Name: essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation
Uploaded: 2018-02-01T15:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Data blev også indsamlet på GM/CA@APS, som er blevet finansieret helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute (ACB-12002) og National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Denne forskning anvendes ressourcer af avancerede Photon kilde (APS), en US Department af energi (DOE) Office of Science bruger Facility drives for DOE Office of Science ved Argonne National Laboratory under Kontraktnr. DE-AC02-06CH11357. Brug af avanceret Photon kilde blev støttet af U. S. Department of Energy, Office of Science, Office af energi Grundvidenskab, under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38.
Vi vil gerne anerkende UAB Comprehensive Cancer Center - masse massespektrometri/Proteomics delt facilitet (P30CA13148-38) for deres hjælp i massespektrometri analyse.
C.D.R. blev støttet af en bevilling fra University of Alabama i Birmingham Office af mangfoldighed, egenkapital og inklusion. L.L.R. blev støttet af radiologi Institut for University of Alabama i Birmingham. Department of Energy, Office of Science, isotop Program støttet 52Mn produktion og A.V.F.M. under tildele DESC0015773.

1. Bakteriers Starter kultur (dag 1)
<ol><li>I en 200 mL skrå kolbe, podes 30 mL Luria Bertani bouillon (LB) med Escherichia coli stamme BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL celler indeholdende pYFE3 plasmid16.</li>
	<li>Tilføje 30 µL af 50 mg/mL ampicillin kolben ved sugning med en pipette og 200 µL tip. Der omrystes natten over på 225 rpm på 37 ˚C.</li>
</ol>2. suppleres M9 Minimal Media forberedelse (dag 2)
Bemærk: Dette er tilpasset fra Amresco manual.
<ol><li>Forbered 6 L af flydende medier ved følgende procedure. I en 2 L skrå kolbe, tilføje 10,5 g af M9 minimal medier til 1 L ultra-rene H2O. autoklave på 121 ˚C for 20 min og derefter afkøles til stuetemperatur.</li>
	<li>Tilsaettes aseptisk følgende sterile supplement løsninger: 2 mL/L 1 M MgSO4, 10 mL/L af 20% w/v glukose, 0,1 mL/L 1 M CaCl2og 1 mL/L af 50 mg/mL ampicillin. Udføre dette trin i en biologisk sikkerhed kabinet til at opretholde et sterilt miljø. Varm medier til 37 ˚C.</li>
</ol>3. Bakteriers subkultur
<ol><li>Føje 5 mL/L af overnight starter kultur til M9 minimal medier ved sugning med en automatiseret pipette og 5 mL spids. Ryste subkultur kontinuerligt på 225 rpm på 37 ˚C til 9 h. Bemærk: Under dette trin er YfeABCDE overexpressed af autoinduction fra sin indfødte Y. pestis promotor.</li>
	<li>Genskab celler ved centrifugering ved 4500 x g i 30 min. ved 4 ˚C. Resuspend celler i 50 mL af en iskold fosfatstødpudeopløsningen (20 mM Na2HPO4 pH 7,6, 50 mM NaCl) af sugning med en pipette og 1 mL tip, og fryse natten over på-80 ˚C.</li>
</ol>4. celle fraktionering (dag 3)
<ol><li>Tø ophvirvling på 4 ° C og pellet celler på 4.000 x g i 20 min. på 4 ˚C. Resuspend celler i 50 mL iskold høje salt buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl, og 2 mM EDTA) af sugning med en automatiseret pipette og 25 mL spids. Inkuber suspension over isen i 20 min., med lejlighedsvise inversion til at blande.</li>
	<li>Sammenpresse cellerne på 4.500 x g i 20 min. på 4 ˚C. Resuspend celler i 50 mL iskold lav salt buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0) af sugning med en automatiseret pipette og 25 mL spids. Inkuber suspension over isen i 20 min., med lejlighedsvise inversion til at blande.</li>
	<li>Pellet spheroplasts ved 4500 x g i 20 min. ved 4 ˚C. Genskab supernatanten indeholdende periplasm. Resuspend pelleted spheroplasts i fosfatbufferet saltopløsning (trin 3.2) ved sugning med en automatiseret pipette og 25 mL spids, og lyse celler af tre cyklusser af fransk pres celle Tryk på 1500 psi. Bemærk: En fransk pres celle pressen kan være akavet at betjene og bruger en hydraulisk pumpe til at drive celle lysering. Vær forsigtig, når engagerende Hydraulikpumpe, sikre korrekt justering af stemplet med pressen, og at holde hænderne fri af den hydrauliske pumpe.</li>
	<li>Pellet celleaffald ved 50.000 x g i 20 min. ved 4 ˚C. Genskab supernatanten indeholdende cytoplasma. Hvis det er nødvendigt, kan de ydre og indre membraner være yderligere fraktionerede16.</li>
</ol>5. protein rensning ved hjælp af FPLC
<ol><li>Umiddelbart efter fraktionering, filtrere den periplasmic fraktion ved hjælp af et 0,45 µm membran enhed. Bruge en Luer lock sprøjte filter for nem og hurtig filtrering. Blandingen henstår en 5 mL Q anion Ionbytterkolonnen ved hjælp af 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3 loading bufferen ved en flowhastighed af 5 mL/min.</li>
	<li>Indlæse periplasmic filtratet pre afbalancerede 5 mL Q anion exchange kolonne ved hjælp af 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3 loading bufferen ved en flowhastighed på 2 mL/min. Fortsæt at vaske 5 mL Q anion Ionbytterkolonnen ved hjælp af 20 mM Tris pH 7,6 , 0,05% w/v NaN3 loading bufferen indtil en baseline læsning af A280 er opnået ved en flowhastighed af 5 mL/min.</li>
	<li>Elueres bundet protein ved hjælp af 20 mM Tris pH 7,6, 0,05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl ved lineær gradient over 10 kolonne diskenheder ved en flowhastighed af 5 mL/min. kombinere fraktioner der indeholder en280 peak. APO YfeA eluerer mellem 200 mM NaCl og 300 mM NaCl.</li>
	<li>Koncentrere eluatet af centrifugal koncentrator, indtil volumen når ~ 5 mL.</li>
	<li>Blandingen henstår en Superdex 200 pg gel filtrering kolonne med 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 50 mM NaCl, 0,05% w/v NaN3 gel filtrering buffer ved en flowhastighed af 2,5 mL/min.</li>
	<li>Load den koncentrerede anion udveksle eluatet pre afbalancerede Superdex 200 pg gel filtrering kolonne og rense, ved hjælp af gel filtrering buffer fra trin 5.5 ved en flowhastighed af 2,5 mL/min. kombinere fraktioner der indeholder en280 top, der svarer til en ~ 30 kilodalton (kDa) protein. Bemærk: Den følgende reference er et eksempel FPLC eksperiment at demonstrere protokol17.</li>
</ol>6. protein krystallisering
<ol><li>Koncentrere gel filtrering eluatet af centrifugal koncentrator til en afsluttende proteinkoncentration 22 mg/ml.<ol>
<li>Beregne proteinkoncentration ved at dividere A280 læsning af 1.276 mg/mL. Denne teoretiske extinction koefficient blev forudsagt af ExPASY ProtParam18. Bemærk: En A280 prøve læsning af 5.104 AU svarer til en 4.000 mg/mL opløsning; 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4,00 mg / mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 1,5 µL af protein med 1,5 µL 30% w/v PLØK 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 0,05% w/v NaN3 i sidder drop eller hængende drop opsætning af sugning med en pipette og 10 µL tip.</li>
	<li>Inkuber krystallisering dråber på 293 K for 2-4 uger.</li>
	<li>Flash-freeze krystaller i flydende nitrogen pool til forsendelse til synkrotron.</li>
</ol>7. X-ray fluorescens (ved hjælp af GM/CA Beamline Software)
<ol><li>Naviger til fanen Hutch Brug energi underposition indstille energi til 10,0 keV.</li>
	<li>Naviger til fanen Skan . Naviger til Interactive tab. Mount stikprøve.</li>
	<li>Vælg Optimer fluorescens signal. Input 4.00 s underoverskriften tid . Vælg tage fluorescens spektrum. Se spektrum ved hjælp af Plot fane.</li>
</ol>8. MAD scanning for Metal energi Absorption Peak (ved hjælp af GM/CA Beamline Software)
<ol><li>Flytte prøven ud af stråle. Naviger til fanen Skan . Naviger til den periodiske tab. Vælg K-kanten af element af interesse. Bemærk: Energiindholdet i energi underposition er i eV.</li>
	<li>Naviger til fanen Hutch Brug energi underposition indstille energi til værdien i trin 8,1 i keV.</li>
	<li>Flytte prøven i bjælken. Naviger til fanen Skan . Naviger til fanen Auto Input 2,00 s underoverskriften tid .</li>
	<li>Vælg Start scanning. Se MAD scanningen ved hjælp af fanen Plot . Bemærk: Energiindholdet i Peak underposition er i eV snarere end keV.</li>
	<li>Vælg gjort med fluorescens.</li>
	<li>Flytte prøven ud af strålen. Naviger til fanen Hutch brug energi underposition indstille energi til værdien i trin 8.4 rundes op til det næste eV (dvs. Peak: 9658.3 eV, sat energi til 9659 eV).</li>
	<li>Flytte prøven i bjælken. Indsamle data sæt. Gentag trin 8,1-8,6 for alle metaller af interesse.</li>
</ol>9. analytisk protokol for radioaktivt Metal optagelse Assay
<ol><li>I et 14 mL kultur rør, podes med E. coli stamme BL21-CodonPlus (DE3) 5 mL af LB-RIPL celler indeholdende pYFE3 plasmid16. Tilføj 5 µL af 50 mg/mL ampicillin ved sugning med en pipette og 10 µL tip. Ryste på 225 rpm på 37 ˚C til 7 h.</li>
	<li>Sammenpresse cellerne på 15.000 x g i 1 minut ved stuetemperatur ved hjælp af en bordplade centrifuge. Vaske cellerne i 1 mL af suppleret M9 minimal medier af sugning med en pipette og 1 mL spids. Gentag én gang.</li>
	<li>I en 50 mL konisk slange suppleres subkultur celler til 30 mL M9 minimal medier af sugning med en pipette og 1 mL spids. Ryste på 225 rpm på 37 ˚C til 9 h.</li>
	<li>Bestemme mængden af radioaktivitet, der kræves for at opnå ca 100.000 tæller pr. minut (cpm). Bemærk: Dette vil variere afhængigt af instrumentet anvendes til detektion og radioisotop. F.eks. en prøve, der indeholder 7,4 kilobecquerel (kBq) (0,2 microcurie (µCi)) 52Mn giver en læsning af 550.000 cpm på en automatiseret gamma detektor (NaI). Mængden af radioaktivitet for at få en optælling af 100.000 cpm kan således bestemmes ved hjælp af følgende ligning: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7.4 kBq (0,2 µCi) = 1,35 kBq (0.036 µCi). Forsigtig: radioaktivt henfald resulterer i frigivelse af ioniserende stråling, som er farlige. Når du arbejder med radioaktivitet altid bruge den passende afskærmning og følge principperne af som lave som rimeligt muligt (Alara-princippet) ved at øge afstanden og afskærmning samtidig reducere eksponeringstid. Kun uddannet personale skal håndtere radioaktivitet i særligt udpegede laboratorier, som er givet i licens til brug af radioaktive materialer.</li>
	<li>Formere sig kræves radioaktivitet beregnet i trin 9.4 af den samlede mængde af subkultur, til at bestemme den samlede mængde af radioaktivitet nødvendigt. Tilføje dette beløb (helst i en lille mængde af 50-100 µL) at tuben indeholder subkultur, så der er 100.000 cpm/mL og vortex godt for 30 s. Bemærk: For 31 mL subkultur, det samlede beløb af radioaktivitet kræves er 1,35 kBq (0.036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1.12 µCi).</li>
	<li>Delprøve 1 mL af subkultur (nu indeholdende radioaktive sporstof) i enkelte 1,5 mL centrifugeres rør af sugning med en pipette og 1 mL spids, og sted i en 37˚C thermomixer, med vortexing på 1 × g. Medtag nok rør, således at der er tre replikater for hver ønskede måling samt tre yderligere replikater skal bruges som standarder (afsat standarderne, ikke udfører fraktionering assay på standarder). Bemærk: Aflæst på 1, 2 og 4 h ville kræve 12 rør samlede.</li>
	<li>Efter inkubationen centrifugeres rør på 15.000 × g for 30 s ved hjælp af en benchtop centrifuge (helst afkølet til 4 ˚C) og kassér analysere.</li>
	<li>Genopslæmmes celler i 1 mL af is kold, høje salt buffer (trin 4.1) ved sugning med en pipette og 1 mL spids, og umiddelbart sted i isbad i 20 min.</li>
	<li>Sammenpresse cellerne igen på 15.000 × g for 30 s ved hjælp af en benchtop centrifuge (helst afkølet til 4 ˚C) og kassér analysere. Bemærk: Supernatanten indeholder ikke-tilknyttede gratis metal.</li>
	<li>Cellerne i is kold genopslæmmes, lav salt buffer (trin 4.2) ved sugning med en pipette og 1 mL spids, og der inkuberes i isbad i 20 min. Bemærk: Det er vigtigt at Aspirér forsigtigt via pipette til dette trin.</li>
	<li>Sammenpresse cellerne på 15.000 × g for 30 s, og indsamle hver af supernatanter i nye 1,5 mL centrifugeres rør. Der bør nu være seks rør pr. tidspunkt. Bemærk: Supernatanten indeholder periplasmic fraktion og pellet indeholder den hindeagtige og cytoplasmatisk brøkdel. Vi kalder pelleten cytoplasmatisk brøken.</li>
	<li>Måle radioaktivitet i hver fraktion (seks rør pr. tidspunkt) samt de standarder, der er afsat i trin 9.6. Bruge mængden af radioaktivitet i standarder til at bestemme den samlede mængde af radioaktivitet oprindeligt føjet til hver prøve.</li>
	<li>Bestem procentdelen af radioaktivt optagelse i periplasm ved brug af følgende ligning: (gennemsnitlig cpm af periplasmic brøkdel/gennemsnitlig cpm af standarder) x 100.</li>
	<li>Bestem procentdelen af radioaktivt optagelse i cytoplasma ved brug af følgende ligning: (gennemsnitlig cpm af cytoplasmatisk brøkdel/gennemsnitlig cpm standarder) x 100.</li>
	<li>Bestem % samlet optagelse ved brug af følgende ligning: ((gennemsnitlig cpm periplasmic brøkdel + gennemsnitlig cpm af de tilsvarende cytoplasmatisk brøkdel) / (gennemsnitlig cpm standarder)) x 100.</li>
</ol>

<ol>
	<li>ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity+of+ABC+transporters.">Structural diversity of ABC transporters.</a> J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).</li><li>Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+classification+of+substrate-binding+proteins.">A structural classification of substrate-binding proteins.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).</li><li>Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hinge-bending+in+L-arabinose-binding+protein.+The+&amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34;+model.">Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The &amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34; model.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).</li><li>Hoeppner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+and+Their+Ligands:+Their+Importance+and+How+to+Crystallize+Them.">Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them.</a> Advanced Topics on Crystal Growth. , (2013).</li><li>Lee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Zn(II)-free+Treponema+pallidum+TroA,+a+periplasmic+metal-binding+protein,+reveals+a+closed+conformation.">The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).</li><li>Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+regulatory+role+for+the+histidine-rich+loop+in+the+zinc+transport+protein,+ZnuA.">Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA.</a> Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).</li><li>Yatsunyk, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+metal+binding+properties+of+ZnuA,+a+periplasmic+zinc+transporter+from+Escherichia+coli.">Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli.</a> J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).</li><li>McDevitt, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+for+bacterial+susceptibility+to+zinc.">A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc.</a> PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).</li><li>Cou&#241;ago, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imperfect+coordination+chemistry+facilitates+metal+ion+release+in+the+Psa+permease.">Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease.</a> Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).</li><li>Abate, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo,+Zn2+-bound+and+Mn2+-bound+structures+reveal+ligand-binding+properties+of+SitA+from+the+pathogen+Staphylococcus+pseudintermedius.">Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius.</a> Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).</li><li>Ahuja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+bacterial+ABC+transporter+inhibition+by+an+antibody+fragment.">Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment.</a> Structure. 23 (4), 713-723 (2015).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+Cells.">Fractionation of Cells.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Zhao, H., Martinis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacterial+compartments+to+track+movement+of+protein+synthesis+factors.">Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors.</a> Methods. 113, 120-126 (2017).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).</li><li>Radka, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Yersinia+pestis+virulence+factor+YfeA+reveals+two+polyspecific+metal-binding+sites.">Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).</li><li>Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Scale+Production+and+Purification+of+a+Therapeutic+Antibody.">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J Vis Exp. (119), e55153 (2017).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+PET+Imaging+of+pharmacokinetics+of+manganese+in+mice+using+Manganese-52.">Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52.</a> PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).</li><li>Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transferrin-independent+iron+transport+in+K562+cells.+Unique+properties+provide+evidence+for+multiple+pathways+of+iron+uptake.">Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake.</a> J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).</li><li>Makui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Escherichia+coli+K-12+Nramp+orthologue+(MntH)+as+a+selective+divalent+metal+ion+transporter.">Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter.</a> Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).</li><li>Forbes, J. R., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron,+manganese,+and+cobalt+transport+by+Nramp1+(Slc11a1)+and+Nramp2+(Slc11a2)+expressed+at+the+plasma+membrane.">Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane.</a> Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).</li></ol>

Forfatterne erklærer, de har ingen interessekonflikter.

Celle fraktionering er et nyttigt værktøj for specifikt sondering indholdet af en cellulære rum, og kan tjene som et nyttigt værktøj til at udtrække små molekyler såsom metal atomer og makromolekyler såsom proteiner. Det er værd at bemærke, at celle fraktionering er ikke en absolut teknik og kan være fejl liggende uden omhyggelig med at blande/resuspension, inkubation temperatur og inkubationstiden. Ufuldstændig blanding kan resultere i minimal hindeagtige lysis og dermed ubetydelig fraktionering, fraktionering ved stuetemperatur kan forårsage hurtige lysering af begge membraner, hvilket resulterer i forurening af den periplasmic fraktion med cytoplasmatisk indhold, og udvidet inkuberingstider kan også resultere i overdreven lysis og dermed brøkdel forurening. Et rimeligt kompromis for at opnå effektiv og relativt komplet ydre membran lysis (samtidig bevare den indre membran) er 20 minutters inkubation over isen i hypotonic fraktionering buffer. En anden overvejelse er metoden til udvinding, hvor barske ekstraktion ved rystning eller vortex kunne forringe kvaliteten af ekstrakt som forårsager protein sammenlægning. Det anbefales at blandes forsigtigt som af spatel, inversion eller sugning af pipette til at opretholde høj kvalitet materiale til downstream analyse. Rensning fra forberedende celle fraktionering kan forekomme med variabel effektivitetsgevinster, som det fremgår af figur 1. YfeA begyndte i et eksperiment, som 8% af de udtrukne periplasmic indhold (figur 1 c), mens i et andet eksperiment, YfeA begyndte som 17% af de periplasmic indhold (fig. 1 d). Disse forskelle kan skyldes flere årsager såsom variable udtryk betingelser (tilføje EDTA til vækst medier kan øge udtryk af gener reguleret af sult mekanismer som pels regulering af Yfe promotor), gentagen brug af frosset permanente lagre, og menneskelige fejl. I stedet for at justere inkuberingstider, anbefales det at skala-up forberedelse. Oprensning fra periplasm fraktion er anbefalet at anføre en lineær gradient eluering fra anion exchange kromatografiske trin. Et trin gradient eluering er en eluering strategi bruger diskrete og pludselige ændringer i mobil fase sammensætning (dvs., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, osv.). En lineær gradient eluering er en eluering strategi, der bruger gradvis ændring i mobile fase sammensætning (dvs. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, osv.). Et trin gradient er nyttig til at adskille molekyler, der har forskellige tilhørsforhold til den stationære fase, og en lineær gradient eluering er nyttig til at adskille molekyler, der har lignende tilhørsforhold til den stationære fase. I forbindelse med rensning af protein med ingen kunstige rensning tag (at øge affinitet til den stationære fase) fra en celle kabine, som er rig på unikke protein arter, anbefales en lineær gradient eluering at adskille proteiner af noninterest, der kan har lignende tilhørsforhold til den stationære fase som protein af interesse. Generelt et udbytte på 1-2 mg renset apo YfeA forventes fra hver liter af kultur at udtrykke YfeA fra sin endogene Y. pestis promotor.
X-ray Fluorescens er en teknik, der gør det muligt for efterforsker hurtigt metal indholdet bestemmes i en prøve, og informere investigator om uventede metal indarbejdelse, der ellers ville være ukendt. Selvom EDTA er inkluderet i hypertonisk fraktionering bufferen til at fjerne løst forbundet eller gratis metal, kan YfeA stammer fra periplasm fraktion indeholde nogle holo protein. Metal transport er en dynamisk proces, måske stammer holo proteinindhold fra YfeA, der stadig ikke har doneret sin last til YfeBCDE. Det er værd at bemærke, X-ray fluorescens kun måler metal totalindholdet og angiver ikke, hvis metal er bestilt i en krystalgitter eller specifikt bundet til et protein. Bestem hvis metal er bestilt i en krystalgitter og/eller specifikt bundet til et protein molekyle er X-ray spredning dataindsamling og -behandling påkrævet. Ikke desto mindre X-ray fluorescens giver mulighed for hurtig prøve vurdering af metal kontaminering og/eller resterende holo protein integration. Synkrotron stråling tid er begrænset, og der er ikke altid tid til at udarbejde en strategi for indsamling af X-ray spredning data på hver prøve, således X-ray Fluorescens er en værdifuld teknik screening mange krystaller og prioritering for hvilke prøver X-ray spredning data bør indsamles. Derudover muliggør X-ray fluorescens indsamling af data fra prøver, der ikke kan diffract x-stråler. Mens indsamling X-ray fluorescens data, til tider signalet kan være meget svag og de deraf følgende spektre intetsigende. For at forbedre styrken af signalet, enten for X-ray fluorescens eller MAD scanner, overveje at øge eksponeringstiden og/eller faldende X-ray stråle dæmpning. Når en stikprøve er identificeret for indsamling af X-ray spredning data, anbefales det at indsamle X-ray spredning data på en anden del af prøven end hvad blev brugt til X-ray fluorescens og MAD scanner til at minimere strålingsskader, forbedre kvaliteten af dataene samling, og minimere eventuelle potentiale for reduktion af unormal signal.
Påvisning af radioaktive sporstoffer kræver nanomolar mængder af materiale eller mindre, og brugen af disse røbestoffer som Molekylær tracking agenter giver en simpel og yderst følsom metode til sondering cellulære processer. Radiometal analysen ovenfor skitserede kan bruges til at bestemme samlede metal optagelse, distribution på tværs af cellulære rum, som satserne for optagelse. Faktisk kræver hvert datapunkt tid en 40 minutters fraktionering; som hvert tidspunkt er nået, er celler dog straks pelleted og inkuberes i høje salt buffer (figur 5trin 1). Radiometal målinger af medierne, kasserede høje salt buffer (figur 5trin 1) og periplasmic, og cytoplasmatisk fraktioner efter (figur 5trin 3) angive høje salt buffer inkubering med held fjerner alle resterende ikke-tilknyttede gratis metal, der dvælede efter den indledende centrifugering efter at have nået tidspunkt. Den første centrifugering fjerner de fleste (op til 80%) af de ikke-tilknyttede gratis metal og centrifugeringen efter inkubation i det høje salt buffer fjerner også yderligere resterende ikke-tilknyttede gratis metal. Enhver dvælende unassociated gratis metal forventes ikke at betydeligt påvirke metal transport under 40 minutters fraktionering. Indflydelse af 40 minut fraktionering intracellulære metal transport er en anden overvejelse for forsigtig data fortolkning. Stort set opstår hele fraktionering protokol over isen, bortset fra de 30 anden centrifugering mellem trin. Metal transporttid kursus eksperimenter har tilkendegivet at opretholde celler ved 4 ° C ophæver metal transport20,21,22; Derfor, fordi eksperimenterne opstår over isen, 40 minutters fraktionering forventes ikke at betydeligt forøge metal niveauer i periplasm af cytoplasmaet og metal niveauerne forventes at være repræsentant for tidspunkter hvor cellerne var i første omgang centrifugalized.
Bestemmelse af relativ optagelse i forskellige cellulære rum kan hjælpe med at informere XFS data, bestyrker den fysiologiske karakter af et substrat samt aktiverer investigator at yderligere sonde molekylære detaljerne i en mekanisme. For eksempel, tilsætning af genetiske mutagenese til radiometal udbredelse eksperimenter giver en direkte metode til at styrke vigtige funktionelle restkoncentrationer eller molekyler involveret i substrat transport. Fordele ved radiometal optagelse forsøg og analyser omfatter hurtig turnaround, høj produktivitet, høj reproducerbarhed og parallelization af eksperimenter sammenligning vækstbetingelser og genetiske konstruktioner.

I gram-negative bakterier, er cytoplasmatisk puljer af overgangen metal atomer øget og genopfyldes med indre membran ABC (ATP-binding kassetten) importører, at afbøde metal translokation tværs over den indre membran. Periplasmic Cluster A-1 substrat-bindende proteiner (SBPs) komponere en gruppe af chaperoner, der binder de metal atomer direkte og ferry dem gennem periplasm at levere dem til beslægtet ABC importører1. Andre klynger af SBPs er dedikeret til transport af substrater, såsom chelaterede metal (klynge A-2), kulhydrater (klynger B og D-1) og aminosyrer (klynger B, C, F-2 og F-4); ikke desto mindre, uanset substrat, SBPs følger et evolutionært bevaret c-clamp fold2. Den generaliserede foreslåede mekanisme for SBP substrat overførsel indeholder c-clamp undergår en række krumspring, der ligner en Venus flytrap3. Generelt, klynge A-1 SBPs rense i en holo (metal-bundet) form, om studiet af disse SBPs er begrænset af vanskeligheden i at generere apo (metal-fri) former for protein for eksperimenter4. Til dato, strategier til at studere apo klynge A-1 SBPs har været begrænset til mutagenese, dialyse og delvis denaturering med ethylendiamintetra syre (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. strukturelle data fra disse eksperimenter tyder på, at klyngen A-1 SBPs netop ikke kan følge Venus flytrap mekanisme. I øjeblikket mangler fra litteraturen er en metode til fremstilling af apo klynge A-1 SBPs i vivo ved hjælp af fysiologiske bindende partnere.
Vi demonstrere for første gang ved hjælp af celle fraktionering til at rense YfeA, en klynge A-1 SBP fra Yersinia pestis, den ætiologiske agent for pest, som var konverteret til apo form gennem interaktion med dens fysiologiske beslægtet YfeBCDE ABC importør i cellen. Vi viser YfeA i apo form af energy dispersive X-ray spektroskopi (Red.), også kendt som X-ray fluorescens. Vi viser også YfeBCDE funktionalitet ved at kombinere celle fraktionering med meget følsomme radioaktivt metal optagelse undersøgelser at skelne mellem metal udbredelse på tværs af den ydre membran og metal import gennem den indre membran. Brugen af et radioaktivt sporstof giver mulighed for påvisning af pg/L mængder af metaller, meget lavere end detektionsgrænsen for teknikker, sådan som Induktivt koblet plasma massespektrometri (ICP-MS) eller atomare absorption spektroskopi (AAS). Dette giver mulighed for minimal undertrykkelse af netbårne af systemet ved at blive undersøgt. Desuden kræver de traditionelle metoder ofte større stikprøve diskenheder, yderligere efterbehandling og længere turn-around tid, som ikke er typiske for radiotracer assays. Således, ved hjælp af en radiotracer giver en bekvem og enkel metode til overvågning af metal distribution og udbredelse inden for en celle. Det henstår bestemmes hvis en apo klynge A-1 SBP fremstillet ved hjælp af denne metode vil gentage de strukturelle bemærkninger fra den nuværende praksis bruges til at generere apo protein.
Celle fraktionering er en etableret metode til at adskille cellulære rum implicitte med det formål at specifikt sondering deres indhold i isolation12. Celle fraktionering er almindeligt anvendt til at bekræfte placeringen af et molekyle i løbet af celle cyklus eller måler aktiviteten af et bestemt rum13. For eksempel kan metal transportaktiviteter analyseres ved sondering cellulære rum for metal substrat. Integrering af celle fraktionering muliggør skelnen og sammenligning mellem metal udbredelse på tværs af den ydre membran og metal overførsel på tværs af de indre membran. Disse processer kan derefter igen måles over tid. I tilfælde af protein oprensning, de mest almindelige metoder til celle lysis og adskillelse af opløselige komponenter fra uopløselige komponenter er mekanisk afbrydelse (dvs, formaling, blanding), højtryk homogenisering (dvs, fransk pres celle tryk, celle Disrupters), og ultrasonisk frekvenser (dvs., ultralydbehandling)14. Brug af ultrasonisk frekvenser til lyse celler er generelt bedst egnet til små mængder; dog er sonikering kendt for at skabe overdrevne varme, der kan denaturerer protein. For at undgå at generere overdreven varme, anvendes ultrasonisk frekvenser normalt i sekventielle korte stød, hvilket kan være tidskrævende og uforvarende nedbrydes DNA molekyler i mindre fragmenter. Derudover kan flere dyre sonikering sonder være påkrævet for forberedende og analytiske eksperimenter, som hver sonde har en begrænset rækkevidde for den sample volumen, der kan behandles. Brug af højt tryk til lyse celler undgår at generere overdreven varme under celle lysering af køling fransk pres celle presse komponenter før lysis eller opererer en celle disruptor i et koldt miljø som et koldt værelse. Ligesom sonikering sonder, kan flere sæt af fransk pres celle presse komponenter skal købes for at behandle en bred vifte af prøven diskenheder. Fransk pres celle presse forsamlinger er nemt at tilslutte men akavet at betjene og rense, kan være tung at flytte og er udsat for tilstopning af tætte prøver. Fordele ved at bruge ultrasonisk frekvenser og højtryks systemer til lyse celler omfatter høj prøve opsving, evnen til at behandle flere prøver med minimal krydskontaminering og justerbar klipning kraft, som kan være tilpasset til lysis optimering af en bred vifte af prøven typer. Optimering kan forekomme ved at justere ultralyd hyppigheden, varigheden af byger, stempel pres pounds per kvadrattomme (psi), og antallet af passerer gennem pressen. Anvendelse af mekanisk afbrydelse af lyse celler kan være den teknisk mest trivielle og billigste strategi for celle lysering. Mekanisk afbrydelse kan præsentere udfordringer i prøve opsving og er ikke ideelt til behandling af flere prøver. Mekanisk afbrydelse er blidere eksempler end højtryk eller ultrasonisk frekvenser, men er ikke høj overførselshastighed og er udsat for ineffektive lysering. En væsentlig eksperimentelle begrænsning af mekanisk afbrydelse, højtryk homogenisering og ultrasonisk frekvenser, er ukontrollabel afbrydelse af den hele cellulære arkitektur sådan, at efter lysis, alle vandig celle bestanddele blandes sammen. Desuden, alle celle rum ikke forstyrrer samtidig; indholdet af rum, der lyse tidligt kan derfor underkastet løbende forstyrrende kræfter længere end indholdet af rum, der lyse sent. Celle fraktionering giver mulighed for billig, teknisk ukompliceret, effektive rum-baserede adskillelse af celleindholdet samtidig undgå behovet for dyrt udstyr og prøve eksponering for barske, forstyrrende kræfter.
I tilfælde af SBP, importerede substrat er genindført til potentielt apo protein og regenererer holo protein under lysis, før downstream kromatografi eller andre rensning teknikker. Optagelse af EDTA chelator under lysis udgør en ekstra hindring, hvor metal affinitet som et første skridt af protein oprensning ikke er muligt da EDTA vil fratage metal fra kromatografi harpiks og forhindre protein bindende15. En enkel og billig løsning er celle fraktionering af osmotisk chok, hvor differential centrifugering og fælles laboratoriereagenser aktiverer investigator at omhyggeligt uddrage tilstrækkeligt protein for funktionelle analyse. Osmotisk chok fraktionering udnytter en to-trins ændring i osmotisk tryk til at adskille cellulære rum. For det første en hypertonisk buffer får cellerne til rundtakkede som vand forlader hver celle og for det andet en hypotonic buffer får cellerne til at svulme vand igen træder hver celle. Ved omhyggeligt at kontrollere hvor længe cellerne svulmer op, kan de ydre membraner selektivt mængden (på grund af ophobning af osmotisk tryk fra den indkommende vand), således at tømme deres indhold i bufferen. Bevarelse af den indre membraner sikrer, at cytoplasmatisk indholdet er bevaret i spheroplasts, og er let adskilt fra periplasmic indhold af centrifugering.
YfeA er en polyspecific SBP i stand til at bindende jern, mangan og zink atomer16. De forholdsvise mængder af indarbejdet metal kan ændres efter metal tilskud under væksten, og analyseres af X-ray fluorescens som er tilgængelig på Argonne National Laboratorys avancerede Photon kilde16. X-ray fluorescens muliggør investigator til hurtigt profil en bred samling af metaller uden behovet for stor eller diffraktion kvalitet krystaller, og selv kan indsamle data fra protein forhastede eller proteinholdige løsning.
X-ray fluorescens kan hurtigt afsløre uventede resultater som i dette tilfælde den primære YfeA substrat er zink og ikke dokumenteret fysiologiske substrater jern og mangan16. Hvis brugt før indsamling X-ray spredning data, kan X-ray fluorescens informere investigator i eksperimentelle design, såsom som metal energi edge(s) Hvis du vil bruge til anormale X-ray spredning dataindsamling. Lige så nyttig som bestemme den relative forekomst af en metal, X-ray fluorescens kan også afgøre, om en metal er fraværende i et udsnit, giver en hurtig metode til at adskille krystaller indeholdende apo protein fra holo protein, og estimering af metal signalstyrke uden behovet for tidskrævende databehandling. Ved at identificere en prøve med en stærk metal signal, kan den præcise bølgelængde skal bruges til indsamling af anomale X-ray spredning bestemmes af flere-bølgelængde anormal dispersion (MAD) scan.
Denne detaljerede protokollen er beregnet til at hjælpe nye eksperimentatorer held udføre celle fraktionering og gøre effektiv brug af synkrotron beamline hardware til at profilere metal totalindholdet og advance studiet af metal-bindende proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1097270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO M9 Medium Broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9688886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, White Powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>230280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation

Vi demonstrere en skalerbar metode til adskillelse af den bakterielle periplasm fra cytoplasmaet. Denne metode bruges til at rense periplasmic protein biofysiske karakterisering og foranstaltning substrat overførsel mellem periplasmic og cytoplasmatisk rum. Ved nøje begrænser den tid, periplasm er adskilt fra cytoplasma, kan eksperimentatoren udvinde protein af interesse og assay hvert rum enkeltvis til substrat uden fremførsel kontaminering mellem rum. Den udpakkede protein fra fraktionering kan derefter analyseres yderligere for tre-dimensionelle struktur bestemmelse eller substrat-bindende profiler. Alternativt, kan denne metode udføres efter inkubering med en radiotracer til at bestemme samlede procent optagelse, samt distribution af tracer (og dermed metal transport) på tværs af forskellige bakterielle rum. Eksperimenter med en radiotracer kan hjælpe med at differentiere mellem en fysiologisk substrat og artefactual substrat, såsom dem, der forårsages af mismetallation.
X-ray fluorescens kan bruges til at opdage tilstedeværelsen eller fraværet af metal indarbejdelse i en prøve, samt måle ændringer, der kan opstå i metal inkorporering som et produkt af vækstbetingelser, rensning betingelser og/eller krystallisering betingelser. X-ray fluorescens giver også en relativ måling af overflod for hvert metal, som kan bruges til at bestemme den bedste metal energi absorption peak skal bruges til indsamling af anomale X-ray spredning. Radiometal optagelse kan bruges som en metode til at validere den fysiologiske karakter af et substrat, opdaget af X-ray fluorescens samt støtte opdagelsen af roman substrater.

SDS-PAGE gel og gel filtrering kromatogrammer blev indsamlet for at evaluere kvaliteten af protein oprensning fra forberedende periplasm fraktionering. Rensning af holo YfeA har tidligere været beskrevet16; rensning af apo YfeA er imidlertid ikke blevet rapporteret. Strategi til at rense apo YfeA beskrevet ved denne metode bruger en rekombinant vildtype konstruktion, der ikke indeholder en affinitet tag af enhver art, især en, der kunne bruges til protein immunblot (dvs., hans-tag), og et monoklonalt antistof, genkender YfeA ikke er blevet beskrevet. Derfor blev massespektrometri analyse udnyttet til at kontrollere rensning af YfeA. For at rense YfeA ved fraktionering, anbefales det at bruge en lineær eluering gradient til anion exchange kromatografi (figur 1). Den lineære eluering gradient væsentligt forbedrer YfeA berigelse i at gøre op ca. 8% af periplasm fraktion til 49% af varens anion exchange som beregnet af densitometri (figur 1 c). Denne sammensætning er forbedret til 61% af gel filtrering, og eluering volumen af apo protein er identisk til eluering omfanget af holo protein (figur 2). Massespektrometri analyse kontrollerer rensning af YfeA gennem påvisning af 92,5% YfeA aminosyresekvens, 246 samlede YfeA polypeptid spektre, 24 unikke peptider og 50 unikke polypeptid spektre. Alternativt, hvis du vil til gengæld den lineære gradient produkt med produkt fra et trin gradient eluering YfeA blev renset af anion udveksling ved hjælp af en vask trinvis 50 mm NaCl fulgte en eluering af 250 mM NaCl (fig. 1 d). Trin gradient beriger marginalt YfeA fra komponere 17% af periplasm fraktion til 18% af varens anion exchange som beregnet af densitometri. Trin gradient eluering beriger også et protein forurenende band at massespektrometri identificeret som indeholdende flere E. coli SBPs af lignende molekylvægt. På grund af resolution grænser af HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, lighed i Molekylær vægt og strukturer af kontaminerende SBPs bedre gel filtrering marginalt YfeA berigelse at 20% af varens gel filtrering. Bør en lineær eluering gradient være uopnåelige for anion udveksling, anbefales det at udforske flere trin vasker i 25-50 mM NaCl intervaller til at identificere koncentrationen af NaCl forpligtet til at fjerne disse forureninger.
Renset apo og holo YfeA krystallisere i samme krystallisering betingelser, selvom billeder af apo og holo YfeA krystal morfologier viser forskelle i krystal vækst mellem apo og holo YfeA stater (figur 3). Ud over massespektrometri verifikation bekræftede røntgen diffraktion data (ikke vist) indsamlet fra krystaller vokset fra protein renset ved denne metode rensning og krystallisation af YfeA. Omfanget af rum forurening (cytoplasmatisk zink vende tilbage apo til holo protein i periplasm fraktion) kan vurderes ved at indfange X-ray fluorescens-spektre (figur 4). Zink er det primære substrat bundet til rekombinante YfeA16, kan X-ray fluorescens-spektre hurtigt skelne mellem en YfeA prøve, der indeholder en stærk zink signal svarer til holo YfeA (figur 4A), vejledende af cross forurening, eller en svag zink signal tyder på apo YfeA og minimal krydskontaminering (figur 4B). ICP-MS analyse af M9 minimal medier bekræftet overgangen metal niveauer i rækken sub-micromolar (ikke vist); påvisning af kun minimale mængder af overgangsmetaller bør derfor forventes efter en vellykket fraktionering. Analytiske fraktionering (figur 5) kan bruges til at måle radiometal transportpriser og fange funktionelle data. En 60 minutters snapshot sammenligne periplasmic og cytoplasmatisk brøkdele af E. coli celler udtrykker YfeA kun, fuld YfeABCDE transportvirksomheden, og ingen af YfeABCDE komponenterne viser konsekvenserne af at udtrykke en enkelt rekombinante protein eller en protein komplekse metal optrækket (figur 6). E. coli celler udtrykker ingen rekombinante protein transporteres ca halvdelen af 52Mn tilføjet medier til cytoplasma med minimal opbevaring i periplasm. Denne negative kontrol repræsenterer endogene mangan transport. E. coli celler udtrykker rekombinante YfeA transporteres ca. en fjerdedel af 52Mn tilføjet medier til cytoplasma med en anden bydel bevaret i periplasm. Mangan opbevaring i periplasm og begrænset transport i cytoplasmaet viser den metaboliske efterspørgsel og flaskehals pålagt ved at producere YfeA i mangel af Yfe transporter. E. coli celler udtrykker rekombinante YfeABCDE transporter transporterede næsten 100% af 52Mn tilføjet medier til cytoplasma med minimal opbevaring i periplasm. Augmented mangan transport i cytoplasmaet illustrerer bidrag Yfe transportvirksomheden i mangan transport.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig1.jpg"> Figur 1. Rensning af YfeA ved fraktionering. A. hypotetisk model for Yfe transporter. B. SDS-PAGE gel YfeA rensning fra periplasm fraktion, ved hjælp af lineær gradient eluering fra anion exchange. SDS-PAGE gel viser berigelse af YfeA (30 kDa) på tværs af rensning trin. Sort pil angiver placeringen af elektroforese migration for YfeA. Molekylær vægt standarder vist på højre. (1) periplasm fraktion. (2) Q anion exchange kolonne flow gennem. (3) Q anion exchange kolonne peak eluering. (4) superdex 200 pg gel filtrering kolonne peak. C. YfeA berigelse – godt eksempel. Billedbehandling af SDS-PAGE gel fra B beregnes samlede berigelse af YfeA af densitometri at stige fra 8% af den periplasmic fraktion til 61% af varens gel filtrering. Blå kasser viser YfeA/total signal densitometri beregninger for. Massespektrometri analyse af boxed bandet i lane 4 opdaget 259/280 YfeA aminosyrer, præsenteret i grøn højdepunkt. Aminosyrer findes i den modne polypeptid er repræsenteret i fed kapitaliserede sort tekst, og aminosyrer komponere kløvet signal peptid er repræsenteret i kursiv bogstaver grå tekst. D. YfeA berigelse - dårligt eksempel. SDS-PAGE gel YfeA rensning fra periplasm fraktion, ved hjælp af trin gradient eluering fra anion exchange. SDS-PAGE gel viser berigelse af YfeA på tværs af rensning trin. Sort pil angiver placeringen af elektroforese migration af store protein forurenende forbedret under anion exchange kromatografi. Molekylær vægt standarder vist på højre. (1) superdex 200 pg gel filtrering kolonne peak. (2) Q anion exchange kolonne 250 mM NaCl trin gradient eluering. (3) periplasm fraktion. Billedbehandling af SDS-PAGE gel fra D beregner marginale samlede berigelse af YfeA af densitometri til højst 20% af varens gel filtrering. Blå kasser viser YfeA/total signal densitometri beregninger for. Masse massespektrometri analyse af den af bandet angivet ved sort pil i lane 1 registreret 26 unikke peptider af LivJ (39 kDa), 25 unikke peptider af EfeO (41 kDa), og 17 unikke peptider af LivK (39 kDa). Alle tre forurenende stoffer er periplasmic E. coli SBPs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig2.jpg"> Figur 2. APO YfeA og holo YfeA gel filtrering kromatogrammer. Sort pil angiver placeringen af dødvolumen. Gel filtrering toppe til apo YfeA (sort kurve) og holo YfeA (blå kurve) viser begge protein hedder elueres ved samme eluering lydstyrke, der angiver, at apo YfeA renset fra periplasm fraktion har en lignende hydrodynamiske radius som holo YfeA renset fra i alt cellulære indhold efter franske presse.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig3.jpg"> Figur 3. APO YfeA og holo YfeA krystal morfologier. Holo YfeA udkrystalliserer som en monolitisk krystal, mens apo YfeA generelt producerer tilbyder krystaller i samme stand, krystallisering. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig4.jpg"> Figur 4. APO YfeA og holo YfeA X-ray fluorescens-spektre. A. X-ray fluorescens-spektre af holo YfeA, der har været renset fra M9 minimal medier med ingen yderligere overgangen metal tilskud, grønne kurve. Karakteristiske toppe er mærket for mangan, jern og zink. B. X-ray fluorescens-spektre fra YfeA prøve produceret i forbindelse med YfeBCDE. Karakteristiske toppe er mærket for mangan, jern og zink. Blå kurve. X-ray fluorescens-spektre af YfeA renset fra for rammerne af YfeBCDE og vellykkede fraktionering af periplasm fraktion med minimal kontaminering af cytoplasmatisk overgangsmetaller og/eller holo YfeA protein. Røde kurve. X-ray fluorescens-spektre af YfeA renset fra YfeBCDE forbindelse med mislykkede fraktionering fra overdreven lysis og betydelig forurening af cytoplasmatisk overgangsmetaller og/eller holo YfeA protein. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig5.jpg"> Figur 5. Generaliseret arbejdsproces til fraktionering. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig6.jpg"> Figur 6. 60 min radioaktivt metal optagelse fraktionering data. Hvert forsøg blev udført tre gange, og fejllinjer angiver standardafvigelsen. Rød bar. E. coli celler, der ikke indeholder Yfe transporter transport ca ~ 50% af 52Mn i cytoplasmaet efter 60 minutter, og opretholde lave niveauer af periplasmic 52Mn. blå bjælke. E. coli celler, der indeholder Yfe transporter transport > 90% af 52Mn i cytoplasma efter 60 minutter og opretholde lave niveauer af periplasmic 52Mn. grøn bar. E. coli celler, der indeholder kun YfeA transport ca ~ 25% af 52Mn i cytoplasmaet og bevare ~ 25% af 52Mn i periplasm efter 60 minutter.
Radiometal anvendes i dette arbejde, 52Mn (t1/2 = 5,59 d), var produceret på UAB Cyclotron facilitet (Birmingham, AL) af proton bombardement på en naturlig Cr mål og renset som tidligere rapporteret19. Forsigtig: 52Mn er en positron emitter (β+avg = 242 keV, 29,4%), og også udsender flere høje energi gammastråler med høj intensitet (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Jeg = 90.0%, 94,5%, 100%). Af disse grunde skal eksperimentet udføres efter stråling beskyttelsesprincipper af ALARA, som beskrevet ovenfor. Alle varer udpeget som radioaktivt affald bør passende indeholdt, tydeligt mærket og kasseres efter fastlagte procedurer.

Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Væsentlige Metal udbredelse i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, radioisotoper, og celle fraktionering

En protokol til udvinding af en periplasmic overgang metal anstandsdame i forbindelse med sine indfødte bindende partnere og Biofysisk karakterisering af substrat indholdet af X-ray fluorescens og radiometal optagelse er præsenteret.

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forberedelse vedhæftende celler for X-ray fluorescens Imaging af Chemical Fiksering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray af pulver i Conservation Science: Mod Rutinemæssig Krystalstrukturbestemmelse af korrosionsprodukter på Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantificere X-Ray fluorescens Data ved hjælp af kort

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrofluid Chips for In Situ Crystal røntgen diffraktion og In Situ dynamisk lysspredning for serielle krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-følsomme påvisning af kemi i batterier gennem bløde X-ray Absorption spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-medieret Nukleering og vækst af Palladium Metal nanopartikler

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Forbedre høj viskositet ekstrudering af Microcrystals for tidsopløst seriel femtosekund krystallografi på X-ray lasere

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Kvantificering af metal udvaskning i immobiliseret Metalaffinitets kromatografi

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologiske prøver Forberedelse til speciering ved kryogen temperatur ved hjælp af røntgenabsorptionsspektroskopi med høj opløsning

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...