Name: isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells at JoVE.com

Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board for klinisk forskning af Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B og 103-4223C). Denne undersøgelse blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 og NMRPG3C0151). Dette håndskrift blev redigeret af Wallace akademiske redigering.

Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board af Chang Gung Memorial Hospital. Alle deltagerne givet skriftlig informeret samtykke.
1. væv forberedelse
<ol><li>Høste de periosteal væv fra patienter under dental kirurgi (figur 1). Efter flap refleksion under lokalbedøvelse, tage et stykke periosteum væv fra alveoleknoglen ved hjælp af en periosteal separator31.</li>
	<li>Efter høst, skal du gemme perios...

En nyligt udviklede terapeutisk modalitet, nemlig tissue engineering medfører MSC'er, har mange fordele. MSC'er, der er til stede i flere vævstyper, er Multipotente celler, der kan differentiere til en lang række funktionelle mesodermale væv celler37 og andre celler såsom osteoblaster.
Periosteum fungerer som en niche for stamceller og som en rig Vaskulaturen levering til knoglen det indhyller38. I vores undersøgelse af 34 undersøgte prøv...

Selv om mange relevante teknikker er blevet udviklet i de seneste år, bone genopbygningen er stadig begrænset af flere begrænsninger, og estimering af omfanget af nødvendige genopbygning er ofte umuligt. Hårde væv brystforstørrelse er forpligtet til at opnå både æstetiske og funktionelle mål ud over en gunstig langsigtede succesrate. Metoder, der almindeligvis anvendes til sådanne procedurer omfatte autogen og allogen knoglegraft, xenografting og alloplastic knogle podning. Blandt de forskellige typer af knogletransplantation betragtes autogen bone podninger som den mest effektive. Donor site sygelighed, kompromitteret vaskularisering og begrænset væv tilgængelighed1 har dog været store ulemper for autogen knogle podning. Derudover har allogen bone podninger og xenografts været forbundet med smitteoverførsel. I øjeblikket, er syntetisk knogle vin almindeligt anvendt til at løse disse problemer. Men med deres manglende osteogenic potentiale, kliniske resultater har varieret meget. Materialer som cellulose er forbundet med volumen udsving, infektion, og en mangel på styrke.
Knogle augmentation bruger vævsmanipulering har genereret betydelig interesse. I denne teknik bruges mesenchymale stamceller (msc) i første omgang til at fremme osteoblastdannelse differentiering, som er derefter transplanteres til webstedet af knogletab at opnå knogle reparation. Denne procedure er i øjeblikket anvendes i celleterapi. At opnå knogle genopbygning ved at udtrække en begrænset mængde væv er enklere og mindre invasiv sammenlignet med andre metoder.
MSC'er potentielle rolle som et redskab til celle-baserede behandlinger rettet mod dental regenerering er en spirende interesse blandt forskellige forskergrupper. Undersøgelser har bekræftet, at MSC'er kan skelnes fra de følgende typer af væv: knoglemarven, fedt, synovial membran, pericyte, trabekulær knogle, menneskelige navlestreng og dental væv2,3. Almindelige kilder til MSCs omfatter knoglemarven, fedtvæv og dental væv. Sammenlignet med MSCs stammer fra fedtvæv og knoglemarv, er fordelene ved dental stamceller let tilgængelighed og mindre sygelighed efter høst. Sammenlignet med embryonale stamceller, MSCs stammer fra dental væv vises nonimmunogenic og er ikke forbundet med komplekse etiske bekymringer3.
I 2006, International Society for cellulære terapi anbefales ved hjælp af følgende standarder til at identificere MSCs: første MSC'er skal være i stand til at vedhæfte til plast. Andet skal MSC'er være positiv for de overflade antigener, CD105, CD73 og CD90 og negative for markører for monocytter, makrofager og B-celler ud over hæmatopoietisk antigener CD45 og CD344. Som endelige kriterium, MSC'er skal være i stand til at skelne i de følgende tre typer af celler under standardbetingelser for in vitro- differentiering: osteoblaster, adipocytter og chondrocytter4. Til dato har seks typer af menneskelige dental stamceller isoleret og karakteriseret. Den første type var isolerede fra menneskets pulp væv og betegnes postnatal dental pulp stamceller5. Efterfølgende tre yderligere former for dental MSCs er blevet isoleret og karakteriseret: stamceller fra ekspanderet løvfældende tænder6, parodontale ledbånd7og den apikale papilla8. Mere nylig, dental follikel-afledte9, gingival væv-afledte10, dental bud stilk cells(DBSCs)11, og periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 er også blevet identificeret.
Friedenstein var først til at definere MSCs13. MSC'er udviser en høj spredning potentielle og kan manipuleres til at differentiere før at blive transplanteret, hvilket tyder på, at de er ideelle kandidater til regenerativ procedurer10.
Selv om de fleste studier har anvendt knoglemarv som en kilde til stamceller, periost-afledte celler (PDC'er) har også været brugt for nylig14. Periosteum er mere let tilgængelige end knoglemarven. Derfor i denne teknik bruger vi alveolær periosteum at eliminere behovet for yderligere indsnit under operation og reducere postsurgical sygelighed hos patienter. Periosteum er det bindevæv, der danner den ydre foring af lange knogler og består af to adskilte lag: den yderste fibrøse lag bestående af fibroblaster, kollagen og elastiske fibre15, og den indre celle-rige cambium lag i direkte kontakt med knoglen overfladen. Cambium lag indeholder en blandet celle population, primært fibroblaster16, osteoblaster17, pericytes18, og en kritisk delpopulation identificeret som MSCs19,20,21. De fleste undersøgelser har rapporteret at fremdaterede er sammenlignelige, hvis ikke overlegent, knoglemarv-afledte stamceller (bMSCs) i knogle heling og regenerering22,23,24. Periosteum er lettilgængeligt og udstiller fremragende regenerativ effektivitet. Men, nogle undersøgelser har fokuseret på periosteum25,26,27.
Med hensyn til knogle reparation involverer den aktuelle kliniske praksis transplantation af periosteal stamceller forstærkes inden for støttende stilladser. Nylige undersøgelser har fokuseret på erhverve stamceller i defekt regioner og beskæftiger stamceller til væv revitalisering20. Tandlæger også forudse fremtidige anvendelse af parodontale knogle regenerering i parodontale behandlinger og tandimplantater. Om webstedet donor periosteum kan nemt høstet af generelle dental surgeons. Det sammenligner positivt mod marv stromale celler, som periosteum kan tilgås under rutinemæssige oral kirurgi. Formålet med denne undersøgelse er således, at etablere en protokol for høst fremdaterede og vurdere morfologi, vedhæftet fil, levedygtighed og spredning af menneskelige periosteum stamceller.
D-vitamin metabolitter påvirker i vivo knogler-mineral dynamisk ligevægt. En undersøgelse rapporteret, at den 24R,25-(OH)2D3 aktive form af D-Vitamin er afgørende for osteoblastic differentiering af menneskelige MSCs (hMSCs)28. Knogle homøostase og reparation er reguleret af et netværk af Vitamin D3 metabolitter, af hvilke 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) er de mest biologisk aktive og relevante i reguleringen af knogle sundhed. Vitamin D3 er afgørende for forkalkning29. I en undersøgelse ved hjælp af 2-d-gamle Kunming hvide mus, angivet de embryoid organer i mus, at C-Vitamin og D-Vitamin kosttilskud effektivt fremmes differentiering af ESC-afledte osteoblaster30. Blandt dens andre biologiske aktiviteter stimulerer 1,25-(OH)2D3 in vitro- differentiering af hMSCs til osteoblaster, som kan overvåges baseret på stigningen i alkalisk fosfatase (ALP) enzymaktivitet eller OCN gen udtryk.
Nogle undersøgelser har påvist en dosis-respons-forhold af kombinerede behandlinger med C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 i menneskelige fremdaterede med særlig fokus på knogle vævsmanipulering. Derfor, i denne undersøgelse undersøger vi de optimale koncentrationer til enkelt eller kombinerede behandling af 1,25-(OH)2D3 og C-Vitamin for at fremkalde osteogenic differentiering af menneskelige fremdaterede. Målet med denne protokol er at afgøre, om en celle population isoleret fra dental alveolær periosteum indeholder celler med en MSC fænotype og om disse celler kan udvides i kultur (in vitro-) og differentieret til at danne det ønskede væv . Derudover vurderer vi fremdaterede evne til at differentiere i osteocytes, chondrocytter og adipocytter. Den anden del af undersøgelsen evaluerer virkningerne af C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 på fremdaterede osteogenic aktivitet. Det primære formål med denne undersøgelse er at vurdere funktioner af C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 under fremdaterede osteoblastic differentiering af ALP aktivitet, og pro-osteogenic gener, såsom ALP, kollagen-1, OCN, BSP og CBFA1. Desuden, bestemmer denne undersøgelse de optimale osteoinduktive betingelserne for menneskelige fremdaterede baseret på disse resultater.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#160; well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs01029144_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avian myeloblastosis virus reverse transcriptase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109118001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146</td>
			<td>BD</td>
			<td>561013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>BD</td>
			<td>560942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44</td>
			<td>BD</td>
			<td>561858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>561088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73</td>
			<td>BD</td>
			<td>561014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90</td>
			<td>BD</td>
			<td>561974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell banker1</td>
			<td>ZEAOAQ</td>
			<td>11888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>core binding factor alpha-1</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs00231692_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>562008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin&#8211;transferrin&#8211;selenium-A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td>
			<td>Life</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film</td>
			<td>Life</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30265.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STRO-1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green PCR Master Mix</td>
			<td>AppliedBiosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Master Mix</td>
			<td>Life</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transforming growth factor-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7039&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent (for RNA isolation)</td>
			<td>Life</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">collagen-1</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OCN</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39;-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">BSP</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial ALP primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CBFA1 primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells

Mesenchymale stamceller (msc) er til stede i en række forskellige væv og kan opdeles i mange celletyper, herunder osteoblaster. Blandt de dental kilder af MSC'er er periosteum et let tilgængeligt væv, som er blevet identificeret til at indeholde MSCs i cambium lag. Dog, denne kilde har endnu ikke været udbredt undersøgt.
Vitamin D3 og 1,25-(OH)2D3 har påvist for at stimulere in vitro- differentiering af MSCs i osteoblaster. Desuden fremmer C-vitamin kollagen dannelse og knogle cellevækst. Ingen undersøgelse har dog endnu undersøgt effekten af Vitamin D3 og C-Vitamin på MSCs.
Vi præsenterer her, en metode til at isolere MSCs fra menneskelige alveolær periosteum og undersøge den hypotese, at 1,25-(OH)2D3 kan udøve en osteoinduktive virkning på disse celler. Vi også undersøge tilstedeværelsen af MSC'er i den menneskelige alveolær periosteum og vurdere stamcelle vedhæftning og spredning. For at vurdere nøgle muligheden for C-vitamin (som kontrol) og forskellige koncentrationer af 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M) til at ændre mRNA biomarkører i isolerede MSCs mRNA udtryk af alkalisk fosfatase (ALP), knogle sialoprotein (BSP), core bindende faktor alfa-1 (CBFA1), kollagen-1 og osteocalcin (OCN) måles ved hjælp af real-time Polymerasekædereaktionen (RT-PCR).

Til alle kvantitative analyser, er data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student's t-test. I alt 34 prøver blev opnået med en deltager gennemsnitsalderen af 48,1 ± 12,3 y. elleve af disse prøver var fremstillet af mandlige patienter og 23 fra kvindelige patienter. Tyve-otte prøver blev indhentet fra de molære regioner og seks fra den forreste periferi; 26 blev fremstillet af maxilla og 8 fra underkæ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells at JoVE.com

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler

Vi præsenterer en protokol for at undersøge mRNA udtryk biomarkører periosteum-afledte celler (fremdaterede) foranlediget af vitamin C (C-vitamin) og 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. Derudover vurderer vi fremdaterede evne til at differentiere i osteocytes, chondrocytter og adipocytter.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Hurtig Isolering af levedygtige cirkulerende tumorceller fra Patient Blodprøver

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimering Binding af humane mesenchymstamceller på Poly (ε-caprolacton) elektrospundne Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Optagelsen af nye Lipid-belagt nanopartikler som indeholder Falcarindiol af humane mesenkymale stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Konstruktion og brug af en elektrisk Stimulation kammer for at øge Osteogenic differentiering i mesenkymale stamceller/stromale celler In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afledte humane manipuleret bindevæv til screeningsapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Isolering, ekspansion og differentiering af mesenkymale stamceller fra den infrapatellære fedtpude i gedekvæleleddet

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering af humane blodkarorganoider fra pluripotente stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...