Name: three-dimensional inflammatory human tissue equivalents of gingiva
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para la investigación científica (26861689 y 17 K 11813). Los autores desean agradecer al Sr. Nathaniel Green por corrección.

Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)7. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados8. El consentimiento informado fue obt...

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	<li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease.">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li><li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation:+Role+of+the+Macrophage.">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+The+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).</li><li>Mescher, A. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells:+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells.">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li><li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line.">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li><li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents,+and+wound-healing+promotion,+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment.">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease.">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages.">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1 (2007).</li><li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinization+and+its+disorders.">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li><li>Klinge, B., Matsson, L., Attstr&#246;m, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study.">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li><li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease.">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li><li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+CD68,+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins.">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li><li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages.">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li><li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system.">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li><li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent.">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li></ol>

Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de l...

Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con las células locales (incluyendo las células epiteliales gingivales, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos) dando lugar a lesiones inflamatorias en el tejido periodontal3,4. Modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales, como ratas, hámsters, conejos, hurones, caninos y primates. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos de enfermedades periodontales5. Co cultivo de bacterias periodontales y células epiteliales orales humanos monocapa se ha utilizado para investigar el mecanismo de las infecciones periodontales6. Sin embargo, cultivos monocapa de células orales carecen de la arquitectura celular de tridimensional (3D) de tejido intacto; por lo tanto, no imitan la situación en vitro .
Aquí, equivalentes 3D tejido humano inflamatoria de la encía (iGTE) se establecen para representar enfermedades periodontales en vitro. Este modelo 3D de las enfermedades periodontales ocupa una posición intermedia entre los cultivos celulares monocapa y en modelos animales. Tres tipos de células humanas, incluyendo queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, se cultivan conjuntamente en gel de colágeno y estimulados por inflamatorias iniciadores para construir iGTE. IGTE simula de cerca las condiciones en vivo de diferenciación celular, interacción célula-célula y activación de los macrófagos en la encía. Este modelo tiene muchas aplicaciones posibles de drogas evaluación y análisis de nuevas aproximaciones farmacológicas en enfermedades periodontales, así como para analizar los mecanismos celulares y moleculares en la cicatrización de heridas, inflamación y regeneración de los tejidos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Collagen type I-A</td>
			<td>Nitta Gelatin Inc</td>
			<td></td>
			<td>For making dermis of GTE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-alpha</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11900073</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 &#956;m</td>
			<td>Corning, Inc.</td>
			<td>353096</td>
			<td>For tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31600034</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828028</td>
			<td>Cell culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue puncher</td>
			<td>Shibata system service co., LTD</td>
			<td>SP-703</td>
			<td>For punching holes in GTE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31800022</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3294</td>
			<td>For immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37605</td>
			<td>For labeling nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence mount medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td></td>
			<td>For mounting samples after immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab17139</td>
			<td>For identifying epithelium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaning electron microscope</td>
			<td>Hitachi, Ltd.</td>
			<td>HITACHI S-4000</td>
			<td>For observing samples&#39; surface topography and composition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscopy</td>
			<td>LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td>For observing samples&#39; immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin 19 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab52625</td>
			<td>For identifying epithelium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-vimentin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab92547</td>
			<td>For identifying fibroblasts and activated macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TE-7 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>CBL271</td>
			<td>For identifying fibroblasts in the dermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD68 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB2700244</td>
			<td>For identifying macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human CD14 Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB3832-SP</td>
			<td>For identifying macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11012</td>
			<td>For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11001</td>
			<td>For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Cell Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For observing the sample&#39;s immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cells</td>
			<td>Riken BRC cell bank</td>
			<td>RCB1189</td>
			<td>For making iGTE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>For differentiatting THP-1 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional inflammatory human tissue equivalents of gingiva

Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.

Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival...

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Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.

Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Aislamiento de Perivasculares Multipotentes poblaciones de células precursoras de Cardíaca Tejido humano

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Un nuevo uso de la ecografía tridimensional de alta frecuencia para la caracterización de embarazo temprano en el ratón

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...