Name: isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells at JoVE.com

Studien protokollen ble godkjent av institusjonelle Review Board for klinisk forskning av Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B og 103-4223C). Denne studien ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 og NMRPG3C0151). Dette manuskriptet ble redigert av Wallace akademiske redigering.

Studien protokollen ble godkjent av de institusjonelle gjennomgang styret av Chang Gung Memorial Hospital. Alle deltakerne gitt skriftlig samtykke.
1. vev forberedelse
<ol><li>Høste periostal vev fra pasienter under tannkirurgi (figur 1). Etter klaff refleksjon under lokalbedøvelse, ta et stykke periosteum vev fra alveolar benet ved hjelp av en periostal skilletegn31.</li>
	<li>Etter høsting, lagre periostal vev skiver ca 5 mm × 2 mm ...

Et nylig utviklet terapeutisk modalitet, nemlig tissue engineering innebærer MSCs, har mange fordeler. MSCs, som finnes i forskjellige vev, er multipotent celler som kan skille ut en rekke funksjonelle mesodermal vev celler37 og andre celler som osteoblasts.
Periosteum fungerer som en nisje for stamfar celler og som en rik blodkar forsyning for benet det omslutter38. I vår studie av 34 undersøkte prøvene, gitt 20 er MSC koloniene, med en vell...

Selv om mange relevante teknikker har blitt utviklet i de senere årene, bein gjenoppbygging er fortsatt begrenset av flere begrensninger, og beregne omfanget av nødvendig gjenoppbygging er ofte umulig. Hard-vev augmentation er nødvendig for å oppnå både estetiske og funksjonelle mål i tillegg til en gunstig langsiktige suksessrate. Metoder brukt for Slike prosedyrer er gjestfrihet og allogenic Bentransplantering, xenografting og alloplastic Bentransplantering. Blant de ulike typene bein pode, gjestfrihet bone lærhud og fett er betraktet som den mest effektive. Donor-område sykelighet, kompromittert vascularity og begrenset vev tilgjengelighet1 har imidlertid vært store ulemper for gjestfrihet Bentransplantering. I tillegg har allogenic bone lærhud og fett og xenografts vært knyttet til sykdommer overføring. Foreløpig er syntetiske bone lærhud og fett mye brukt til å løse disse problemene. Men med deres mangel på osteogenic potensial, har kliniske utfall variert mye. Materialer som cellulose er tilknyttet svingninger i søkevolum, infeksjoner og mangel på styrke.
Bein augmentation bruker tissue engineering har generert betydelig interesse. I denne teknikken, er stamceller (MSCs) opprinnelig brukt til å fremme osteoblast differensiering, som er deretter transplanted til området av bentap å oppnå bein reparasjon. Denne fremgangsmåten brukes i cellen terapi. Oppnå bein rekonstruksjon trekker ut en begrenset mengde vev er enklere og mindre invasiv sammenlignet med andre metoder.
MSCs potensielle rolle som et verktøy for cellen-basert behandling rettet mot dental gjenfødelse er en voksende interesse blant forskjellige forskningsgrupper. Studier har bekreftet at MSCs kan være differensiert fra følgende typer vev: benmargen, adipose, synovial membran, pericyte, trabekulært bein, menneskelige navlestreng og dental vev2,3. Vanlige kilder til MSCs omfatter benmargen og fettvev dental vev. Sammenlignet med MSCs avledet fra fettvev og benmarg, er fordelene med dental stamceller lett tilgjengelighet og mindre sykelighet etter høsting. Sammenlignet med embryonale stamceller, MSCs avledet fra dental vev vises nonimmunogenic og er ikke assosiert med komplekse Etiske bekymringene3.
I 2006, anbefales det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi bruker følgende standarder for å identifisere MSCs: først MSCs må være i stand til å feste til plast. Andre må MSCs være positivt for overflate antigener CD105, CD73 og CD90 og negative for markører for monocytter, makrofager og B-cellene i tillegg til blodkreft antigener CD45 og CD344. Som et siste kriterium, MSCs må være i stand til å skille ut følgende tre typer celler under standard betingelser for i vitro differensiering: osteoblasts, adipocytter og chondrocytes4. Hittil har seks typer menneskelig dental stamceller isolert og preget. Den første typen ble isolert fra menneskelige masse vev og betegnet postnatal tannlegekontoret masse stamceller5. Deretter tre flere typer dental MSCs er isolert og preget: stamceller fra skrubbet løvfellende tenner6, periodontal ligament7og den apikale papilla8. Flere nylig, dental hårsekken-avledet9, gingival vev-avledet10, dental bud stammen cells(DBSCs)11og periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 har også blitt identifisert.
Friedenstein var først til å definere MSCs13. MSCs viser en høy spredning potensielle og kan manipuleres for å skille før blir transplantert, noe som antyder at de er velegnet for regenerativ prosedyrer10.
Selv om de fleste studier har brukt benmarg som en kilde til stamceller, periosteum-avledet celler (PDC) har også vært brukt nylig14. Periosteum er lettere tilgjengelig enn benmargen. Derfor i denne teknikken bruker vi alveolar periosteum å eliminere behovet for ytterligere snitt under kirurgi og redusere postsurgical sykelighet i pasienter. Periosteum er connective vev som danner ytre foring av lange ben og består av to forskjellige lag: det ytterste fibrøse laget består av fibroblaster kollagen og elastisk fiber15og indre celle-rike cambium laget i direkte kontakt med bein overflaten. Cambium laget inneholder en mikset-celle befolkningen, hovedsakelig fibroblaster16, osteoblasts17, pericytes18og en kritisk subpopulasjon identifisert som MSCs19,20,21. De fleste studier har rapportert at PDC er sammenlignbare, om ikke bedre, Ben margtransplantasjon-avledet stilk celler (bMSCs) i bein healing og regeneration22,23,24. Periosteum er lett tilgjengelig og utstillinger utmerket regenerativ effektivitet. Imidlertid har få studier fokusert på de periosteum25,26,27.
Om bein reparasjon innebærer dagens klinisk praksis transplantasjon av periostal progenitor celler forsterket i støttende stillaser. Nyere studier har fokusert på å anskaffe stamceller i defekt regioner og sysselsetter progenitor celler for vev gjenfødelse20. Tannleger også forutse fremtidige anvendelse av periodontal bein gjenfødelse periodontal behandlinger og tannimplantater. Om donor området, periosteum kan enkelt høstes av generelle dental kirurger. Dette sammenligner gunstig mot margtransplantasjon stromal celler, som periosteum kan nås i løpet av praksis oral kirurgi. Dermed er målet med denne studien å etablere en protokoll for høsting PDC og å vurdere morfologi, vedlegg, levedyktighet, og spredning av menneskelig periosteum stamceller.
Vitamin D metabolitter påvirker i vivo bein-mineral dynamisk likevekt. En studie rapportert at 24R,25-(OH)2D3 aktiv form av Vitamin D er avgjørende for osteoblastic differensiering av menneskelig MSCs (hMSCs)-28. Bein homeostase og reparasjon er regulert av et nettverk av Vitamin D3 metabolitter, hvilke 1,25-(OH)2D3 (kalsitriol) er den mest biologisk aktive og relevant i regulering av beinhelse. Vitamin D3 er avgjørende for forkalkninger29. I en studie bruker 2-d-gamle Kunming hvite mus, indikerte embryoid organer i mus at Vitamin C og Vitamin D kosttilskudd effektivt fremmet differensiering av ESC-avledet osteoblasts30. Blant de andre biologiske aktivitetene stimulerer 1,25-(OH)2D3 i vitro differensiering av hMSCs til osteoblasts, som kan overvåkes basert på økningen i alkalisk fosfatase (ALP) enzym aktivitet eller OCN genet uttrykk.
Noen studier har oppdaget en dose-respons-forhold av kombinert med Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 i human PDC med særlig fokus på bein vev engineering. Derfor i denne studien undersøke vi optimal konsentrasjonen for enkel eller kombinert behandling 1,25-(OH)2D3 og Vitamin C for å indusere osteogenic differensiering av menneskelig PDC. Målet med denne protokollen er å avgjøre om en celle befolkningen isolert fra den dental alveolar periosteum inneholder celler med en MSC fenotypen og om disse cellene kan utvides kultur (i vitro) og differensiert for å danne ønskede vevet . I tillegg vil vi sjekke bostedets PDC evnen til å differensiere i osteocytes, chondrocytes og adipocytter. Den andre delen av studien evaluerer effekten av Vitamin C og 10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 på osteogenic aktiviteten til PDC. Det primære målet med denne studien er å vurdere funksjonene av Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 under osteoblastic differensiering av PDC ved ALP aktivitet og pro-osteogenic gener, som ALP, kollagen-1, OCN, BSP og CBFA1. Dessuten, bestemmer denne studien optimale osteoinductive for menneskelig PDC basert på disse resultatene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#160; well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs01029144_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avian myeloblastosis virus reverse transcriptase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109118001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146</td>
			<td>BD</td>
			<td>561013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>BD</td>
			<td>560942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44</td>
			<td>BD</td>
			<td>561858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>561088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73</td>
			<td>BD</td>
			<td>561014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90</td>
			<td>BD</td>
			<td>561974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell banker1</td>
			<td>ZEAOAQ</td>
			<td>11888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>core binding factor alpha-1</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs00231692_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>562008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin&#8211;transferrin&#8211;selenium-A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td>
			<td>Life</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film</td>
			<td>Life</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30265.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STRO-1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green PCR Master Mix</td>
			<td>AppliedBiosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Master Mix</td>
			<td>Life</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transforming growth factor-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7039&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent (for RNA isolation)</td>
			<td>Life</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">collagen-1</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OCN</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39;-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">BSP</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial ALP primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CBFA1 primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells

Stamceller (MSCs) finnes i en rekke vev og kan differensieres ut flere celletyper, inkludert osteoblasts. Dental kildene til MSCs er periosteum en lett tilgjengelig vev, som er funnet for å inneholde MSCs i cambium laget. Men har denne kilden ikke ennå blitt mye studert.
Vitamin D3 og 1,25-(OH)2D3 har vist seg for å stimulere i vitro differensiering av MSCs i osteoblasts. I tillegg forenkler vitamin C kollagen dannelse og bein cellevekst. Men har ingen studie likevel undersøkt effekten av Vitamin D3 og Vitamin C på MSCs.
Her presenterer vi en metode for å isolere MSCs fra menneskelige alveolar periosteum og undersøke hypotesen at 1,25-(OH)2D3 kan utøve en osteoinductive effekt på disse cellene. Vi undersøke tilstedeværelsen av MSCs i den menneskelige alveolar periosteum og vurdere stamcelleforskningen vedheft og spredning. Å vurdere muligheten av vitamin C (som en kontroll) og ulike konsentrasjoner av 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M) for å endre nøkkelen mRNA biomarkers i isolert MSCs mRNA uttrykk for alkalisk fosfatase (ALP), Ben sialoprotein (BSP), core bindende faktor alfa-1 (CBFA1), kollagen-1 og osteocalcin (OCN) måles ved hjelp av sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-PCR).

For alle kvantitativt analyser presenteres dataene som gjennomsnittlig ± standardavviket (SD). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student t-test. Totalt 34 prøver ble oppnådd med en deltaker gjennomsnittsalder på 48,1 ± 12.3 y. elleve av disse prøvene var oppnådd fra mannlige pasienter og 23 fra kvinnelige pasienter. Tjueåtte eksempler Hentet fra molar regioner og fra de fremre regionene. 26 var Hentet fra maxilla og 8 fra mandible. Mener varigheten mellom...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells at JoVE.com

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Isolering av Mesenchymal stamceller fra menneskelige Alveolar Periosteum og effekter av Vitamin D på Osteogenic aktivitet i Periosteum-avledet celler

Vi presenterer en protokoll for å undersøke mRNA uttrykk biomarkers periosteum-avledet celler (PDC) av vitamin C (vitamin C) og 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. I tillegg vil vi sjekke bostedets PDC evnen til å differensiere i osteocytes, chondrocytes og adipocytter.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Rask Isolering av Levedyktige sirkulerende tumorceller fra pasient Blodprøver

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÃƒÅ½Ã‚Âµ-caprolactone Electrospun Yarns

Optimalisere Vedlegg of Human stamceller på Poly (ε-kaprolakton) elektrospunnede Garn

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Opptak av nye Lipid-belagt nanopartikler som inneholder Falcarindiol av menneskelige stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Bygging og bruk av en elektrisk stimulering kammer for å styrke Osteogenic differensiering i Mesenchymal Stem/Stromal celler i Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast avledet menneskekonstruert bindevev for screeningapplikasjoner

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Isolering, utvidelse og differensiering av mesenkymale stamceller fra Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generering av humane blodkarorganoider fra pluripotente stamceller

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...