Name: isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00
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El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional para investigación de Chang Gung Memorial Hospital Clínico (IRB99-1828B, C 100-3019, 99-3814B, C 102-1619, 101-4728B y C 103-4223). Este estudio fue apoyado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 y NMRPG3C0151). Este manuscrito fue editado por Wallace de edición académica.

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de Chang Gung Memorial Hospital. Todos los participantes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
1. preparación de tejido
<ol><li>Cosechan los tejidos periósticos de pacientes durante una cirugía dental (figura 1). Después de la reflexión de la aleta bajo anestesia local, tome un pedazo de tejido del periostio del hueso alveolar utilizando un separador perióstico de<sup class="...

Una modalidad terapéutica desarrollada recientemente, es decir, recreando el tejido del que implique MSCs, tiene numerosas ventajas. MSCs, que están presentes en varios tipos de tejidos, son células pluripotentes que pueden diferenciarse en una variedad de células de tejidos mesodérmicos funcionales37 y otras células como los osteoblastos.
El periostio sirve como un nicho para las células del progenitor y como una fuente de rica vasculatura para el hueso envuelve...

Aunque se han desarrollado numerosas técnicas relevantes en los últimos años, los huesos restos de reconstrucción limitada por restricciones múltiples y estimar que el grado de reconstrucción necesaria es a menudo imposible. Aumento de tejido duro es necesaria para alcanzar objetivos estéticos y funcionales además de una tasa de éxito a largo plazo favorable. Métodos comúnmente utilizados para estos procedimientos incluyen injerto óseo autógeno y alógeno, xenografting y el injerto de hueso de alloplastic. Entre los distintos tipos de injerto óseo, injertos de hueso autógeno se consideran los más efectivos. Sin embargo, morbosidad del sitio donante, vascularización comprometida y de la disponibilidad limitada de tejido1 han sido grandes inconvenientes para el injerto de hueso autógeno. Además, injertos óseos alógenos y xenoinjertos se han asociado con la transmisión de la enfermedad. En la actualidad, injertos óseos sintéticos son ampliamente utilizados para resolver estos problemas. Sin embargo, con su falta de potencial osteogénico, los resultados clínicos han variado ampliamente. Materiales como la celulosa están asociados con fluctuaciones de volumen, infección y la falta de fuerza.
Aumento óseo mediante ingeniería de tejidos ha generado considerable interés. En esta técnica, las células madre mesenquimales (MSCs) se utilizan inicialmente para promover la diferenciación de osteoblastos, que luego se trasplantan al sitio de la pérdida ósea para lograr la reparación del hueso. Este procedimiento se aplica actualmente en terapia celular. Lograr la reconstrucción del hueso mediante la extracción de una cantidad limitada de tejido es más simple y menos invasivo en comparación con otros métodos.
El papel potencial de MSCs como una herramienta para las terapias basadas en células para regeneración dental es un emergente interés entre varios grupos de investigación. Estudios han confirmado que MSCs pueden ser distinguidos de los siguientes tipos de tejidos: médula ósea, membrana sinovial adiposa, pericyte, hueso trabecular, cordón umbilical humano y tejidos dentales2,3. Fuentes comunes de MSCs incluyen médula ósea, tejido adiposo y los tejidos dentarios. En comparación con MSCs derivadas de tejido adiposo y la médula ósea, las ventajas de células madre dentales son de fácil accesibilidad y menor morbilidad después de la cosecha. En comparación con las células madre embrionarias, MSCs derivados de tejido dental aparecen nonimmunogenic y no se asocian a problemas éticos complejos3.
En 2006, la sociedad internacional de terapia celular recomendado utilizando los siguientes estándares para identificar MSCs: en primer lugar, MSCs deben ser capaces de unir al plástico. En segundo lugar, MSCs deben ser positivas para los antígenos de superficie de CD105 y CD73, CD90 y negativa para los marcadores de monocitos, macrófagos y células B además de las hematopoyéticos antígenos CD45 y CD344. Como criterio final, MSCs deben ser capaces de distinguir en los siguientes tres tipos de células en condiciones normales de diferenciación en vitro : osteoblastos, adipocitos y condrocitos4. Hasta la fecha, seis tipos de células madre dentales humanas han sido aislados y caracterizados. El primer tipo fue aislado de tejido pulpar humano y había denominado células madre de pulpa dental postnatal5. Posteriormente, se han aislado y caracterizado tres tipos adicionales de MSCs dentales: células madre de dientes de hojas caducas exfoliada6, el ligamento periodontal7y la papila apical8. Más recientemente, deriva del folículo dental9, derivados del tejido gingival10, brote dental madre cells(DBSCs)11y quiste periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 se también han identificado.
Friedenstein fue el primero en definir MSCs13. MSCs presentan una alto potencial de proliferación y pueden manipularse para diferenciar antes de ser trasplantado, lo cual sugiere que son candidatos ideales para procedimientos regenerativos10.
Aunque la mayoría de los estudios ha utilizado la médula ósea como fuente de células madre, células derivadas del periostio (PDC) también han sido utilizados recientemente14. El periostio es más fácilmente accesible que es la médula ósea. Por lo tanto, en esta técnica, utilizamos periostio alveolar para eliminar la necesidad de incisiones adicionales durante la cirugía y para reducir la morbilidad postquirúrgica en los pacientes. El periostio es el tejido conectivo que forma el revestimiento exterior de los huesos largos y se compone de dos capas distintas: la capa fibrosa externa compuesta de fibroblastos, colágeno y fibras elásticas15y la capa interior de t-célula-rico de cambium en contacto directo con la superficie del hueso. La capa de cámbium contiene una población de células mixta, principalmente fibroblastos16, osteoblastos17, del pericitos18y una subpoblación crítico identificado como MSCs19,20,21. Mayoría de los estudios ha reportado que PDC es comparable, si no superior, a células madre procedentes de médula ósea (bMSCs) en hueso curativo y regeneración22,23,24. El periostio es fácilmente accesible y exhibe excelente eficacia regenerativa. Sin embargo, pocos estudios se han centrado en el periostio25,26,27.
Con respecto a la reparación del hueso, la práctica clínica actual consiste en el trasplante de células progenitoras perióstica amplificado en andamios de apoyo. Estudios recientes se han centrado en la adquisición de células madre en regiones defectuosas y empleando células progenitoras para regeneración de tejido20. Los dentistas también anticipan futuro aplicación de regeneración periodontal del hueso en tratamientos periodontales e implantes dentales. Con respecto al sitio donador, el periostio puede ser cosechado fácilmente por odontólogos generales. Esto se compara favorablemente contra células estromales de la médula ósea, como el periostio puede accederse durante cirugía bucal rutinaria. Así, el objetivo de este estudio es establecer un protocolo para la recolección de PDC y evaluar la morfología, accesorio, viabilidad y proliferación de las células madre humanas de periostio.
Metabolitos de vitamina D afectan en vivo mineral óseo equilibrio dinámico. Un estudio informó que la 24R,25-(OH)3 2D forma activa de vitamina D es esencial para la diferenciación osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)28. Homeostasis del hueso y la reparación son reguladas por una red de metabolitos de vitamina D3 , de que 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) es biológicamente más activo y relevante en la regulación de la salud de los huesos. Vitamina D3 es esencial para la calcificación29. En un estudio utilizando ratones de Kunming blanco de 2-d de edad, los cuerpos de embryoid en los ratones indican que suplementos de vitamina C y vitamina D promovieron eficazmente la diferenciación de osteoblastos derivados de ESC30. Entre sus otras actividades biológicas, 1,25-(OH)2D3 estimula la diferenciación en vitro de hMSCs a osteoblastos, que pueden ser monitoreados basados en el incremento en la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (ALP) o gen de la OCN expresión.
Algunos estudios han detectado una relación dosis-respuesta de los tratamientos combinados con vitamina C y 1,25-(OH)2D3 en PDC humana con un enfoque particular en la ingeniería de tejido óseo. Por lo tanto, en este estudio, examinamos la concentración óptima para el tratamiento único o combinado de 1,25-(OH)2D3 y la vitamina C para inducir la diferenciación osteogénica de PDC humana. El objetivo de este protocolo es determinar si una población de células aislada del periostio alveolar dental contiene células con un fenotipo MSC y si estas células pueden ser ampliadas en la cultura (en vitro) y distinguidas para formar el tejido deseado . Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos. La segunda parte del estudio evalúa los efectos de la vitamina C y 10−1010−9, 10−8y 10−7 M 1,25-(OH)2D3 en la actividad osteogénica del PDC. El objetivo principal de este estudio es evaluar las funciones de la vitamina C y 1,25-(OH)2D3 durante la diferenciación osteoblástica de PDC por actividad de la ALP y genes pro-osteogénicos, como ALP, colágeno 1, OCN, BSP y CBFA1. Además, este estudio determina las condiciones de óptimo osteoinductores para humano PDC basado en estos resultados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#160; well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs01029144_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>K412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>avian myeloblastosis virus reverse transcriptase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109118001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD146</td>
			<td>BD</td>
			<td>561013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19</td>
			<td>BD</td>
			<td>560994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>BD</td>
			<td>560942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD44</td>
			<td>BD</td>
			<td>561858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>561088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73</td>
			<td>BD</td>
			<td>561014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90</td>
			<td>BD</td>
			<td>561974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell banker1</td>
			<td>ZEAOAQ</td>
			<td>11888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>core binding factor alpha-1</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs00231692_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>ABI</td>
			<td>Hs99999905_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-DR</td>
			<td>BD</td>
			<td>562008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin&#8211;transferrin&#8211;selenium-A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml)</td>
			<td>Life</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp optical adhesive film</td>
			<td>Life</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30265.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-8333-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STRO-1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>340103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBER Green PCR Master Mix</td>
			<td>AppliedBiosystems</td>
			<td>4309155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Master Mix</td>
			<td>Life</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transforming growth factor-&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7039&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol reagent (for RNA isolation)</td>
			<td>Life</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">collagen-1</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OCN</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39;-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">BSP</td>
			<td rowspan="2">Invitrogen</td>
			<td>forward primer 5&#39; AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse primer 5&#39;-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial ALP primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial CBFA1 primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mesenchymal stem cells from human alveolar periosteum and effects of vitamin d on osteogenic activity of periosteum-derived cells

Las células madre mesenquimales (MSCs) están presentes en una variedad de tejidos y puede diferenciarse en numerosos tipos celulares, incluyendo osteoblastos. Entre las fuentes dentales de MSCs, el periostio es un tejido fácilmente accesible, que se ha identificado a contener MSCs en la capa de cambium. Sin embargo, esta fuente no todavía sido ampliamente estudiada.
Vitamina D3 y 1,25-(OH)2D3 se han demostrado para estimular en vitro la diferenciación de MSCs en osteoblastos. Además, la vitamina C facilita crecimiento de colágeno formación y hueso celular. Sin embargo, ningún estudio ha investigado aún los efectos de la vitamina D3 y la vitamina C en MSCs.
Aquí, presentamos un método de aislamiento MSCs de periostio alveolar humano y examinar la hipótesis de que 1,25-(OH)2D3 puede ejercer un efecto Osteoinductor en estas células. También investigar la presencia de MSCs en el periostio alveolar humano y evaluar proliferación y adhesión de la célula de vástago. Para evaluar la capacidad de la vitamina C (como control) y diferentes concentraciones de 1,25-(OH)2D3 (10−1010−9, 10−8y 10−7 M) a alterar clave biomarcadores de mRNA en la expresión del mRNA de MSCs aislada de la fosfatasa alcalina (ALP), ósea sialoprotein (BSP), atascamiento de la base del factor alfa-1 (CBFA1), colágeno-1 y osteocalcina (OCN) se calculan utilizando la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR).

Para los ensayos cuantitativos, los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Todos los análisis estadísticos se realizaron mediante de Student t-test. En total, se obtuvieron 34 muestras con una edad media de participantes de 48,1 ± 12,3 y once de estas muestras se obtuvieron de pacientes masculinos y 23 pacientes femeninos. Se obtuvieron muestras de veinte y ocho de las regiones molares y de seis de las regiones anteriores; 26 se obtuvieron de la maxila y ...

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Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Presentamos un protocolo para investigar los biomarcadores de la expresión de mRNA de células derivadas del periostio (PDC) inducidas por la vitamina C (vitamina C) y 1, 25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH) D23]. Además, evaluamos la capacidad de PDC se diferencian en osteocitos, condrocitos y adipocitos.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Investigación

Bioingeniería

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

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Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

Aislamiento, expansión y diferenciación de células madre mesenquimales de la almohadilla de grasa infrapatelar de la articulación sofocante de cabra

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...