Name: histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקה על ידי של אינדיאנה אוניברסיטת בית הספר של רפואה מחקר שיפור גרנט, מאת 1R03AI122127-01-NIH-NIAID. נ. א נתמכה חלקית בתקופה זו על ידי קריירות ב מלגת אימונולוגיה של האגודה האמריקאית של Immunologists.

<ol>
	<li>Hohl, T. M., Feldmesser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus:+principles+of+pathogenesis+and+host+defense.">Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense.</a> Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus--what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen?.">Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).</li><li>Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+antifungal+pipeline:+selected+new+molecules+and+beyond.">An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).</li><li>Desoubeaux, G., Cray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Models+of+Invasive+Aspergillosis+due+to+Aspergillus+fumigatus:+Still+a+Long+Path+toward+Standardization.">Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization.</a> Front Microbiol. 8, 841 (2017).</li><li>Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+vertebrate+animal+models+of+fungal+infection.">Overview of vertebrate animal models of fungal infection.</a> J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).</li><li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis.">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li><li>Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+animal+models+of+invasive+aspergillosis.">The future of animal models of invasive aspergillosis.</a> Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).</li><li>Amarsaikhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspofungin+Increases+Fungal+Chitin+and+Eosinophil+and+gammadelta+T+Cell-Dependent+Pathology+in+Invasive+Aspergillosis.">Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis.</a> J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).</li><li>Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+germination+in+murine+airway+CD8++T-cell+responses+to+Aspergillus+conidia.">Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia.</a> PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).</li><li>Brunel, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Antifungal+Activity+by+Human+Primary+Neutrophils+and+Monocytes+in+Response+to+A.+fumigatus.">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Rao, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+technique+for+exposing+the+mouse+lung+to+particles+aspirated+from+the+pharynx.">Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx.</a> J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).</li><li>Bowman, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+assay+to+measure+Aspergillus+fumigatus+burden+in+a+murine+model+of+disseminated+aspergillosis:+demonstration+of+efficacy+of+caspofungin+acetate.">Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RacA+mediates+intracellular+reactive+oxygen+species+production,+polarized+growth,+and+virulence+in+the+human+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).</li><li>Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandins:+the+newest+class+of+antifungals.">Echinocandins: the newest class of antifungals.</a> Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).</li><li>Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+variation+in+18S+ribosomal+DNA+Copy+numbers+in+Aspergillus+fumigatus.">Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus.</a> J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).</li><li>Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+caspofungin+alone+and+in+combination+with+voriconazole+in+a+Guinea+pig+model+of+invasive+aspergillosis.">Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).</li><li>Petraitiene, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+efficacy+of+caspofungin+(MK-0991)+in+experimental+pulmonary+aspergillosis+in+persistently+neutropenic+rabbits:+pharmacokinetics,+drug+disposition,+and+relationship+to+galactomannan+antigenemia.">Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).</li><li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis.">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li><li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein.">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מטרת מאמר זה היה להציג את שיטת קביעת נטל פטרייתי ריאות אצל עכברים עם. חקירות פנים על-ידי ניצול ריאות שהוכתמו סקאוטרים היסטולוגית מקטעים עבור ניתוח תמונות ו כמת. במחקר זה, הטיפול עם התרופה נגד פטריות β-גלוקן-סינתזה-מיקוד קספופונגין14 לא לשפר הישרדות או פטרייתי נטל בעכברים פראי-סוג neutropenic עם חקירות פנים8. עם זאת, בהיעדר אאוזינופילים או γδ T תאים, הישרדות, נטל פטרייתי משופרת. תוצאות המחקר שלנו הוכיח גם כי ניתן להשיג תוצאות דומות על ידי סקאוטרים נטל פטרייתי לעומת שימוש נרחב פטרייתי DNA qPCR בשיטה6.
ישנם מספר יתרונות ניצול סקאוטרים נטל פטרייתי כמת. ראשית, התהליך עלול לנצל דגימות היסטולוגית הקיימים, ולכן פוטנציאל להפחית את מספר ניסויים נדרש כדי לקבוע הבדלים משמעותיים. שנית, במחקר זה, פחות חיות נדרשו על כימות נטל פטרייתי סקאוטרים להשגת הבדלים משמעותיים בהשוואה qPCR של ה-DNA פטרייתיים (איור 6, איור 7). שלישית, השוואה של הנטל פטרייתי ב מבודד שונה על-ידי qPCR עשוי להיות מושפע הבדלים תלויי-בידוד ribosomal DNA עותק מספר15. לעומת זאת, כימות סקאוטרים אינו מושפע לפי העתק מספר, כפי נטל פטרייתי נקבעת לפי רמות היחסי של צמיחה פטרייתי ריאות. לפיכך, השימוש סקאוטרים כימות נטל פטרייתי מפחית את השימוש של בעלי חוליות, לא דורשת קביעה מראש של rDNA עותק מספר. בסופו של דבר, בנוסף לשינויו מורפולוגיה פטרייתי, טיפול קספופונגין מגבירה את הפיצול פטרייתי, ובכך עשוי באופן מלאכותי להגדיל פטרייתי נטל על בידוד של המושבה יחידות ויוצרים מן הריאות homogenates12,16 ,17. לפיכך, כימות סקאוטרים של הנטל פטרייתי מונע מספר מגבלות הטבועות עם שיטות נפוצות אחרות.
עם זאת, המגבלות של כימות גרמים ו/או מחקר זה הן חשוב לציין. קודם, המחברים הנחת התפלגות דומות של צמיחה hyphal לאורך כל הריאות של כל קבוצה ניסיונית, ובכך משמש כימות מנציג 4 10 x שדות אובייקטיבית כמידה נציג הנטל פטרייתי ב הריאה כולה (איור 6B). זה אפשרי כי בחלק מהמקרים התפוצה היחסית, על הגודל ועל צפיפות של מוקדים hyphal מספיק חלוקים כך הנטל פטרייתי נראה שונה עם שיטה זו, המקבילה בשיטת qPCR. עם זאת, שלנו תוצאות נוספות עם כל הריאה סעיף כימות להשתמש בשדות אובייקטיבית 4 X הראה דומה, אם כי פחות הבדלים משמעותיים סטטיסטית, בין קבוצות (איור 6C). השגיאה הסטנדרטית של כימות זה היה גדל עם אסטרטגיה זו, ככל הנראה עקב ירידה ברזולוציה hyphal עם 4 X אובייקטיבית, רקע מוגברת בתחומים שיוצרת. לכן כימות נציג של פחות שדות בהגדלה גבוהה יותר היא המועדפת. שנית, רק קטע אחד, מרכזי, שימש עבור כל דגימה. זה אפשרי, על סמך את מבודד פטרייתי או זני עכברים משומש, כי מחקרים עלול לגרום הפצה אחידה של צמיחה hyphal. במקרים אלה, סעיפים נוספים ברחבי כל בלוק פראפין צריך ניתן לכמת כדי לקבל עול יותר ייצוגית. שלישית, בניסויים זה זירוז ייצור משמעותי של mucins (כלומר, לכימות דרכי הנשימה צמיחה פטרייתי bronchopulmonary אלרגית aspergillosis (ABPA)18 או סיסטיק פיברוזיס (CF)18), תגובתיות סקאוטרים עם רב-סוכר-עשיר mucins19 יכול להניב פירות שאינם ספציפיים סקאוטרים +, ובכך להטות דגימות לטובת נטל פטרייתי גבוה יותר. מאז רק הדגם neutropenic של חקירות פנים נעשה שימוש במחקר זה, זה אפשרי כי השימוש של דגמים חיסוניים אחרים המוסמכים או מדכאים יכול תוצאות בתוצאות פחות דומות. למרות אזהרות אלו, כימות סקאוטרים מספק שיטה דומה כדי לקבוע נטל פטרייתי, את המשך השימוש במחקרים נוספים עשויים עוד יותר לאמת את התועלת של שיטה זו כמו עקבי, אמינה וחסכונית.

IA הוא זיהום אופורטוניסטי שעשויות להתפתח אצל אנשים רגישים עם ליקויים החיסונית מולדות או נרכשות עקב טיפול מדכא מערכת החיסון או דלקת כרונית1,2. זיהום ראשי לעיתים קרובות מתהווה בריאות, למרות כמה מופעים הפצת אספרגילוס fumigatus הכבד, הכליות, הלב, והיא המוח עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך רקמה מקיף הפלישה hyphae מלווה על ידי מחלה קשה וגבוה שיעורי התמותה1,2. יתר על כן, היעילות של pharmacotherapies קיימת מוגבלת, עשוי להיות נחלש עוד יותר על ידי הופעתם של זני פטריות עמיד של הסביבה3. לכן חשוב להבין את המנגנונים של הפתולוגיה התקפה אלימה ומנחה פטרייתי לקדם פיתוח או החרפה של מחלה פטרייתית פולשנית.
מודלים מאתר נשארים חשוב ללימודים IA מכניסטית, בכך שהם מאפשרים לחוקרים להעריך את התפקידים של התקפה אלימה פטרייתי גנים ולארח effectors החיסון עבור הקמת צמיחה של4, ויוו א fumigatus5. כתוצאה מכך, יש אסטרטגיות מרובות ויוחאי ביעילות לכמת או להשוות נטל פטרייתי בקבוצות של חיות ניסוי6,7. אסטרטגיות אלו כרוכים מבוסס על תרבות, ביוכימי, מתכלה, או qPCR שיטות, כל אחת עם יתרונות וחסרונות. יתר על כן, כל השיטות האלה כרוכים ההקדשה של קבוצת משנה של בעלי חיים בנוסף לאלה מקריב. הערכות של תפקוד המערכת החיסונית אפקטור, ביטוי מפענוח השוואתי histopathology7. לכן, מחקרים מקיפים IA דורשים לעיתים קרובות במספרים משמעותיים של מחקר חיות בעלות משמעותית. אסטרטגיות אפקטיביות להפחית זמן הניסוי, עלויות בעלי חיים, שיקולים אתיים על ידי ניצול ברקמות בעלי חיים עבור ניתוחים מרובים ולכן הם יקרי7.
בדו ח זה, הוא הציג שיטה המתארת כימות של סקאוטרים מכתים בסעיפים היסטולוגית להשוואה של הנטל פטרייתי היחסי בין קבוצות הניסוי של עכברים עם. חקירות פנים. כל שלב מתרבות פטרייתי הזיהום, רקמות הקציר, עיבוד, ושל ייבוא תמונות ניתוח נתונים, מתואר בפירוט. הנטל פטרייתי התקבלו ע י כימות סקאוטרים הושוו עם qPCR neutropenic מודלים של IA, וכן מטופלים קספופונגין עכברים פראי-סוג או eosinophil לקויה עם חקירות פנים8. התוצאות מציגות דמיון עם סקאוטרים כמת, qPCR של ה-DNA פטרייתי. זה מרמז כי סקאוטרים כימות עשוי להיות שימושי כדי החוקרים העוסקים בניתוח היסטולוגית כשיטה משלימה או אלטרנטיבית של השוואה של הנטל היחסי פטרייתי בעכברים עם. חקירות פנים, בסופו של דבר עשוי להפחית את העלות ואת משימוש למחקר בבעלי הלימודים מורכבים, מכניסטית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Center</td>
			<td>FGSC #A1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2155315</td>
			<td>White Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L11843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Dry Cabinet</td>
			<td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td>
			<td>HSFC160FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass Beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Model DME Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>13595XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td>
			<td>BioXCell</td>
			<td>BP0075-1</td>
			<td>Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>M3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pureline Oxygen Concentrator</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>OC8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slant Board Restraint</td>
			<td>Indiana State University Facilities Management</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z192406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9742754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B1000729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest&#160;Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td>
			<td>Labequip.com</td>
			<td>31930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>66630-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>116875H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT100A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC410530250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Provis AX70 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PHOTO Universal Photo System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PHOTO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-MCB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7740020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima C&#160;Plus&#160;Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-257-80</td>
			<td>Displacement- 6.1 cfm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A383-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO&#160;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&#160;DFS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9573988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-24</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0451999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482;&#160;ABsolute Blue qPCR Mixes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB4137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Probe, 5&#8242;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sense Amplification Primer, 5&#8242;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense Amplification Primer, 5&#8242;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#8482; MicroAmp&#8482; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>43-165-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Domed and Flat PCR Cap Strips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401443</td>
			<td>Stratagene is now owned by Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 (B6) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosinophil-deficient (&#916;dblGATA, BALB/c background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;&#948; T cell-deficient (TCR&#948;-/-, B6 background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spot Advanced Software</td>
			<td>Spot Imaging</td>
			<td>SPOT53A</td>
			<td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step 4.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

כימות של ריאות פטרייתית הנטל הוא קריטי לקביעת רמות היחסי של מערכת החיסון הגנה, התקפה אלימה פטרייתי במודלים של העכבר של זיהום פטרייתי ריאתי. למרות שיטות מרובות משמשים כדי להעריך את הנטל פטרייתי, כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA פטרייתי התפתחה טכניקה עם כמה יתרונות על פני שיטות קודמות המבוסס על תרבות. כיום, אבחון מקיף של הריאה פתולוגיה, ליקוציט גיוס, נטל פטרייתי, ביטוי גנים בעכברים עם aspergillosis פולשנית (IA) מחייבת השימוש של מספר משמעותי של ניסיוני ובעלי שליטה. כאן כימות של הריאה היסטולוגית מכתים כדי לקבוע נטל פטרייתי באמצעות מספר מצומצם של בעלי חיים נבחנה בהרחבה. ריאות מקטעים היו מוכתם לזהות מבנים פטרייתי בכסף ששונה methanamine של Gomori (גרמים) מכתים. התמונות צולמו מהמקטעים שהוכתמו סקאוטרים משדות דיסקרטית 4 הריאות כל פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע. גרמים אזורים בתוך כל תמונה צבעונית היו לכמת באמצעות תוכנית ניתוח תמונה, של כימות הזה, האחוז הממוצע של האזור המוכתם נקבע עבור כל דגימה. באמצעות אסטרטגיה זו, עכברים eosinophil לקויה הציג ירד הנטל פטריות ומחלות בטיפול קספופונגין, בעוד פראי-סוג עכברים עם. חקירות פנים לא שיפר עם קספופונגין. באופן דומה, נטל פטרייתי בעכברים חסר γδ T תאים שופרו גם על ידי קספופונגין, כפי שהיא נמדדת qPCR, כימות גרמים. כימות סקאוטרים הוא הציג ולכן כשיטה מצפני העול פטרייתי ריאות היחסית בסופו של דבר עשוי להפחית את הכמות של חיות ניסוי הדרושים עבור מחקרים מקיפים של aspergillosis פולשנית.

איור 4 כולל גרף של הישרדות מסוג הפרוע או לקויה eosinophil עכברים עם. חקירות פנים שטופלו קספופונגין. התוצאות מציגות לקויה eosinophil עכברים הציג הישרדות מוגברת בהשוואה לפראי-סוג עכברים (50% תמותה לעומת התמותה 100%, בהתאמה). איור 5 מציג סקאוטרים נציג מכתים מ neutropenic פראי-סוג והן eosinophil לקויה עכברים עם. חקירות פנים מטופלים או מטופל עם קספופונגין. קספופונגין הטיפול הביא היחסי פטרייתי בטחוני בעוד eosinophil לקויה, אבל לא פראי-סוג עכברים (לוחות נכון), ואילו בשתי הקבוצות לא קיבלו קספופונגין היו דומים (לוחות שמאלה). איור 6 מציג ההשוואה של הנטל פטרייתי ב שטופלו קספופונגין ולשלוט שלא טופלו עכברים פראי-סוג או eosinophil לקויה, באמצעות שתי qPCR של DNA פטרייתיים (איור 6A), נציג סקאוטרים כימות של 4 (10 X המטרה) שדות ( איור 6B). התוצאות שהופקו מן בשתי הטכניקות מראים כי תוצאות הטיפול קספופונגין הנטל פטרייתי המשמעותי ביותר להקטין בין עכברים פראי-סוג של eosinophil לקויה (איור 6A). עם זאת, בעכברים אינו מטופל, כימות גרמים בלבד גרמו ירידה משמעותית עכברים שחסרו אאוזינופילים (איור 6B). כאשר חושבו האזור רשע סעיפים שהוכתמו סקאוטרים שלם-לונג (4 X המטרה), ההבדלים היו דומה התוצאות המתקבלות עם 4 נציג 10 X שדות, אבל עם פחות מובהקות סטטיסטית (איור 6C). איור 7 מראה הישרדות, תמונות של נציג סקאוטרים מכתימים (4 10 X שדות), כימות של הנטל פטרייתי על ידי שתי השיטות γδ חשוכת-תא T (TCRδKO) עכברים שטופלו קספופונגין לעומת שליטה, לא מטופל עכברים. קספופונגין הטיפול חל שיפור הישרדות (איור 7 א), נטל פטרייתיים (איור 7 ב-D) בעכברים TCRδKO. בדומה לתוצאות של איור 6, התוצאות של נטל פטרייתי כפי שהיא נמדדת qPCR, (איור 7 ב) ונציג סקאוטרים כמת (איור 7C) היו דומות.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> איור 4: גדל הישרדות בעכברים חשוכת-eosinophil (ΔdblGATA) עם. חקירות פנים לאחר הטיפול עם קספופונגין. 15-30 עכברים/קבוצה. סיכום של 3-6 ניסויים. p < 0.0001. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> איור 5: להחליפן בתמונות סעיפים ריאות שהוכתמו סקאוטרים פראי-סוג, eosinophil לקוי, ו שטופלו קספופונגין או שליטה לא מטופל עכברים עם חקירות פנים נציג של 3-4 עכברים/קבוצה. סרגל קנה מידה שווה 100 מיקרומטר. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> איור 6: נטל פטרייתי בפראי-סוג, עכברים eosinophil לקויה עם IA מטופלים או פקד שטופלו קספופונגין. QPCR (א) ה-DNA פטרייתי. 15-30 עכברים/קבוצה, סיכום של 3-6 ניסויים. (B) סקאוטרים כימות של מקטעים היסטולוגית, כלומר אחוז סקאוטרים מכתים משדות 4 (10 x המטרה). (ג) סקאוטרים כמת, % כלומר סעיף כל הריאה (4 X המטרה). B ו- C הם סיכום של עכברים 5/קבוצה. p < 0.05. p < 0.001. p < 0.0001. איור זה נוצר באמצעות נתונים דווחו על הפרסום הקודם8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> איור 7: ירידה בחומרת IA בעכברים לקויה תא T γδ לאחר הטיפול קספופונגין. (א) הישרדות. QPCR (B) של ה-DNA פטרייתי. (ג) סקאוטרים כימות של כימיקלים. (ד) להחליפן בתמונות סעיפים מוכתמים סקאוטרים מתאי γδ T עם. חקירות פנים, קספופונגין שטופלו או מטופל. A ו- B הם סיכום של שני ניסויים עם 7-10 עכברים/קבוצה. C ו- D הם סיכום של עכברים 4/קבוצה. p < 0.05. p < 0.01. p < 0.001. איור זה שונה מן הפרסום הקודם8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

כאן נתאר פרוטוקול כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאתי בעכברים עם aspergillosis פולשנית באמצעות כימות של כסף methanamine שונה של Gomori מכתים בסעיפים היסטולוגית. השימוש בשיטה זו הביאה תוצאות דומות עם פחות בעלי חיים לעומת הערכה של הנטל פטרייתי מאת PCR כמותי של ריאות פטרייתית דנ א.

כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

זיהוי של Aspergillosis ריאתי פולשני בחולים ממאירות Haematological באמצעות זרימת לרוחב, טכנולוגיה

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

דגם רקמות 3D ריאות אדם ללימודים פונקציונליים ב<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; זיהום

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

בדיקת עמידות הגלוקוז בקרום הבטן, מדידה של תפקודי ריאה של קיבעון של הריאה לחקור את ההשפעה של השמנת יתר, חילוף חומרים לקוי על תוצאות ריאתי

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...