Name: histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Это исследование было поддержано в части, Индиана университета школа из медицины исследований повышение Грант и низ-NIAID 1R03AI122127-01. В этот период н.а. частично поддерживается карьеру в области иммунологии стипендий от Американской ассоциации иммунологов.

<ol>
	<li>Hohl, T. M., Feldmesser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus:+principles+of+pathogenesis+and+host+defense.">Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense.</a> Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus--what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen?.">Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).</li><li>Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+into+the+antifungal+pipeline:+selected+new+molecules+and+beyond.">An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).</li><li>Desoubeaux, G., Cray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+Models+of+Invasive+Aspergillosis+due+to+Aspergillus+fumigatus:+Still+a+Long+Path+toward+Standardization.">Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization.</a> Front Microbiol. 8, 841 (2017).</li><li>Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+vertebrate+animal+models+of+fungal+infection.">Overview of vertebrate animal models of fungal infection.</a> J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).</li><li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis.">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li><li>Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+animal+models+of+invasive+aspergillosis.">The future of animal models of invasive aspergillosis.</a> Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).</li><li>Amarsaikhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspofungin+Increases+Fungal+Chitin+and+Eosinophil+and+gammadelta+T+Cell-Dependent+Pathology+in+Invasive+Aspergillosis.">Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis.</a> J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).</li><li>Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+germination+in+murine+airway+CD8++T-cell+responses+to+Aspergillus+conidia.">Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia.</a> PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).</li><li>Brunel, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Antifungal+Activity+by+Human+Primary+Neutrophils+and+Monocytes+in+Response+to+A.+fumigatus.">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li><li>Rao, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+technique+for+exposing+the+mouse+lung+to+particles+aspirated+from+the+pharynx.">Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx.</a> J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).</li><li>Bowman, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+assay+to+measure+Aspergillus+fumigatus+burden+in+a+murine+model+of+disseminated+aspergillosis:+demonstration+of+efficacy+of+caspofungin+acetate.">Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RacA+mediates+intracellular+reactive+oxygen+species+production,+polarized+growth,+and+virulence+in+the+human+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).</li><li>Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinocandins:+the+newest+class+of+antifungals.">Echinocandins: the newest class of antifungals.</a> Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).</li><li>Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+variation+in+18S+ribosomal+DNA+Copy+numbers+in+Aspergillus+fumigatus.">Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus.</a> J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).</li><li>Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+caspofungin+alone+and+in+combination+with+voriconazole+in+a+Guinea+pig+model+of+invasive+aspergillosis.">Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).</li><li>Petraitiene, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+efficacy+of+caspofungin+(MK-0991)+in+experimental+pulmonary+aspergillosis+in+persistently+neutropenic+rabbits:+pharmacokinetics,+drug+disposition,+and+relationship+to+galactomannan+antigenemia.">Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).</li><li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis.">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li><li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein.">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Целью этой статьи было внедрить метод для определения грибковых бремя легких у мышей с IA, используя GMS-окрашенных легких Гистологические срезы для анализа изображений и количественной оценки. В этом исследовании, лечение с β-глюканы синтез ориентация противогрибковый препарат caspofungin14 не улучшится выживания или грибковых бремя в мышах одичал тип нейтропенических с IA8. Однако в отсутствие эозинофилов или γδ T клетки, выживания и грибковых бремя улучшилась. Результаты нашего исследования также показали, что сопоставимые результаты могут быть получены путем GMS грибковых бременем по сравнению с широко используется грибковых ДНК ПЦР метод6.
Есть несколько преимуществ использования GMS грибковых бремя количественной оценки. Во-первых этот процесс может использовать существующие гистологические образцы, потенциально уменьшая количество экспериментов необходимо определить существенные различия. Во-вторых в этом исследовании, меньше животных необходимы для количественной оценки GMS грибковых бремя для достижения значительных различий по сравнению с ПЦР грибковых ДНК (рис. 6, рис. 7). В-третьих сравнение грибковых бремени в различные изолятах, ПЦР могут быть затронуты изолировать-зависит от различий в рибосомной ДНК копии номер15. В отличие от этого GMS количественной оценки не зависит от копии номер, как грибковые бремени определяется относительных уровней грибковые роста легких. Таким образом использование GMS количественной оценки для грибковых бремя уменьшает использование позвоночных животных и не требуется предварительное определение числа рДНК копии. Наконец в дополнение к изменению грибковых морфологии, caspofungin терапии увеличивает грибковых фрагментации и таким образом может искусственно увеличить грибковых бремя, когда измеряется изоляции колонии формирования подразделений из легких гомогенатах12,16 ,17. Таким образом GMS количественная оценка грибковых бремя избегает несколько ограничений, присущих с других часто используемых методов.
Однако важно отметить ограничения GMS количественной оценке и/или исследования. Во-первых авторы сопоставимых распределение гиф роста всей легких каждой экспериментальной группы и таким образом количественной оценки от 4 представителя 10 x объективных поля как представитель измерение для грибковых бремя на всей легких (Рисунок 6B). Вполне возможно, что в некоторых случаях относительное распределение, размер и плотность гиф очагов будет достаточно отличаются тем что грибковые бремя будет отличаться с этим методом и эквивалент методом ПЦР. Однако наши дополнительные результаты с квантификацией раздел весь легких с помощью объективных поля 4 X показали аналогичные, хотя и менее статистически значимых различий между группами (рис. 6 c). Стандартная ошибка этой количественной оценки было увеличено с этой стратегией, вероятно из-за снижение гиф резолюции с 4 X объективной и увеличение фон в неоптимальных областях. Таким образом представитель количественную оценку меньшее количество полей на увеличение является предпочтительным. Во-вторых только один центральный раздел был использован для каждого образца. Это возможно, основанный на грибковые изолятов или используется мышей штаммов, что некоторые исследования может привести к неравномерному распределению гиф роста. В тех случаях дополнительных разделов на протяжении каждого блока парафина следует количественно для получения более представительным бремя. В-третьих в экспериментах, которые вызывают значительное производство муцин (т.е., количественного определения сократимость микоз аллергическими заболеваниями бронхолегочной аспергиллеза (ABPA)18 или кистозный фиброз (CF)18), GMS реактивности с полисахарид богатые муцин19 может неспецифической GMS + результаты и таким образом отклонение некоторые образцы пользу выше грибковых бремя. Так как в этом исследовании была использована только модель нейтропенических IA, вполне возможно, что использование других иммунных компетентным или подавляющих моделей могла бы результаты в менее сопоставимые результаты. Несмотря на эти оговорки GMS количественной оценки обеспечивает сопоставимой методику для определения грибковых бремя, и его дальнейшее использование в дополнительных исследованиях далее может проверить полезность этого метода как последовательным, надежным и экономически эффективным.

IA-это оппортунистическая инфекция, которая может развиться в впечатлительных людей с врожденной или приобретенной иммунной недостатки благодаря иммунной супрессивной терапии или хронической инфекции1,2. Первичная инфекция часто происходит в легкй, хотя в некоторых случаях распространение Aspergillus fumigatus печень, почки, сердце, и может произойти мозга, приводит в обширных тканевых вторжения гифы, сопровождается тяжелой болезни и высокой показатели смертности1,2. Кроме того эффективность существующих фармакотерапия ограничено и может быть ослабило появление противогрибковые резистентных штаммов в окружающей среды3. Поэтому важно понять механизмы грибковых вирулентности и принимающих патологии, которые содействуют развитию или обострение инвазивных грибковых заболеваний.
Мышиных моделях остаются важными механистический IA исследований, поскольку они позволяют исследователям оценить роль генов вирулентности грибковых и принимающих иммунной эффекторов для создания и роста A. fumigatus, в естественных условиях4,5. Следовательно несколько стратегий были разработаны для того, чтобы эффективно количественно оценить или сравнить грибковых бремя в группы подопытных животных6,7. Эти стратегии предусматривают на основе культуры, биохимические, иммуноанализ, или методов ПЦР, каждый с свои преимущества и недостатки. Кроме того каждый из этих методов включают преданность подмножество животных помимо тех, кто пожертвовал для оценки иммунного эффекторные функции, анализ выражения гена, и сравнительные гистопатология7. Таким образом комплексные исследования IA часто требуют значительного числа исследований животных при существенных издержках. Таким образом, эффективные стратегии, уменьшающие экспериментальной время, животное затраты и этические соображения, используя животных тканей для несколько анализа являются чрезвычайно ценным7.
В настоящем докладе вводится метод описания квантификации GMS, пятнать в гистологических срезах для сравнения относительной грибковых бремени между экспериментальной группы мышей с ИА. Подробно описан каждый шаг от грибковые культуры к инфекции, ткани урожая и обработки и захвата изображений и анализа данных. Грибковые бремя, полученные GMS количественной оценки были сопоставлены с ПЦР в модели нейтропенических IA и в caspofungin лечение одичал типа или eosinophil недостаточным мышей с IA8. Результаты показывают сходство с GMS количественной и ПЦР грибковых ДНК. Это предполагает, что GMS количественной оценки может быть полезным для исследователей, занимающихся гистологические анализы как дополнительных или альтернативных метода сравнения относительной грибковых бремени в мышах с IA и в конечном итоге может уменьшить стоимость и использование животных исследования в комплекс, механистических исследования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution</td>
			<td>Fungal Genetics Stock Center</td>
			<td>FGSC #A1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyPure Cell Culture Grade Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2155315</td>
			<td>White Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L11843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Dry Cabinet</td>
			<td>Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD</td>
			<td>HSFC160FD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass Beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>11079105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Model DME Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>13595XXX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 27, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse-Ly-6G antibody</td>
			<td>BioXCell</td>
			<td>BP0075-1</td>
			<td>Clone 1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin diacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>1169567762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>M3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pureline Oxygen Concentrator</td>
			<td>Supera Anesthesia Innovations</td>
			<td>OC8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slant Board Restraint</td>
			<td>Indiana State University Facilities Management</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN Classic 200 ml Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F123601G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus)</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>0298-9373-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Broad-Tipped Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Standard Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol-200 Proof</td>
			<td>PHARMCO-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide&#160;syringe needles, gauge 25, L 1 in.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Z192406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-Plastic Norm-Ject Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9742754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>B1000729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest&#160;Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Jung Histocut 820 Microtome</td>
			<td>Labequip.com</td>
			<td>31930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>66630-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>116875H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver Stain (Modified GMS) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT100A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC410530250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Superslip Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-050-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Provis AX70 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-AX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PHOTO Universal Photo System</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PHOTO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-MCB-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-PS POWER SUPPLY UNIT</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OLYMPUS-U-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>7740020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima C&#160;Plus&#160;Vacuum Pump</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-257-80</td>
			<td>Displacement- 6.1 cfm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A383-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO&#160;PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML&#160;DFS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9573988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td># 02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-24</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>112011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0451999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform/isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-120-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#8482;&#160;ABsolute Blue qPCR Mixes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB4137A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Probe, 5&#8242;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sense Amplification Primer, 5&#8242;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisense Amplification Primer, 5&#8242;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&#8242;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#8482; MicroAmp&#8482; Optical 8-Tube Strip, 0.2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>43-165-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Domed and Flat PCR Cap Strips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB-0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3005P QPCR System, 110 Volt</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>401443</td>
			<td>Stratagene is now owned by Agilent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 (B6) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosinophil-deficient (&#916;dblGATA, BALB/c background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;&#948; T cell-deficient (TCR&#948;-/-, B6 background) mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>002120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spot Advanced Software</td>
			<td>Spot Imaging</td>
			<td>SPOT53A</td>
			<td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Step 4.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological quantification to determine lung fungal burden in experimental aspergillosis

Количественная оценка легких грибковых бремя имеет решающее значение для определения относительных уровней иммунной защиты и грибковых вирулентности в моделях мыши легочной грибковой инфекции. Хотя несколько методов используются для оценки грибковых бремя, количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, грибковых стала техника с несколько преимуществ по сравнению с предыдущими методами на основе культуры. В настоящее время всеобъемлющую оценку патологии легких, лейкоцитарные вербовки, грибковые бремя и экспрессии генов мышей с инвазивного аспергиллеза (IA) требует использования значительное число экспериментальных и контрольных животных. Здесь количественная оценка легких гистологические окрашивания для определения грибковых бремя, используя ограниченное количество животных был рассмотрен подробно. Легких разделы были витражи для выявления грибковых структур с Gomori модифицированных methanamine серебра (GMS) пятнать. Изображения были взяты из разделов GMS-витражи из 4 дискретные поля каждого формалин Исправлена парафин врезанных легких. GMS, окрашенных областей внутри каждого изображения были количественно с помощью программы анализа изображений, и от этой количественной оценки, средний процент окрашенных области было определено для каждого образца. Используя эту стратегию, eosinophil недостаточным мышей выставлены сократилось грибковых бремя и болезней с caspofungin терапией, а мышей дикого типа с IA не улучшится с caspofungin. Аналогично грибковых бремя у мышей, не хватает γδ T клетки также были улучшены, caspofungin, как измеряется ПЦР и GMS количественной оценки. Количественная оценка GMS поэтому вводится как метод для определения относительной легких грибковых бремя, которое в конечном счете может уменьшить количество экспериментальных животных, необходимых для комплексного исследования инвазивного аспергиллёза.

Рисунок 4 включает в себя график выживания дикого типа или eosinophil недостаточным мышей с IA относились с caspofungin. Результаты показывают, что eosinophil недостаточным мышей выставлены увеличение выживания, по сравнению с мышах одичал типа (50% смертности по сравнению с 100% смертности, соответственно). Рисунок 5 показывает представитель GMS окрашивания нейтропенических одичал тип и eosinophil недостаточным мышей с IA лечить или не лечить с caspofungin. Caspofungin лечение привело к относительной грибковых Распродажа в eosinophil недостаточным, но не одичал типа мыши (правой панели), во время обеих групп, которые не получили caspofungin были аналогичные (левой панели). Рисунок 6 показывает сравнение грибковых бремени в caspofungin лечение и контроль без лечения одичал типа или eosinophil недостаточным мышей, используя оба ПЦР грибковых ДНК (Рисунок 6A) и представитель GMS количественная оценка 4 (10 X цель) полей) Рисунок 6B). Результаты, полученные от обоих методов показывают, что результаты лечения caspofungin в наиболее значимых грибковых бремя уменьшаться между мышей дикого типа и eosinophil недостаточным (рис. 6A). Однако в необработанной мышей, только GMS количественной привело к значительным снижением мышей не хватает эозинофилов (Рисунок 6B). Когда средняя площадь всего легочными GMS-окрашенных участков были рассчитаны (4 X цель), отличия были похожи на результаты, полученные с 4 представителя 10 X поля, хотя и с меньше статистической значимости (рис. 6 c). Рисунок 7 показывает выживания, изображения представитель GMS окрашивание (4 10 X полей) и количественная оценка грибковых бремя обоими методами в γδ дефицит Т клеток (TCRδKO) мышей, которые лечились с caspofungin по сравнению с контролем, лечить мышей. Caspofungin лечение улучшение выживания (рис. 7A) и грибковые бремя (Рисунок 7B-D) в TCRδKO мышей. Аналогичные результаты на рисунке 6, результаты грибковых бремени как измеряется ПЦР (рис. 7B) и представитель GMS количественной (рис. 7 c) были сопоставимыми.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg"> Рисунок 4: увеличение выживания в eosinophil недостаточным (ΔdblGATA) мышах с IA после лечения с caspofungin. 15-30 мышей/группы. Краткое изложение экспериментов 3-6. p < 0,0001. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg"> Рисунок 5: представитель изображения участков GMS-окрашенных легких от дикого типа, eosinophil недостаточно и caspofungin лечение или управления лечить мышей с НМА Представитель группы по 3-4 мышей /. Линейку эквивалентна 100 мкм. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg"> Рисунок 6: грибковых бремя в одичал тип eosinophil недостаточным мышей с IA лечить или управления относились с caspofungin. (A) ПЦР грибковых ДНК. 15-30 мышей/группы, изложение экспериментов 3-6. (B) GMS количественная оценка гистологических срезах, средний % GMS окрашивания от 4 полей (10 x цель). (C) GMS количественной оценки, средний % всего легкого секции (4 X цель). Резюме 5 мышей/группы B и C. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Эта цифра была создана с использованием данных, которые были указаны в предыдущем издание8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg"> Рисунок 7: снижение тяжести IA γδ Т клеток недостаточным мышей после лечения caspofungin. Выживание (A). (B) ПЦР грибковых ДНК. (C) GMS количественная оценка гистологии. (D) представитель изображения GMS-окрашенных участков от γδ T клетки с IA, переработанных или непереработанных с caspofungin. A и B являются резюме двух экспериментов с 7-10 мышей/группой. Резюме 4 мышей/группы C и D. p < 0,05. p < 0.01. p < 0,001. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis at JoVE.com

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

Здесь мы описываем протокол для определения в мышей с инвазивного аспергиллёза легких грибковых бремя путем количественной оценки Gomori в модифицированных methanamine Серебряный пятнать в гистологических срезах. Использование этого метода приводило к сопоставимые результаты с меньше по сравнению с оценки грибковых бремени путем количественного PCR легких грибковых ДНК животных.

Гистологические количественная оценка для определения в экспериментальной аспергиллез легких грибковых бремя

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Обнаружение инвазивный легочный аспергиллез в гематологических больных злокачественных новообразований с помощью бокового потока технологии

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Количественная грибковой колонизации, спорогенеза, и производство микотоксинов Использование ядра Биопробы

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em&gt; Инфекция

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Культура макрофагальный колониестимулирующий фактор Дифференцированный человеческого моноцитов макрофаги

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Живая съемка противогрибковой активности на человеке первичных нейтрофилов и моноцитах в ответ на<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Тест на переносимость глюкозы внутрибрюшинного, измерение функции легких и фиксации легких, для изучения последствий ожирения и нарушением метаболизма на легочных исходов

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...