figur 2).</li>
	<li>Bedøver mus med 99,9% isofluran ved hjælp af en veterinær anæstesi maskine.<ol>
<li>Placer et stykke køkkenrulle på gulvet af induktion kammer at fange afføring og urin.</li>
		<li>Placere musen i salen, induktion, sikre låget og sæt vaporizer til 5% isofluran for 2 min og 30 s. Bemærk: Vet salve anvendes ikke, fordi den samlede tid under anæstesi er mindre end 5 min.</li>
		<li>Reducere vaporizer til halvdelen af den maksimale indstilling for 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekræfte, at musen er korrekt bedøvede ved at observere langsommere vejrtrækning, manglende bevægelse og manglende respons til tå-knivspids stimulus.</li>
	<li>Fjerne musen fra induktion kammer og sted på en skrå bord. Placer musen med ryggen mod bestyrelsen. Sikre, at dens øvre fortænder er forsigtigt tilbageholdende med en elastik og den nedre fortænder er forsigtigt tilbageholdende med en metaltråd.</li>
	<li>Omhyggeligt holde tungen på fuld udvidelse med lille pincet og pipette 50 µL af konidier/PBS suspension i bunden af tungen.</li>
	<li>Hold tungen på fuld udvidelse; lytte til hurtig vejrtrækning og de forskellige klikkende lyd af aspiration. Hold til 20 s eller indtil suspension er fuldt indsugning.</li>
	<li>Fjerne musen fra skrå bord og blidt sted i et bur til observation.</li>
	<li>Efter aspiration, skal musen genvinde bevidsthed i 1 min. skærm musen indtil fuldt bevidst og i stand til at gå rundt i buret. Dyrene bør opstaldet ved 21 ° C og overvåges to gange dagligt indtil lungerne er høstet.</li>
	<li>Gentag nedbrydningen af neutrofiler (trin 2.2) 24 timer efter infektionen (figur 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg"> Figur 2: eksperimenterende tidsplan. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation8.
3. høst og bevarelse af musen lungerne for histologiske analyse
<ol><li>Dybt bedøver dyret med en dødelig dosis på 0,1 ml af 390 mg/ml pentobarbital natrium løsning IP.</li>
	<li>Bekræfte eutanasi ved at observere mangel på spontan vejrtrækning og manglende svar på lemmer stimulation med pincet. Når euthanized, spray slagtekroppen med 70% ethanol til at sterilisere.</li>
	<li>Sted slagtet på en skum bord dækket med en absorberende puden. Bemærk: Slagtekroppen skal placeres på ryggen med stifter at sikre alle fire lemmer til skum-bestyrelsen.</li>
	<li>Åbn det øverste brysthulen ved hjælp af saks med forsigtighed. Skære brystkassen væk for at udsætte lungerne og hjertet. Skær den ringere vena cava til perfusion. Undgå at skære blodkarrene og punktering organer.</li>
	<li>Langsomt perfuse med 5 mL af kolde DPBS i højre hjertekammer af hjertet i en 45° vinkel med en 25-G kanyle. Gentag perfusion med 5 mL af 10% formalin.</li>
	<li>Omhyggeligt udsætte luftrøret og frigøre det omgivende fedtpuder. Være forsigtig og undgå punktering i luftrøret. Sikre den overskydende bindevæv er fjernet for at fuldt visualisere luftrøret, før du fortsætter. Når luftrøret er udsat, placere pincet under luftrøret at ophøje det.</li>
	<li>Stikke et lille hul i den øvre luftrør ved hjælp af en 25-G nål. Bemærk: Hullet skal placeres, så at hele kanylen passer ind i luftrøret. Forsigtig undgå brud i luftrøret.</li>
	<li>Indsæt en kanyle gennem hullet og mod lungerne. Sikre kanylen med en kirurgisk tråd bundet løst omkring luftrøret. Bemærk: Hvis luftrøret er bristet, kanylen kan indsættes forbi luftrøret så vidt muligt i luftvejene.</li>
	<li>Ved hjælp af en sprøjte, puste lungerne med 1 mL 10% formalin buffer gennem kanylen. Sikre, at inflation af lungerne er synlige. Hvis ikke, justere kateteret og Gentag. Når lungerne er oppustet, hurtigt fjerne kanyle med forsigtighed og stramme tråden sikkert at forsegle ned i luftrøret. Bemærk: Hvis luftrøret er bristet og lungerne kan ikke være oppustet, lungerne kan stadig høstes men dette kan forhindre korrekt fiksering.</li>
	<li>Forsigtigt fjerne luftrøret og lungerne fra brystet ved omhyggeligt frakobling bindevæv af luftrøret med pincet mens du forsigtigt trækker på tråden. Placer lunger og luftrør i en 50 mL konisk slange med 15 mL 10% formalin buffer. Ene ende af tråden uden for røret og forsegle fælles landbrugspolitik. Vend røret for at helt nedsænkes prøven i fiksativ.</li>
	<li>Opbevare prøver ved rumtemperatur i mindst 24 timer eller indtil videre forarbejdning. Forsigtighed: Formalin er farlige. Bære passende personlige værnemidler, herunder briller og en ansigtsmaske. Arbejde under en kemisk hood ved behandling af prøver.</li>
</ol>4. høst og bevarelse af musen lungerne for DNA svampe byrde
<ol><li>Følg trin 3.1-3.5, som beskrevet ovenfor, på en separat mus.</li>
	<li>Langsomt perfuse med 10 mL af kolde DPBS i højre hjertekammer af hjertet i en 45° vinkel med en 25-G kanyle.</li>
	<li>Punktafgifter lungerne med saks og placere i mærket 1,5 mL rør.</li>
	<li>Gemme lungerne ved-80 ° C indtil videre forarbejdning.</li>
	<li>Bruge standard teknikker som beskrevet (indlejring og skæring) og ifølge producentens protokoller (Se Tabel af materialer).</li>
</ol>5. mikroskopi og billedbehandling
<ol><li>Åbn kvantificering billedbehandlingsprogram (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Bruger et lysmikroskop, opnå mindst 4 forskellige felter af GMS farves dias (10 X mål). Sikre, at billederne er repræsentant for inficerede luftvejene i lungerne med lignende væv tæthed. Bemærk: Hvis tæthed og distribution af hyphal foci vises markant forskellige mellem kontrol og eksperimentelle grupper, yderligere felter kan tages, eller området GMS i afsnittet hele lunge kan være afbildet (4 X mål). Få billeder af de samme områder af lungen (identificeret af tilsvarende væv morfologi) på en seriel lunge sektion farves med hæmatoxylin og eosin, hvis det ønskes.</li>
	<li>Tilføje skala barer til billederne, hvor det er nødvendigt og gemme billeder til kvantificeres. Vælg, Rediger > Tilføj/Rediger kalibrering mærker > Menu: Vælg linje tykkelse, farve og skala bar størrelse > Klik på billedet for hvor skalalinjen er skal placeres. Lukker menuen og vælg, Rediger > Flet > Flet kalibrering mærker > Vælg Gem fil som > Navngiv filen, og klik på Gem.</li>
</ol>6. Brug et billede behandlingsprogram til at beregne de svampe byrde (figur 3)
<ol><li>Åbn et billede behandlingsprogram. Vælg fil > mappe med prøver at kvantificere > billede (figur 3A). Vælg billede > Type > Konverter til "RGB-Stack" (figur 3B).</li>
	<li>Brug højre piletast til at vælge andet af de tre givne billeder (figur 3B). Hit "control + shift + T" opdrage "Threshold" menuen Indstillinger regulator (figur 3 c). Find den oprindelige .tiff eller .jpg billede som en reference og åbne med en billedvisning program (figur 3 c).</li>
	<li>Træk den øverste skyder helt til venstre og justere skydekontrollen bunden, indtil området valgt (i rødt) er repræsentant for mikroskopi billede (typisk spænder fra 130-160 som anført til højre for skyderen (figur 3 c).</li>
	<li>Når det er valgt, skal du trykke på "Sæt" > "OK" (figur 3D). Vælg "Analyze" > "Sæt målinger" > tjekke "Område, område brøkdel, grænse tærskel, visningsetiket" og forlade bunden indstillinger (drop-down menuen og decimaler) som standard > "OK" (figur 3D).</li>
	<li>Væsentlige områder af blanktegn eller baggrunden farvning kan udelukkes ved udvælgelse af de relevante væv med et område eller en polygon værktøj.</li>
	<li>Endelig vælge "Analyser" > "Foranstaltning" (vises et vindue med data, eller en fane på proceslinjen i windows vises mærket, "Resultater") (figur 3). Overfør dataene til en data analysis program for graftegning og statistisk analyse.</li>
	<li>Angiv gennemsnittet af de fire område procentsatser for hver lunge prøve. 5-8 prøver er generelt tilstrækkeligt til at påvise betydelige forskelle mellem grupper. Hvis man sammenligner to eksperimentelle grupper, udføre en uparret student's t-test til at bestemme betydning.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg"> Figur 3: repræsentant screenshots til hvert trin i GMS histologiske feltet kvantificering. (A) Vælg fil > mappe med prøver at kvantificere > Vælg billede. (B) skal du vælge Billede > Type > Konverter til "RGB stak". Brug højre piletast til at vælge andet af de tre givne billeder. (C) Hit "control + shift + T" opdrage "Threshold" menuen Indstillinger regulator. Find den oprindelige .tiff eller .jpg billede som en reference og Åbn med photo viewer program. Træk den øverste skyderen helt til venstre og justere skydekontrollen bunden, indtil området valgt (i rødt) er repræsentant for mikroskopi billede (typisk spænder fra 130-160 som anført til højre for skyderen. (D) når valgte Tryk på "Set" > "OK". Vælg "Analyze" > "Sæt målinger" > tjekke "Område, område brøkdel, grænse tærskel, visningsetiket" og forlade bunden indstillinger (drop-down menuen og decimaler) som standard > "OK". (E) endelig vælge "analyser" > "Foranstaltning" (vises et vindue med data, eller en fane på proceslinjen i windows vises mærket "Resultater"). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
7. DNA svampe byrde
<ol><li>Fjerne lungerne fra-80 ° C og lyophilize for mindst 4 h (natten er optimal) eller indtil helt tørret af en fryse tør system.</li>
	<li>Mens lungerne tørring, forberede DNA ekstraktionsbuffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, og 0,5% SDS).</li>
	<li>Placer forberedt DNA udvinding buffer i en 60 ° C vandbad at pre varme. Også, placere phenol: chloroform: isoamyl alkohol (25:24:1) i en 50 mL konisk rør og giver mulighed for adskillelse.</li>
	<li>Placer de frysetørrede lungerne i et 2 mL skruelåg rør med 0,2 mL af glasperler. Bruger en perle tæppebanker, male tørre lungevæv til 15-30 s, indtil det danner et fint pulver.</li>
	<li>Tilføje 0,8 mL varm DNA-ekstraktion buffer til hver tube og vortex godt. Inkuber hver tube for 15 min i en 65 ° C perle bad og derefter vortex før inkubere for en yderligere 15 min. Efter inkubation, vortex og derefter centrifugeres rør på 25.000 x g i 10 min.</li>
	<li>Etiket 3 sæt af 1,5 mL rør for hver af prøverne og overføre det øverste lag af supernatanten til ét sæt rør. Forsigtig mens pipettering ud den vandige øverste lag til at forhindre forstyrrelser på det midterste lag.</li>
	<li>Tilføj lige saa stort volumen af phenol: chloroform: isoamyl alkohol og bland godt. Derefter centrifugeres ved 25.000 x g i 15 min. før pipettering ud det øverste lag i det andet sæt af rør.</li>
	<li>Tilføj lige saa stort volumen af chloroform: isoamyl chloroform, bland godt og centrifugeres ved 25.000 x g i 10 min. omhyggeligt pipette ud det øverste lag i det tredje sæt af rør.</li>
	<li>Tilføje 500 µL af isopropanol og 50 µL NaoAc (pH 5,2), bland godt, og tillade prøver at Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Derefter centrifugeres ved 25.000 x g i 30 min og den dekanteres.</li>
	<li>Vaske DNA pellet med 750 µL af is kold 70% ethanol, og der centrifugeres i 5 min på 25.000 x g. Decant ethanol og tillade pellets til luft tørre i rør i en fume emhætter i 40 min.</li>
	<li>Resuspend tør pellets i 300 µL af TE buffer. Bemærk: DNA kan opbevares ved-20 ° C indtil kvantificeret.</li>
	<li>Kvantificere DNA ved hjælp af et spektrofotometer og forberede qPCR analyse 100 µL af 0,2 µg/µL af hver DNA-prøve.</li>
	<li>Udføre en standard qPCR i tre eksemplarer som tidligere beskrevet med 1 µg af DNA-prøve, svampe 18S rDNA primer, og sonden sætter med en modificeret sonde quencher (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ /-3')12,13.</li>
	<li>Forberede en standardkurve fra A. fumigatus genomisk DNA og beregne svampe DNA i pg koncentrationen i hver prøve ved hjælp af den gennemsnitlige reporter farve Ct værdier.</li>
	<li>Plot af pg/µg svampe DNA med standard fejl af middelværdien. Udføre en student's t-test analyse for at fastslå betydning. Bemærk: som et mindre giftigt alternativ til phenol-chloroform DNA-ekstraktion anvendes heri, kolonne baseret DNA-ekstraktion kits kan bruges.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hohl, T. M., Feldmesser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus:+principles+of+pathogenesis+and+host+defense.">Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense.</a> Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus--what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen?.">Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).</li><li>Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+antifungal+pipeline:+selected+new+molecules+and+beyond.">An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).</li><li>Desoubeaux, G., Cray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Models+of+Invasive+Aspergillosis+due+to+Aspergillus+fumigatus:+Still+a+Long+Path+toward+Standardization.">Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization.</a> Front Microbiol. 8, 841 (2017).</li><li>Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+vertebrate+animal+models+of+fungal+infection.">Overview of vertebrate animal models of fungal infection.</a> J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).</li><li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis.">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li><li>Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+animal+models+of+invasive+aspergillosis.">The future of animal models of invasive aspergillosis.</a> Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).</li><li>Amarsaikhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspofungin+Increases+Fungal+Chitin+and+Eosinophil+and+gammadelta+T+Cell-Dependent+Pathology+in+Invasive+Aspergillosis.">Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis.</a> J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).</li><li>Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+germination+in+murine+airway+CD8++T-cell+responses+to+Aspergillus+conidia.">Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia.</a> PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).</li><li>Brunel, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Antifungal+Activity+by+Human+Primary+Neutrophils+and+Monocytes+in+Response+to+A.+fumigatus.">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Rao, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+technique+for+exposing+the+mouse+lung+to+particles+aspirated+from+the+pharynx.">Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx.</a> J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).</li><li>Bowman, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+assay+to+measure+Aspergillus+fumigatus+burden+in+a+murine+model+of+disseminated+aspergillosis:+demonstration+of+efficacy+of+caspofungin+acetate.">Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RacA+mediates+intracellular+reactive+oxygen+species+production,+polarized+growth,+and+virulence+in+the+human+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).</li><li>Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandins:+the+newest+class+of+antifungals.">Echinocandins: the newest class of antifungals.</a> Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).</li><li>Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+variation+in+18S+ribosomal+DNA+Copy+numbers+in+Aspergillus+fumigatus.">Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus.</a> J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).</li><li>Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+caspofungin+alone+and+in+combination+with+voriconazole+in+a+Guinea+pig+model+of+invasive+aspergillosis.">Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).</li><li>Petraitiene, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+efficacy+of+caspofungin+(MK-0991)+in+experimental+pulmonary+aspergillosis+in+persistently+neutropenic+rabbits:+pharmacokinetics,+drug+disposition,+and+relationship+to+galactomannan+antigenemia.">Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).</li><li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis.">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li><li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein.">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Formålet med denne artikel var at indføre en metode til bestemmelse af lungen svampe byrde i mus med IA ved at udnytte GMS-farvede lunge histologiske sektioner til billedanalyse og kvantificering. I denne undersøgelse, behandling med β-glucan-syntese-målretning svampedræbende medicin caspofungin14 ikke bedre overlevelse eller svampe byrde i neutropenisk wild-type mus med IA8. Men, i mangel af eosinofile eller γδ T celler, overlevelse og svampe byrde forbedret. Resultaterne af vores undersøgelse viste også, at sammenlignelige resultater kan opnås ved GMS svampe byrde i forhold til den udbredte svampe DNA qPCR metode6.
Der er flere fordele ved at udnytte GMS svampe byrde kvantificering. Først, processen kan udnytte eksisterende histologiske prøver, dermed potentielt reducere antallet af eksperimenter skal bestemme betydelige forskelle. For det andet i denne undersøgelse var mindre dyr nødvendige for GMS svampe byrde kvantificering at opnå betydelige forskelle i forhold til qPCR svampe DNA (figur 6, figur 7). For det tredje, sammenligning af svampe byrde i forskellige isolater af qPCR kan blive påvirket af isolatet-afhængige forskelle i ribosomale DNA kopi nummer15. Derimod er GMS kvantificering ikke berørt af eksemplarnummer, som svampe byrde er bestemt af relative niveauer af lunge svampevækst. Således brug GMS bestemmelsesgrænsen for svampe byrde reducerer brugen af hvirveldyr og kræver ikke før bestemmelse af rDNA kopi nummer. Endelig, ud over at ændre svampe morfologi, caspofungin terapi øger svampe opsplitning, og dermed kan kunstigt øge svampe byrde målt ved isolering af kolonien danner enheder fra lunge homogenater12,16 ,17. Således undgår GMS kvantificering af svampe byrde flere begrænsningerne med andre almindeligt anvendte metoder.
Begrænsningerne i GMS kvantificering og/eller denne undersøgelse er imidlertid vigtigt at bemærke. Først, forfatterne antaget en tilsvarende fordeling af hyphal vækst i hele lungerne af hver eksperimentelle gruppe, og dermed bruges kvantificering fra 4 repræsentant 10 x objektive felter som en repræsentativ måling for svampe byrden i hele lungen (Fig. 6B). Det er muligt, at i nogle tilfælde relative fordeling, størrelse og tæthed af hyphal foci ville tilstrækkeligt adskiller sig så at den svampe byrde ville vises anderledes med denne metode og tilsvarende af metoden qPCR. Men vores yderligere resultater med hele lunge afsnit kvantificering ved hjælp af 4 X objektive felterne viste lignende, omend mindre statistisk signifikante forskelle mellem grupperne (figur 6 c). Standardafvigelsen på denne kvantificering blev forøget med denne strategi, sandsynligvis på grund af nedsat hyphal opløsning med 4 X mål og øget baggrund i suboptimal felter. Derfor foretrækkes en repræsentative kvantitativ bestemmelse af færre felter på højere forstørrelse. For det andet blev kun en enkelt, central del brugt til hver prøve. Det er muligt, baseret på de svampe isolater eller mus stammer anvendes, at nogle undersøgelser kan resultere i en ujævn fordeling af hyphal vækst. I disse tilfælde bør yderligere sektioner i hele hver paraffin blok kvantificeres for at opnå et mere repræsentativt byrde. For det tredje i eksperimenter, der inducerer betydelig produktion af Muciner (dvs.kvantificering luftvejene svampevækst i allergiske bronchopulmonary aspergillose (ABPA)18 eller cystisk fibrose (CF)18), GMS reaktivitet med polysakkarid-rige Muciner19 kunne give uspecifikke GMS + resultater og dermed forvrænge nogle prøver til fordel for højere svampe byrde. Da kun neutropenisk modellen af IA blev brugt i denne undersøgelse, er det muligt, at brugen af andre immun kompetente eller undertrykkende modeller kunne resulterer i mindre sammenlignelige resultater. Trods disse forbehold, GMS kvantificering giver en lignende teknik til at bestemme svampe byrde, og dens fortsatte brug i supplerende undersøgelser kan yderligere validere nytten af denne metode som konsekvent, pålidelig og omkostningseffektiv.

IA er en opportunistisk infektion, der kan udvikle sig i modtagelige personer med medfødt eller erhvervet immun mangler på grund af immun suppressiv behandling eller kronisk infektion1,2. Primær infektion ofte forekommer i lungerne, men i nogle tilfælde formidling af Aspergillus fumigatus til leveren, nyrer, hjerte og hjerne kan forekomme, resulterer i omfattende væv invasion af hyfer ledsaget af alvorlige sygdomme og høje satserne for dødelighed1,2. Desuden, effekten af eksisterende pharmacotherapies er begrænset, og kan blive yderligere svækket af fremkomsten af svampemidler-resistente bakteriestammer i miljøet3. Det er derfor vigtigt at forstå de mekanismer i svampe virulens og vært patologi, der fremmer udvikling eller forværring af invasive svampesygdom.
Murine modeller er fortsat vigtig for mekanistisk IA undersøgelser, som de tillader forskere til at vurdere rollerne af svampe virulens gener og vært immun effektorer for oprettelse og vækst af A. fumigatus in vivo4,5. Derfor har flere strategier været udtænkt for at effektivt kvantificere eller sammenligne svampe byrde i grupper af forsøgsdyr6,7. Disse strategier indebærer kultur-baseret, biokemiske, immunoassay eller qPCR metoder, hver med forskellige fordele og ulemper. Desuden, hver af disse metoder indebærer ved indvielsen af en delmængde af dyr end dem, der ofrede for vurderinger af immun effektor funktion, gene expression analyse og sammenlignende histopatologi7. Således kræver omfattende IA undersøgelser ofte betydeligt antal forskning dyr med betydelige omkostninger. Effektive strategier, der reducerer eksperimentelle tid, animalsk omkostninger og etiske overvejelser ved at udnytte dyrevæv for flere analyser er derfor meget værdifulde7.
I denne betænkning, er en metode, der beskriver kvantificering af GMS farvning i histologiske sektioner for sammenligning af den relative svampe byrde mellem eksperimentelle grupper af mus med IA indført. Hvert trin fra svampe kultur infektion, væv høst og forarbejdning, og image erhvervelse og dataanalyse, er beskrevet i detaljer. Svampe byrder fremstillet ved GMS kvantificering blev sammenlignet med qPCR neutropenisk modeller af IA og caspofungin-behandlede wild-type eller eosinofil-mangelfuld mus med IA8. Resultaterne vis lighed med GMS kvantificering og qPCR svampe DNA. Dette tyder på, at GMS kvantificering kan være nyttigt at forskere involveret i histologiske analyser som en supplerende eller alternative metode til sammenligning af relative svampe byrde i mus med IA, og kan i sidste ende reducerer omkostningerne og anvendelse af forskning dyr i komplekse, Mekanistiske undersøgelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Center</td>
			<td>FGSC #A1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2155315</td>
			<td>White Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L11843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Dry Cabinet</td>
			<td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td>
			<td>HSFC160FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass Beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Model DME Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>13595XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td>
			<td>BioXCell</td>
			<td>BP0075-1</td>
			<td>Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>M3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pureline Oxygen Concentrator</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>OC8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slant Board Restraint</td>
			<td>Indiana State University Facilities Management</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z192406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9742754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B1000729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest&#160;Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td>
			<td>Labequip.com</td>
			<td>31930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>66630-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>116875H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT100A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC410530250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Provis AX70 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PHOTO Universal Photo System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PHOTO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-MCB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7740020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima C&#160;Plus&#160;Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-257-80</td>
			<td>Displacement- 6.1 cfm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A383-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO&#160;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&#160;DFS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9573988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-24</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0451999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482;&#160;ABsolute Blue qPCR Mixes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB4137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Probe, 5&#8242;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sense Amplification Primer, 5&#8242;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense Amplification Primer, 5&#8242;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#8482; MicroAmp&#8482; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>43-165-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Domed and Flat PCR Cap Strips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401443</td>
			<td>Stratagene is now owned by Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 (B6) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosinophil-deficient (&#916;dblGATA, BALB/c background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;&#948; T cell-deficient (TCR&#948;-/-, B6 background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spot Advanced Software</td>
			<td>Spot Imaging</td>
			<td>SPOT53A</td>
			<td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step 4.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

Kvantitativ bestemmelse af lungen svampe byrde er afgørende for fastlæggelsen af de relative niveauer af immun beskyttelse og svampe virulens i musemodeller af pulmonal svampeinfektion. Selv om flere metoder bruges til at vurdere svampe byrde, er kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) af svampe DNA opstået som en teknik med flere fordele i forhold til tidligere kultur-baserede metoder. I øjeblikket, nødvendiggør en omfattende vurdering af lunge patologi, leukocyt rekruttering, svampe byrde og genekspression i mus med invasiv aspergillose (IA) brugen af et betydeligt antal af eksperimentelle og kontroldyr. Her blev kvantificering af lunge histologiske farvning for at bestemme svampe byrde ved hjælp af et reduceret antal dyr undersøgt i detaljer. Lunge sektioner var farvet for at identificere svampe strukturer med Gomoris modificerede methanamine sølv (GMS) farvning. Billeder blev taget fra afsnittene GMS-farvede fra 4 diskrete felter for hver formalin-fast paraffin-embedded lunge. GMS farvede områder inden for hvert billede blev kvantificeres ved hjælp af et billede analyse program, og fra denne kvantificering, den gennemsnitlige procentdel af farvede område blev fastlagt for hver enkelt prøve. Bruger denne strategi, faldt eosinofil-mangelfuld mus udstillet svampe byrde og sygdom med caspofungin terapi, mens wild-type mus med IA ikke gjorde det bedre med caspofungin. Ligeledes svampe byrde i mus mangler γδ T celler blev også forbedret af caspofungin, målt ved qPCR og GMS kvantificering. GMS kvantificering er derfor indført som en metode til bestemmelse af relativ lunge svampe byrde, der i sidste ende kan reducere mængden af forsøgsdyr kræves for omfattende undersøgelser af invasiv aspergillose.

Figur 4 indeholder en graf for overlevelse af vildtype eller eosinofil-mangelfuld mus med IA behandlet med caspofungin. Resultaterne viser at eosinofil-mangelfuld mus udstillet øget overlevelse i forhold til wild-type mus (50% dødelighed kontra 100% dødelighed, henholdsvis). Figur 5 viser repræsentant GMS farvning fra neutropenisk vildtype og eosinofil-mangelfuld mus med IA behandlet eller ubehandlet med caspofungin. Caspofungin behandling resulterede i relative svampe clearance i eosinofil-mangelfuld, men ikke wild-type mus (højre paneler), mens begge grupper, som ikke modtog caspofungin blev lignende (venstre paneler). Figur 6 viser en sammenligning af svampe byrde i caspofungin-behandlet og styre ubehandlet wild-type eller eosinofil-mangelfuld mus, ved hjælp af begge qPCR svampe DNA (figur 6A) og repræsentant GMS kvantificering af 4 (10 X mål) felter) Figur 6B). De resultater, der genereres fra begge teknikker viser, at caspofungin behandlingsresultater i den mest betydningsfulde svampe byrde falde mellem wild-type og eosinofil-mangelfuld mus (figur 6A). Men i ubehandlede mus, kun GMS kvantificering resulterede i et betydeligt fald i mus mangler eosinofile (fig. 6B). Når den gennemsnitlige område af hele-lunge GMS-farvede dele blev beregnet (4 X mål), forskellene var svarende til de opnåede resultater med 4 repræsentant 10 X felter, dog med mindre Statistisk signifikans (figur 6 c). Figur 7 viser overlevelse, billeder af repræsentant GMS farvning (4 10 X felter) og kvantificering af svampe byrde af begge metoder i γδ T-celle-mangel (TCRδKO) mus, der blev behandlet med caspofungin i forhold til kontrol, ubehandlet mus. Caspofungin behandling forbedret overlevelse (figur 7A) og svampe byrde (figur 7B-D) i TCRδKO mus. Ligner resultaterne af figur 6, resultaterne af svampe byrde som målt ved qPCR (figur 7B) og repræsentant GMS kvantificering (figur 7C) var sammenlignelige.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> Figur 4: øget overlevelse i eosinofil-mangel (ΔdblGATA) mus med IA efter behandling med caspofungin. 15-30 mus/gruppe. Resumé af 3-6 eksperimenter. p < 0,0001. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> Figur 5: repræsentative billeder af GMS-farvede lunge sektioner fra vildtype, eosinofil mangelfuld og caspofungin-behandlet eller kontrol ubehandlet mus med IA. Repræsentant for 3-4 mus/gruppe. Skalalinjen svarer til 100 µm. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> Figur 6: svampe byrde i wild-type, eosinofil-mangelfuld mus med IA behandlet eller kontrol behandles med caspofungin. (A) qPCR svampe DNA. 15-30 mus/gruppeoversigten, 3-6 eksperimenter. (B) GMS kvantificering af histologiske sektioner, gennemsnitlig % af GMS farvning fra 4 felter (10 x mål). (C) GMS kvantificering, gennemsnitlig % af hele lunge afsnit (4 X mål). B og C er et resumé af 5 mus/gruppe. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Dette tal blev genereret ved hjælp af data, der blev rapporteret i en tidligere publikation8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> Figur 7: faldt sværhedsgraden af IA i γδ T-celle-mangelfuld mus efter caspofungin behandling. (A) overlevelse. (B) qPCR svampe DNA. (C) GMS kvantificering af histologi. (D) repræsentative billeder af GMS-farvede dele fra γδ T celler med IA, behandlet eller ubehandlet med caspofungin. A og B er et sammendrag af to eksperimenter med 7-10 mus/gruppe. C og D er et resumé af 4 mus/gruppe. p < 0,05. p < 0,01. p < 0,001. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Her beskriver vi en protokol for at fastslå pulmonal svampe byrde i mus med invasiv aspergillose ved kvantificeringen af Gomoris modificerede methanamine sølvfarvning i histologiske sektioner. Brug af denne metode resulterede i sammenlignelige resultater med mindre dyr i forhold til vurdering af svampe byrde af kvantitativ PCR lunge svampe DNA.

Histologiske kvantificering at bestemme lunge svampe byrde i eksperimentel aspergillose

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Påvisning af Invasiv pulmonal aspergillose hos maligne hæmatologiske lidelser patienter ved hjælp af lateral strømning og Teknologi

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Kvantificering af svampekolonisering, sporedannelse, og produktionen af ​​mycotoksiner brugen af ​​kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

En 3D Menneskelig Lung Tissue Model for Funktionelle Undersøgelser om<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektion

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging af antifungal aktivitet af humane primære neutrofiler og monocytter i Reaktion på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Intraperitoneal glukose Tolerance Test, måling af lungefunktion og fiksering af lungerne at studere virkningerne af fedme og hæmmet metabolisme på pulmonal resultater

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...