Name: essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation
Uploaded: 2018-02-01T15:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Ook werden gegevens verzameld op GM/CA@APS, die geheel of gedeeltelijk met federale fondsen van het National Cancer Institute (ACB-12002) en het National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006) werd gefinancierd. Dit onderzoek gebruikte bronnen van de geavanceerde Photon bron (APS), een Amerikaanse Department of Energy (DOE) Office van wetenschap gebruiker faciliteit geëxploiteerd voor de DAMHINDE Office of Science door Argonne National Laboratory onder Contract nr. DE-AC02-06CH11357. Gebruik van de geavanceerde Photon bron werd gesteund door de U. S. Department of Energy, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, onder het veld Contractnr. W-31-109-Eng-38.
Wij willen erkennen de UAB uitgebreide Cancer Center - massa spectrometrie/Proteomics gedeeld faciliteit (P30CA13148-38) voor hun hulp bij de analyse van de Spectrometrie van de massa.
C.D.R. werd gesteund door een subsidie van de Universiteit van Alabama in Birmingham Office van diversiteit, eigen vermogen, en integratie. L.L.R. werd gesteund door de dienst radiologie van de Universiteit van Alabama in Birmingham. Het Department of Energy, Office of Science, Isotope programma ondersteund 52Mn productie en A.V.F.M. onder verlenen DESC0015773.

1. bacteriële Starter cultuur (dag 1)
<ol><li>In een schuine maatkolf van 200 mL beënten 30 mL Luria Bertani Bouillon (LB) met Escherichia coli stam (DE3) BL21-CodonPlus-RIPL met pYFE3 plasmide16cellen.</li>
	<li>30 µL van 50 mg/mL ampicilline Voeg aan de maatkolf door zuigen met een pipet en 200 µL tip. 'S nachts bij 225 rpm op 37 ˚C schudden.</li>
</ol>2. aangevuld M9 minimale Media voorbereiding (dag 2)
Opmerking: Dit is aangepast van de Amresco handleiding.
<ol><li>6 L van vloeibare media voor te bereiden door de volgende procedure. In een schuine maatkolf van 2 L 10,5 g M9 minimale media toevoegen aan 1 L voor Ultra zuivere H2O. autoclaaf bij 121 ˚C voor 20 min en vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Aseptisch toevoegen de volgende steriele supplement oplossingen: 2 mL/L van 1 M MgSO4, 10 mL/L van 20% w/v glucose, 0,1 mL/L van 1 M CaCl2en 1 mL/L van 50 mg/mL ampicilline. Voer deze stap in een biologische veiligheidskast om een steriele omgeving. Warm de media 37 ˚C.</li>
</ol>3. bacteriële subcultuur
<ol><li>5 mL/L van overnachting starter cultuur aan M9 minimale media toevoegen door zuigen met een geautomatiseerde pipet en 5 mL tip. Schud de subcultuur continu bij 225 t/min op 37 ˚C voor 9u. Opmerking: Tijdens deze stap is YfeABCDE overexpressie door autoinduction van de native Y. pestis promotor.</li>
	<li>Cellen herstellen door centrifugeren bij 4.500 x g gedurende 30 minuten op 4 ˚C. Resuspendeer de cellen in een ijskoude fosfaatbuffer (20 mM nb2HPO4 pH 7,6, van 50 mM NaCl) 50 mL door zuigen met een pipet en 1 mL tip, en 's nachts bevriezen bij-80 ˚C.</li>
</ol>4. cel fractionering (dag 3)
<ol><li>Ontdooi de resuspensie bij 4 ° C en pellet cellen bij 4000 x g gedurende 20 min op 4 ˚C. Resuspendeer de cellen in 50 mL ijskoud hoog zout buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl, en 2 mM EDTA) door zuigen met een geautomatiseerde pipet en 25 mL tip. Incubeer de schorsing over ijs gedurende 20 minuten, met af en toe inversie voor het mengen.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 4.500 x g gedurende 20 min op 4 ˚C. Resuspendeer de cellen in 50 mL ijskoud laag zout buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0) door zuigen met een geautomatiseerde pipet en 25 mL tip. Incubeer de schorsing over ijs gedurende 20 minuten, met af en toe inversie voor het mengen.</li>
	<li>De spheroplasts bij 4.500 x g gedurende 20 min op 4 ˚C pellet. De bovendrijvende vloeistof met periplasmaherstellen. Resuspendeer de Ingehuld spheroplasts in de fosfaatgebufferde zoutoplossing (stap 3.2) door zuigen met een geautomatiseerde pipet en 25 mL tip en lyse cellen door drie cycli van de pers van de cel van Frans druk op 1500 psi. Opmerking: De pers van de cel van een Franse druk kan lastig te bedienen en maakt gebruik van een hydraulische pomp te rijden van lysis van de cel. Ga voorzichtig te werk wanneer de uitoefening van de hydraulische pomp, waarbij de juiste uitlijning van de zuiger met de pers en houden handen vrij voor de hydraulische pomp.</li>
	<li>Pellet het cellulaire puin bij 50.000 x g gedurende 20 min op 4 ˚C. De bovendrijvende vloeistof met cytoplasmaherstellen. Indien nodig, kunnen de uiterlijke en innerlijke membranen verder gefractioneerde16.</li>
</ol>5. de eiwitreiniging met behulp van FPLC
<ol><li>Onmiddellijk na fractionering, filteren de periplasmatische breuk met behulp van een eenheid van de membraan 0,45 µm. Gebruik een Luer lock spuit filter voor gemak en snelle filtratie. Equilibreer een 5 mL Q anion wisselingskolom met behulp van 20 mM Tris pH 7,6, 0.05% w/v NaN3 laden van de buffer bij een debiet van 5 mL/min.</li>
	<li>Laden van de periplasmatische filtraat op de vooraf zijn geëquilibreerd 5 mL Q anion wisselingskolom met behulp van 20 mM Tris pH 7,6, 0.05% w/v NaN3 laden van de buffer bij een debiet van 2 mL/min. Doorgaan om te wassen van de 5 mL Q anion wisselingskolom met behulp van 20 mM Tris pH 7,6 , 0.05% w/v NaN3 laden buffer tot een lezing van de basislijn van de A280 wordt bereikt bij een debiet van 5 mL/min.</li>
	<li>Elueer de afhankelijke eiwitten met behulp van 20 mM Tris pH 7,6, 0.05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl door lineaire kleurovergang meer dan 10 kolom volumes bij een debiet van 5 mL/min. combineren breuken met een280 piek. APO YfeA GC tussen 200 mM NaCl en 300 mM NaCl.</li>
	<li>Concentreren het eluaat door centrifugaal concentrator totdat het volume ~ 5 mL bereikt.</li>
	<li>Equilibreer een Superdex 200 pg gel filtratie kolom met 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 50 mM NaCl, 0.05% w/v NaN3 gel filtratie buffer bij een debiet van 2.5 mL/min.</li>
	<li>Lading het geconcentreerde anion eluaat op de pre equilibrated Superdex 200 pg gel filtratie kolom uit te wisselen en zuiveren met behulp van gel filtratie buffer van stap 5.5 bij een debiet van 2.5 mL/min. combineren breuken met een piek van de280 overeenkomt met een ~ 30 kilodalton (kDa) eiwit. Opmerking: De volgende verwijzing is een voorbeeld FPLC experiment om aan te tonen van de protocol-17.</li>
</ol>6. eiwit kristallisatie
<ol><li>Het concentreren van het eluaat filtratie gel door centrifugaal concentrator tot een definitieve eiwitconcentratie van 22 mg/mL.<ol>
<li>Bereken de concentratie van de eiwitten door het verdelen van de A-280 lezen door 1.276 mg/mL. Deze coëfficiënt theoretische uitsterven werd voorspeld door ExPASY ProtParam18. Opmerking: Een A280 monster lezing van 5.104 AU correspondeert met een oplossing van 4.000 mg/mL; 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4.00 mg / mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix-1.5 µL van eiwit met 1,5 µL van 30% w/v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 0.05% w/v NaN3 in drop zit of opknoping drop setup door zuigen met een pipet en 10 µL tip.</li>
	<li>Incubeer kristallisatie druppels bij 293 K voor 2-4 weken.</li>
	<li>Flash-freeze kristallen in vloeibare stikstof zwembad voor verzending naar de synchrotron.</li>
</ol>7. Röntgen fluorescentie (met behulp van GM/CA Beamline Software)
<ol><li>Navigeer naar het hok tab. Gebruik de onderverdeling van energie om energie te 10.0 keV.</li>
	<li>Navigeer naar de scannen tab. navigeren aan het Interactive tab. Mount monster.</li>
	<li>Selecteer het optimaliseren fluorescentie signaal. Input 4.00 s onder de onderverdeling van de tijd . Selecteer nemen fluorescentie spectrum. Bekijk het via tabblad Plot spectrum.</li>
</ol>8. MAD Scan voor metaal energie absorptie piek (met behulp van GM/CA Beamline Software)
<ol><li>Verplaats het monster uit de bundel. Navigeer naar de scannen tab. navigeren naar de periodieke tabel tab. Selecteer de K-edge van element van belang. Opmerking: De energetische waarde in energie onderverdeling is in eV.</li>
	<li>Navigeer naar het hok tab. Gebruik de onderverdeling van energie energie instellen op waarde in stap 8.1 in keV.</li>
	<li>Het monster naar de balk te verplaatsen. Navigeer naar de scannen tab. navigeren naar de Auto tab. Input 2,00 s onder de onderverdeling van de tijd .</li>
	<li>Selecteer Start Scan. Bekijk de MAD-Scan met behulp van het tabblad uitzetten . Opmerking: De energiewaarde in de piek -onderverdeling is in eV in plaats van keV.</li>
	<li>Selecteer Done met fluorescentie.</li>
	<li>Verplaats het monster uit de bundel. Navigeer naar het hok tab. Gebruik de onderverdeling van energie energie instellen op waarde in stap 8.4 afgerond op de volgende eV (dat wil zeggen, piek: 9658.3 eV, energie ingesteld op 9659 eV).</li>
	<li>Het monster naar de balk te verplaatsen. Het verzamelen van gegevens. Herhaal stap 8.1-8,6 voor alle metalen van belang.</li>
</ol>9. analytische Protocol voor radioactief metalen opname Assay
<ol><li>In een tube van de cultuur 14 mL beënten met E. coli stam BL21-CodonPlus (DE3) 5 mL voor LB-RIPL cellen met pYFE3 plasmide16. Voeg 5 µL van 50 mg/mL ampicilline door zuigen met een pipet en 10 µL tip. Schudden bij 225 rpm op 37 ˚C voor 7 h.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur met behulp van een tafelblad centrifuge. Het wassen van de cellen in 1 mL aangevuld M9 minimale media door zuigen met een pipet en 1 mL tip. Eenmaal herhaald.</li>
	<li>In een conische buis van 50 mL, subcultuur cellen in 30 mL aangevuld met M9 minimale media zuigen met een pipet en 1 mL tip. Schudden bij 225 rpm op 37 ˚C voor 9u.</li>
	<li>Het bepalen van de hoeveelheid radioactiviteit moet bereiken ongeveer 100.000 tellingen per minute (cpm). Opmerking: Dit zal variëren afhankelijk van de isotoop en instrument dat wordt gebruikt voor de detectie. Bijvoorbeeld, geeft een monster met 7.4 kilobecquerel (kBq) (0.2 microcurie (µCi)) van 52Mn een lezing van 550.000 cpm op een geautomatiseerde gamma detector (NaI). Zo kan de hoeveelheid radioactiviteit die nodig zijn om een telling van 100.000 cpm worden bepaald met behulp van de volgende vergelijking: (100.000 cpm/550.000 cpm) * 7.4 kBq (0.2 µCi) = 1,35 kBq (0.036 µCi). Let op: radioactief verval resulteert in het vrijkomen van ioniserende straling, die gevaarlijk is. Bij het werken met radioactiviteit altijd gebruik maken van de juiste shielding en volg de beginselen van als laag als redelijkerwijs haalbaar (ALARA) door toenemende afstand en afscherming terwijl het verminderen van de blootstellingstijd. Alleen getrainde personeel moeten omgaan met radioactiviteit in speciaal aangewezen laboratoria, die zijn gelicentieerd voor het gebruik van radioactieve materialen.</li>
	<li>Vermenigvuldig de vereiste radioactiviteit in stap 9.4 berekend door de totale hoeveelheid subcultuur, om te bepalen van de totale hoeveelheid radioactiviteit noodzakelijk. Dit bedrag (bij voorkeur in een klein volume van 50-100 µL) toevoegen aan de buis met de subcultuur zodat er 100.000 cpm/mL, en vortex goed voor 30 s. Opmerking: Voor 31 mL subcultuur is de totale hoeveelheid radioactiviteit vereist 1.35 kBq (0.036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1.12 µCi).</li>
	<li>Aliquot 1 mL van de subcultuur (nu met radioactieve tracer) in individuele 1,5 mL centrifuge buizen door zuigen met een pipet en 1 mL tip, en plaats in een 37˚C thermomixer, met vortexing op 1 × g. opnemen genoeg buizen zodat er drie repliceert voor elk gewenst meting, alsmede drie extra wordt gerepliceerd naar gebruiken als normen (de normen gereserveerd, presteren niet de fractionering bepaling betreffende de normen). Opmerking: Keuring op 1, 2 en 4 h 12 buizen totale zou vereisen.</li>
	<li>Na incubatie, centrifugeer de buizen bij 15.000 × g gedurende 30 s met behulp van een benchtop centrifuge (bij voorkeur gekoeld tot 4 ˚C) en gooi het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 1 mL ijskoud, hoge zout buffer (stap 4.1) door zuigen met een pipet en 1 mL tip, en onmiddellijk op het ijs gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Pellet de cellen opnieuw bij 15.000 × g gedurende 30 s met behulp van een benchtop centrifuge (bij voorkeur gekoeld tot 4 ˚C) en gooi het supernatant. Opmerking: Het supernatant bevat niet-gekoppelde vrije metaal.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in ijskoud, zoutarm buffer (stap 4.2) door zuigen met een pipet en 1 mL tip en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Opmerking: Het is belangrijk dat zachtjes gecombineerd via pipet voor deze stap.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 15.000 × g gedurende 30 s, en verzamelen elke van het supernatant in nieuw 1,5 mL Centrifugeer buizen. Nu moet er zes buizen per tijdstip. Opmerking: Het supernatant bevat de periplasmatische breuk en de pellet de membraanachtig en cytoplasmatische breuk. Als de cytoplasmatische breuk verwijzen we naar de pellet.</li>
	<li>Het meten van de radioactiviteit in elke fractie (zes buizen per tijdstip), alsmede in de normen die in stap 9.6 gereserveerd. De hoeveelheid radioactiviteit in de normen gebruiken om te bepalen van de totale hoeveelheid radioactiviteit oorspronkelijk toegevoegd aan elk monster.</li>
	<li>Om te bepalen van het percentage van radioactieve opname in het periplasma, gebruiken de volgende vergelijking: (gemiddelde cpm van periplasmische breuk/gemiddelde cpm van normen) x 100.</li>
	<li>Om te bepalen van het percentage van radioactieve opname in het cytoplasma, gebruiken de volgende vergelijking: (gemiddelde cpm van de cytoplasmatische breuk/gemiddelde cpm van de normen) x 100.</li>
	<li>U kunt vaststellen % totale opname, met de volgende vergelijking: ((gemiddelde cpm van de periplasmatische breuk + de gemiddelde cpm van de overeenkomstige cytoplasmatische breuk) / (gemiddelde cpm van de normen)) x 100.</li>
</ol>

<ol>
	<li>ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity+of+ABC+transporters.">Structural diversity of ABC transporters.</a> J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).</li><li>Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+classification+of+substrate-binding+proteins.">A structural classification of substrate-binding proteins.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).</li><li>Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hinge-bending+in+L-arabinose-binding+protein.+The+&amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34;+model.">Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The &amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34; model.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).</li><li>Hoeppner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+and+Their+Ligands:+Their+Importance+and+How+to+Crystallize+Them.">Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them.</a> Advanced Topics on Crystal Growth. , (2013).</li><li>Lee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Zn(II)-free+Treponema+pallidum+TroA,+a+periplasmic+metal-binding+protein,+reveals+a+closed+conformation.">The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).</li><li>Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+regulatory+role+for+the+histidine-rich+loop+in+the+zinc+transport+protein,+ZnuA.">Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA.</a> Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).</li><li>Yatsunyk, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+metal+binding+properties+of+ZnuA,+a+periplasmic+zinc+transporter+from+Escherichia+coli.">Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli.</a> J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).</li><li>McDevitt, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+for+bacterial+susceptibility+to+zinc.">A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc.</a> PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).</li><li>Cou&#241;ago, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imperfect+coordination+chemistry+facilitates+metal+ion+release+in+the+Psa+permease.">Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease.</a> Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).</li><li>Abate, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo,+Zn2+-bound+and+Mn2+-bound+structures+reveal+ligand-binding+properties+of+SitA+from+the+pathogen+Staphylococcus+pseudintermedius.">Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius.</a> Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).</li><li>Ahuja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+bacterial+ABC+transporter+inhibition+by+an+antibody+fragment.">Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment.</a> Structure. 23 (4), 713-723 (2015).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+Cells.">Fractionation of Cells.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Zhao, H., Martinis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacterial+compartments+to+track+movement+of+protein+synthesis+factors.">Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors.</a> Methods. 113, 120-126 (2017).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).</li><li>Radka, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Yersinia+pestis+virulence+factor+YfeA+reveals+two+polyspecific+metal-binding+sites.">Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).</li><li>Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Scale+Production+and+Purification+of+a+Therapeutic+Antibody.">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J Vis Exp. (119), e55153 (2017).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+PET+Imaging+of+pharmacokinetics+of+manganese+in+mice+using+Manganese-52.">Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52.</a> PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).</li><li>Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transferrin-independent+iron+transport+in+K562+cells.+Unique+properties+provide+evidence+for+multiple+pathways+of+iron+uptake.">Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake.</a> J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).</li><li>Makui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Escherichia+coli+K-12+Nramp+orthologue+(MntH)+as+a+selective+divalent+metal+ion+transporter.">Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter.</a> Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).</li><li>Forbes, J. R., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron,+manganese,+and+cobalt+transport+by+Nramp1+(Slc11a1)+and+Nramp2+(Slc11a2)+expressed+at+the+plasma+membrane.">Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane.</a> Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze hebben geen conflicten van belang.

Cel fractionering is een nuttig hulpmiddel voor specifiek het sonderen van de inhoud van een cellulaire compartiment, en kan dienen als een nuttig instrument voor het extraheren van kleine molecules zoals metalen atomen, evenals macromoleculen zoals eiwitten. Het is vermeldenswaard dat cel fractionering is niet een absolute techniek en foutgevoelig zonder zorgvuldige aandacht voor mengen/resuspensie, incubatietemperatuur en incubatietijd kan worden. Onvolledige mengen kan leiden tot minimale membraanachtig lysis en dus te verwaarlozen fractionering, fractionering bij kamertemperatuur kan leiden tot snelle lysis van beide membranen leidt tot verontreiniging van de periplasmatische breuk met cytoplasmatische inhoud, en uitgebreide incubatie keer kunnen ook leiden tot lysis van de buitensporige en dus verontreiniging van de breuk. Een redelijk compromis voor het bereiken van lysis van de efficiënte en relatief volledige buitenmembraan (behoud van het binnenste membraan) is 20 minuten incubatie over ijs in de buffer hypotone fractionering. Een andere overweging is de methode van extractie, harde extractie door schudden of vortex gevaar waar de kwaliteit van het extract zoals veroorzaakt aggregatie van eiwitten. Het is aanbevolen om het mengen zachtjes zoals door spatel, inversie of zuigen Pipetteer te handhaven van hoge kwaliteit materiaal voor downstream-analyse. Zuivering van preparatieve cel fractionering kan optreden met variabele efficiëntie, zoals blijkt uit Figuur 1. In één experiment, YfeA begon als 8% van het uitgepakte periplasmische gehalte (Figuur 1 c), terwijl in een ander experiment, YfeA begon als 17% van het periplasmische gehalte (Figuur 1 d). Deze verschillen kunnen voortvloeien uit verschillende redenen zoals variabele expressie omstandigheden (toevoegend EDTA tot de groei-media kan verhogen expressie van genen gereguleerd door honger mechanismen zoals bont regulering van de Yfe-promotor), herhaald gebruik van bevroren permanente voorraden, en menselijke fouten. In plaats van de incubatie tijden aan te passen, is het aanbevolen om schaalvergroting de voorbereiding. Zuivering uit het periplasma afvalfractie wordt aanbevolen om het opnemen van een lineaire gradiënt elutie uit de anion uitwisseling chromatografische stap. Een kleurovergang elutie van stap is een elutie strategie de toepassingen discrete en abrupte veranderingen in de samenstelling van de mobiele fase (dwz., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, enz.). Een lineaire gradiënt elutie is een elutie strategie die gebruikmaakt van geleidelijke verandering in de mobiele fase samenstelling (dat wil zeggen, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, enz.). Een stap-verloop is nuttig voor het scheiden van moleculen die verschillende affiniteiten voor de stationaire fase hebben, en een lineaire gradiënt elutie is handig voor het scheiden van moleculen die soortgelijke affiniteiten voor de stationaire fase hebben. In het geval van het zuiveren van eiwit met geen kunstmatige zuivering tag (om affiniteit voor de stationaire fase) van een cel compartiment die rijk is aan uniek eiwit soorten, wordt een lineaire gradiënt elutie aanbevolen aan afzonderlijke proteïnen van noninterest die hebben dezelfde affiniteiten met de stationaire fase als de proteïne van belang. In het algemeen, een rendement van 1-2 mg van gezuiverde apo YfeA verwachting uit elke liter cultuur uiten van YfeA van de endogene Y. pestis promotor.
Röntgen fluorescentie is een techniek waarmee de onderzoeker snel bepalen van metalen inhoud in een monster en de onderzoeker informeren over onverwachte metalen opname die anders onbekend zijn zou. Hoewel EDTA is opgenomen in de buffer van de hypertonic fractionering verwijderen losjes-geassocieerde of gratis metal, kan YfeA afgeleid van het periplasma breuk bevatten sommige holo-eiwit. Gezien het feit dat metalen vervoer een dynamisch proces is, misschien het eiwitgehalte holo afkomstig is van YfeA die zijn lading te YfeBCDE niet nog heeft gedoneerd. Het is vermeldenswaard dat X-ray fluorescentie alleen metalen totaalgehalte maatregelen en niet geeft als metaal is besteld in een kristalrooster, of specifiek aan een eiwit gebonden. Om te bepalen als metaal is besteld in een kristalrooster en/of specifiek aan een eiwit molecule gebonden, is X-ray scattering gegevensverzameling en -verwerking vereist. Echter zorgt Röntgen fluorescentie voor snelle monster beoordeling van metalen besmetting en/of residuele holo eiwit integratie. Synchrotronstraling tijd is beperkt en er is niet altijd tijd om een strategie uitstippelen voor het verzamelen van X-ray scattering gegevens op elke steekproef, Röntgen fluorescentie is dus een waardevolle techniek voor het screenen van vele kristallen en prioriteren welke monsters X-ray verstrooiing gegevens moeten worden verzameld. Röntgen fluorescentie maakt bovendien gegevensverzameling van monsters die kan niet de diffract van x-stralen. Terwijl de Röntgen fluorescentie gegevens verzamelt, soms het signaal kunnen zeer zwak en de resulterende spectra uninformative. Ter verbetering van de sterkte van het signaal, hetzij voor X-ray fluorescentie- of MAD scannen, kunt u de belichtingstijd te verhogen en/of minderen de X-ray beam demping. Wanneer een monster wordt geïdentificeerd voor X-ray scattering gegevens te verzamelen, is het raadzaam X-ray scattering gegevens te verzamelen over een ander deel van het monster dan wat werd gebruikt voor X-ray fluorescentie en MAD scannen naar het minimaliseren van de schade door straling, verbetering van de kwaliteit van de gegevens collectie, en minimaliseren van eventuele voor vermindering van abnormale signaal.
Detectie van radioactieve tracers vereist nanomolar hoeveelheden materiaal of minder, en het gebruik van deze verklikstoffen als gemachtigden van de moleculaire tracking biedt een eenvoudige en uiterst gevoelige methode van het sonderen van cellulaire processen. De bepaling van de radiometal hierboven beschreven kan worden gebruikt om te bepalen van de totale metalen opname, verdeling over cellulaire compartimenten, evenals de tarieven van de opname. Inderdaad, elk gegevenspunt tijd vereist een 40 minuten fractionering; zoals elk tijdstip is bereikt, zijn cellen echter onmiddellijk Ingehuld en geïncubeerd in hoge zout buffer (Figuur 5stap 1). Metingen van de Radiometal van de media, afgedankte hoog zout buffer (Figuur 5stap 1) en periplasmische en cytoplasmatische breuken na (Figuur 5stap 3) geven dat de hoge zout buffer incubatie met succes worden alle wijzigingen verwijderd overige niet-gekoppelde gratis metaal dat blijven na de initiële centrifugeren hangen na het bereiken van het punt van de tijd. De eerste centrifugeren wordt verwijderd meeste (tot wel 80%) van de niet-geassocieerde gratis metalen, alsmede het centrifugeren incubatie in de hoge zout buffer verwijdert ook extra resterende niet-gekoppelde vrije metaal. Aanhoudende bestandsnaamkoppeling gratis metalen zal naar verwachting aanzienlijk beïnvloeden metalen vervoer tijdens de fractionering 40 minuten. De invloed van de 40 minuten fractionering op intracellulair metalen transport is een andere overweging voor voorzichtige data interpretatie. Vrijwel het gehele fractionering protocol vindt plaats via ijs, afgezien van de 30 tweede centrifugeren tussen stappen. Metalen transporttijd cursus experimenten hebben aangegeven dat het behoud van de cellen bij 4 ° C metalen vervoer20,21,22 intrekt; Daarom, omdat de experimenten plaatsvindt over ijs, de 40 minuten fractionering is naar verwachting niet metalen niveaus in het periplasma van cytoplasma aanzienlijk te vergroten en de metalen niveaus moeten representatief zijn voor de tijdstippen waarop de cellen werden in eerste instantie centrifugalized.
Bepaling van de relatieve opname in andere cellulaire compartimenten kan helpen XFS gegevens informeren, bevestigen de fysiologische aard van een substraat, alsook inschakelen van de onderzoeker om verdere sonde de moleculaire details van een mechanisme. Bijvoorbeeld, toevoeging van genetische mutagenese radiometal opname experimenten biedt een directe methode ter versterking van de belangrijkste functionele residuen of moleculen betrokken bij substraat vervoer. Voordelen van radiometal opname experimenten en analyses zijn snelle turnaround, hoge doorvoer, hoge reproduceerbaarheid en paralellisatie van experimenten vergelijken groei omstandigheden en genetische constructies.

Bij gram-negatieve bacteriën, zijn cytoplasmatische zwembaden van overgangsmetalen atomen verhoogd en aangevuld door de binnenste membraan ABC (ATP-binding cassette) importeurs die metalen translocatie over het binnenste membraan verzachten. Periplasmische Cluster A-1 substraat-bindende proteÃ¯nen (SBPs) vormen een groep van chaperones die de metalen atomen direct binden en ferry hen via het periplasma te leveren aan cognaat ABC importeurs1. Andere Clusters van SBPs zijn speciaal voor het vervoer van substraten, zoals chelaatvormige metaal (Cluster A-2), koolhydraten (Clusters B en D-1) en aminozuren (Clusters B, C, F-2 en F-4); Toch volgen de SBPs ongeacht substraat, een evolutionair geconserveerd c-clamp Vouw2. De veralgemeende voorgestelde mechanisme voor de SBP substraat overdracht omvat de c-klem ondergaan een aantal bochten die lijken op een Venus flytrap3. Cluster A-1 SBPs zuiveren in het algemeen, in de vorm van een holo (metaal-bound), hoewel de studie van deze SBPs wordt beperkt door de moeilijkheid bij het genereren van apo (metaalvrije) vormen van eiwit voor experimenten4. Tot op heden, strategieën te bestuderen apo Cluster A-1 SBPs zijn beperkt tot mutagenese, dialyse, en gedeeltelijke denaturatie met ethyleendiamminetetra zuur (EDTA) complexvormer5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. structurele gegevens die afkomstig zijn van deze experimenten blijkt dat Cluster A-1 SBPs niet juist het Venus flytrap mechanisme kan volgen. Momenteel ontbreekt in de literatuur is een methode voor de productie van apo Cluster A-1 SBPs in vivo gebruikmaakt van fysiologische bindende partners.
We laten zien voor de eerste keer met behulp van cel fractionering te zuiveren van YfeA, een Cluster A-1 SBP van Yersinia pestis, het etiologische agens van Pest, die werd omgebouwd tot het apo-formulier via interactie met zijn fysiologische cognaat YfeBCDE ABC-importeur in de cel. Wij tonen dat yfea is in de vorm van de apo door energie-dispersive X-ray spectroscopie (EDS), ook bekend als X-ray fluorescentie. We tonen ook YfeBCDE functionaliteit door het combineren van cel fractionering met hooggevoelige radioactief metalen opname studies onderscheid maken tussen metalen opname over de buitenmembraan en metalen importeren in het binnenste membraan. Het gebruik van een radioactieve tracer maakt het mogelijk voor de detectie van pg/L hoeveelheden metalen, veel lager is dan de limiet van detectie voor dergelijke technieken als inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of atomaire absorptie spectroscopie (AAS). Dit zorgt voor minimale verstoring van het systeem wordt bestudeerd. Bovendien vereisen de traditionele methoden die vaak grotere hoeveelheden van het monster, extra nabewerkingen en langere turn-around tijden, die niet typisch voor radiotracer testen zijn. Het biedt dus een handige en eenvoudige methode voor het toezicht op metalen distributie en opname binnen een cel met behulp van een radiotracer. Het moet nog worden vastgesteld als een apo die cluster A-1 SBP geproduceerd met behulp van deze methode de structurele observaties van de huidige praktijken gebruikt voor het genereren van apo eiwit zou echo.
Cel fractionering is een gevestigde methode voor het scheiden van cellulaire compartimenten impliciete ten behoeve van specifiek indringende hun inhoud in isolatie12. Cel fractionering wordt vaak gebruikt om te bevestigen de locatie van een molecule tijdens de celcyclus of meten van de activiteit van een bepaalde compartiment13. Bijvoorbeeld, kan metalen vervoersactiviteit vehiculumcontrolegroep worden door indringende cellulaire compartimenten voor metalen substraat. Integratie van cel fractionering maakt onderscheid en vergelijking tussen metalen opname over de buitenmembraan en metalen overdracht over het binnenste membraan. Deze processen kunnen dan op hun beurt na verloop van tijd worden gemeten. In het geval van EiwitReiniging, de meest voorkomende methoden van lysis van de cel en scheiding van oplosbare componenten van onoplosbare componenten zijn mechanische storingen (dat wil zeggen, malen, het mengen), hogedruk homogenisering (, de pers van de cel van de Franse druk, cel ontregelt), en ultrasone frequenties (dwz., ultrasoonapparaat)14. Gebruik van ultrasone frequenties lyse cellen is over het algemeen geschikt voor kleine volumes; echter, ultrasoonapparaat is bekend voor het genereren van warmtebronnen die kan het denatureren van eiwit. Om te voorkomen dat het genereren van extreme hitte, worden ultrasone frequenties meestal toegepast in sequentiële korte uitbarstingen, die kunnen worden tijdrovend en per ongeluk het degraderen van DNA moleculen in kleinere fragmenten. Bovendien kunnen meerdere dure ultrasoonapparaat sondes worden verlangd voor voorbereidende en analytische experimenten, als elke sonde heeft een beperkt bereik voor het monstervolume dat kan worden verwerkt. Gebruik van hoge druk lyse cellen voorkomt het genereren van overmatige hitte tijdens lysis van de cel door druk van de Franse pers celbestanddelen voorafgaand aan cellysis koelen of die een disruptor cel in een koude omgeving zoals een koude kamer. Zoals ultrasoonapparaat sondes wellicht meerdere sets van Franse druk celbestanddelen press worden gekocht om te verwerken van een breed scala van monster volumes. Franse druk de pers van de cel assemblages zijn eenvoudig aan te sluiten maar lastig te bedienen en te reinigen, kan zwaar om te verplaatsen en zijn gevoelig voor de verstopping van dichte monsters. Voordelen van het gebruik van ultrasone frequenties en hogedruk systemen lyse cellen bevatten veel monsters herstel, mogelijkheid voor het verwerken van meerdere monsters met minimale kruisbesmetting, en verstelbare schuintrekken van kracht, die kunnen worden aangepast voor lysis van de optimalisering van een breed scala van soorten van de steekproef. Optimalisatie kan optreden door het aanpassen van de ultrasone frequentie, duur van de uitbarstingen, zuiger druk pond per vierkante inch (psi), en aantal passeert de pers. Gebruik van mechanische verstoring van lyse cellen kan de technisch meest triviale en minst dure strategie voor lysis van de cel. Mechanische verstoring kan uitdagingen aanwezig in monster herstel en is niet ideaal voor de verwerking van meerdere monsters. Mechanische verstoring is zachter aan samples dan hoge druk of ultrasone frequenties, maar is niet hoge doorvoer en is vatbaar voor lysis van de inefficiënte. Een belangrijke experimentele beperking van de verstoring van de mechanische, hogedruk homogenisering en ultrasone frequenties, is de oncontroleerbare verstoring van de gehele cellulaire architectuur zodanig dat na lysis, alle waterige cel componenten worden gemengd samen. Bovendien, alle compartimenten van de cel niet verstoren op hetzelfde moment; inhoud van compartimenten die vroeg lyse kunnen daarom onderworpen aan voortdurende ontwrichtende krachten langer dan de inhoud van de compartimenten die lyse laat. Cel fractionering maakt goedkope, technisch eenvoudig, efficiënt compartiment gebaseerde scheiding van celinhoud terwijl het vermijden van de noodzaak voor dure apparatuur en monster blootstelling aan harde, ontwrichtende krachten.
In het geval van de SBP, geïmporteerde substraat is opnieuw naar potentieel apo eiwit en regenereert holo eiwit tijdens cellysis, voorafgaand aan downstream chromatografie of andere zuivering technieken. Opneming van de complexvormer EDTA tijdens cellysis is een extra belemmering, waar metalen affiniteit als een eerste stap van eiwitreiniging niet mogelijk is omdat EDTA zal strippen van metaal uit de hars van de chromatografie en voorkomen van eiwit bindend15. Een eenvoudige en goedkope oplossing is cel fractionering door osmotische schok, waar differentiële centrifugeren en gemeenschappelijke laboratoriumreagentia de onderzoeker zorgvuldig uitpakken van voldoende eiwit voor functionele analyse toelaten. Osmotische schok fractionering maakt gebruik van een tweestaps verandering in de osmotische druk om te scheiden van de cellulaire compartimenten. In de eerste plaats een hypertonic buffer cellen veroorzaakt om crenate zoals water elke cel verlaat en anderzijds een hypotone buffer cellen te zwellen als water opnieuw elke cel binnenkomt veroorzaakt. Door een zorgvuldige controle hoe lang de cellen zwellen, de buitenste membranen kunnen selectief worden lysed (als gevolg van de ophoping van de osmotische druk van het inkomende water), dus de inhoud in de buffer leegmaken. Behoud van de innerlijke membranen zorgt ervoor dat de cytoplasmatische inhoud worden bewaard in spheroplasts, en gemakkelijk van periplasmische inhoud door middel van centrifugeren gescheiden zijn.
YfeA is een polyspecific SBP staat van bindende ijzer, mangaan en zink atomen16. De relatieve verhoudingen van opgenomen metaal kan worden gewijzigd volgens metalen suppletie tijdens de groei, en vehiculumcontrolegroep door Röntgen fluorescentie zoals is beschikbaar bij Argonne National Laboratory's geavanceerde Photon bron16. Röntgen fluorescentie in staat stelt de onderzoeker om snel een brede vergadering van metalen zonder de noodzaak voor grote of diffractie kwaliteit kristallen, en kan zelfs het achterhalen van gegevens uit eiwit neerslag of eiwithoudende oplossing.
Röntgen fluorescentie kan snel onthullen onverwachte resultaten zoals, in dit geval de primaire YfeA substraat wordt zink en niet de gedocumenteerde fysiologische substraten ijzer of mangaan16. Gebruikt voor het verzamelen van X-ray scattering gegevens, kan Röntgen fluorescentie de onderzoeker in de proefopzet, zoals welke metalen energie edge(s) om te gebruiken voor abnormale verzamelen van de gegevens van de verstrooiing van de X-ray informeren. Net zo nuttig als het bepalen van de relatieve overvloed van een metaal, X-ray-fluorescentie kunt ook bepalen of een metaal afwezig in een steekproef, bieden een snelle methode kristallen die apo eiwitten uit holo eiwitten bevatten, en het schatten van metaal te scheiden signaalsterkte zonder de behoefte aan tijdrovende gegevensverwerking. Bij het identificeren van een monster met een sterk signaal van de metalen, kan de exacte golflengte te gebruiken voor abnormale X-ray scattering gegevensverzameling worden bepaald door meerdere-golflengte abnormale dispersie (MAD) scan.
Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om te helpen nieuwe onderzoekers met succes uitvoeren van cel fractionering en maak effectief gebruik van synchrotron beamline hardware profile metalen totaalgehalte en verder van de studie van metaal-bindende proteÃ¯nen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1097270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO M9 Medium Broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9688886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, White Powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>230280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation

We tonen een schaalbare methode voor de scheiding van de bacteriële periplasma van het cytoplasma. Deze methode wordt gebruikt voor het zuiveren van de periplasmatische eiwitten ten behoeve van biofysische karakterisering en maatregel substraat overdracht tussen periplasmische en cytoplasmatische compartimenten. Door de tijd die het periplasma is gescheiden van het cytoplasma zorgvuldig te beperken, kan de experimentator pak de proteïne van belang en gehaltebepaling van elk compartiment afzonderlijk voor substraat zonder "Carry-over" besmetting tussen compartimenten. De uitgepakte eiwit uit fractionering kan vervolgens verder worden geanalyseerd voor driedimensionale structuurbepaling of substraat-bindende profielen. Als alternatief, kan deze methode worden uitgevoerd na incubatie met een radiotracer te bepalen totale percentage opname, evenals de verdeling van de tracer (en vandaar metal vervoer) over verschillende bacteriële compartimenten. Experimenten met een radiotracer kan helpen onderscheid maken tussen een fysiologische substraat en artefactual substraat, zoals die door mismetallation veroorzaakt.
Röntgen fluorescentie kan worden gebruikt om te ontdekken van de aanwezigheid of afwezigheid van metalen opneming in een steekproef, evenals wijzigingen voordoen bij de opneming van de metalen als een product en/of groei voorwaarden, voorwaarden van zuivering, kristallisatie voorwaarden meten. Röntgen fluorescentie biedt ook een relatieve maatstaf voor overvloed voor elk metaal, die kan worden gebruikt om te bepalen van de beste metalen energie absorptie piek te gebruiken voor abnormale verzamelen van de gegevens van de verstrooiing van de X-ray. Radiometal opname kan worden gebruikt als een methode om te valideren van de fysiologische aard van een substraat gedetecteerd door Röntgen fluorescentie, evenals het ondersteunen van de ontdekking van nieuwe substraten.

SDS-pagina gel en gel filtratie chromatogrammen werden verzameld om te evalueren van de kwaliteit van eiwitreiniging van preparatieve periplasma fractionering. De zuivering van holo die yfea al eerder beschreven16; de zuivering van apo YfeA heeft echter niet gemeld. De strategie voor het zuiveren van apo YfeA beschreven door deze methode gebruikt een recombinant wild type constructie die bevat geen een affiniteit tag van welke aard ook, met name een die kan worden gebruikt voor eiwit immunoblot (dat wil zeggen, zijn-tag), en een monoklonaal antilichaam dat herkent dat yfea is niet beschreven. Massaspectrometrie analyse werd daarom gebruikt om te controleren of de reiniging van YfeA. Als u wilt zuiveren YfeA door fractionering, is het aanbevolen om het gebruik van een lineaire elutie verloop voor anion uitwisseling chromatografie (Figuur 1). Het verloop van de lineaire elutie verbetert aanzienlijk YfeA verrijking van ongeveer 8% van de breuk periplasma aanbrengen van 49% van het anion exchange product zoals berekend door densitometrie (Figuur 1 c). Deze compositie is verbeterd tot 61% door gel filtratie en het elutievolume van de apo-proteïne is identiek aan het elutievolume van het holo-eiwit (Figuur 2). Massaspectrometrie analyse wordt gecontroleerd of de zuivering van YfeA door middel van detectie van 92,5% van de volgorde van de aminozuur YfeA, 246 totale YfeA polypeptide spectra, 24 unieke peptiden en 50 unieke polypeptide spectra. Als alternatief, om de lineaire gradiënt product met het product uit een stap kleurovergang elutie daarentegen was YfeA gezuiverd door anion exchange via een wassen stap van 50 mM NaCl gevolgd door een stap van de elutie van 250 mM NaCl (Figuur 1 d). Het verloop van de stap verrijkt marginaal YfeA van 17% van de breuk periplasma tot 18% van het anion exchange product zoals berekend door densitometrie componeren. De kleurovergang elutie stap verrijkt ook een eiwit verontreinigingen band die massaspectrometrie geïdentificeerd als met meerdere E. coli SBPs met soortgelijke molecuulgewicht. Vanwege de beperkte resolutie van de HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, gelijkenis in het molecuulgewicht en de structuren van de besmettende SBPs, verbeterd gel filtratie marginaal YfeA verrijking tot 20% van de gel filtratie product. Moet een lineaire elutie verloop onbereikbaar voor anion uitwisseling, is het aanbevolen om het verkennen van meerdere stap wast in 25-50 mM NaCl stappen te identificeren van de concentratie van NaCl moeten deze verontreinigingen te verwijderen.
Gezuiverde apo en holo YfeA kristalliseren in dezelfde kristallisatie voorwaarden, hoewel afbeeldingen van apo en holo YfeA crystal morphologies tonen verschillen in kristalgroei apo en holo YfeA Staten (Figuur 3). Naast massaspectrometrie verificatie bevestigd X-ray diffractie (niet afgebeeld) verzamelde gegevens uit gegroeid van eiwit gezuiverd door deze methode kristallen de zuivering en kristallisatie van YfeA. De omvang van compartiment besmetting (cytoplasmatische zink apo aan holo proteïne in het periplasma fractie terug te keren) kan worden geëvalueerd door het vastleggen van Röntgen fluorescentie spectra (Figuur 4). Gezien het feit dat zink het primaire substraat gebonden aan recombinante YfeA16 is, Röntgen fluorescentie spectra snel onderscheid kunnen maken tussen een steekproef van de YfeA met een sterke zink signaal afgestemd holo YfeA (figuur 4A), indicatief voor grensoverschrijdende verontreiniging, of een zwak zink signaal suggestief van apo YfeA en minimale kruisbesmetting (figuur 4B). ICP-MS analyse van de M9 minimale media bevestigd overgangsmetalen niveaus zijn in de sub-micromolar bereik (niet afgebeeld); Daarom, detectie van slechts minimale hoeveelheden van overgangsmetalen mag worden verwacht dat na een succesvolle fractionering. Analytische fractionering (Figuur 5) kan worden gebruikt voor het meten van radiometal vrachtprijzen en functionele gegevens vastleggen. Een 60 minuten durende momentopname vergelijken periplasmische en cytoplasmatische breuken van E. coli cellen uiten YfeA enige, de volledige YfeABCDE vervoerder en geen van de componenten van de YfeABCDE toont de gevolgen van het uiten van een enkele recombinant eiwit of eiwit complex op metalen opname (Figuur 6). E. coli cellen uiten geen recombinant eiwit vervoerd ongeveer de helft van de 52Mn toegevoegd aan de media naar het cytoplasma met minimale retentie in het periplasma. Deze negatieve controle vertegenwoordigt endogene mangaan vervoer. E. coli cellen uiten van recombinante YfeA vervoerd ongeveer een kwart van de 52Mn toegevoegd aan de media naar het cytoplasma met een ander kwartaal behouden in het periplasma. Mangaan retentie in het periplasma en beperkte vervoer in het cytoplasma toont de metabole vraag en knelpunt opgelegd door het produceren van YfeA in de afwezigheid van de vervoerder van de Yfe. E. coli cellen uiten van recombinante YfeABCDE transporter vervoerd bijna 100% van de 52Mn toegevoegd aan de media naar het cytoplasma met minimale retentie in het periplasma. Augmented mangaan vervoer in het cytoplasma illustreert de bijdrage van de Yfe vervoerder in mangaan vervoer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig1.jpg"> Figuur 1. Zuivering van YfeA door fractionering. A. hypothetisch model voor Yfe transporter. B. SDS-pagina gel van YfeA zuivering van periplasma breuk, met behulp van lineaire gradiënt elutie van anion exchange. SDS-pagina gel toont de verrijking van YfeA (30 kDa) over zuivering stappen. Zwarte pijl geeft de positie van elektroforetische migratie voor YfeA. Moleculair gewicht normen getoond op rechts. (1) periplasma breuk. (2) Q anion uitwisseling kolom stroom door. (3) Q anion uitwisseling kolom piek elutie. (4) superdex 200 pg gel filtratie kolom piek. C. YfeA verrijking – goed voorbeeld. Beeldverwerking van de SDS-pagina gel van B berekend algemene verrijking van YfeA door densitometrie te verhogen van 8% van de periplasmatische breuk tot 61% van de gel filtratie product. Blauwe vakken geven aan YfeA/totale signaal voor densitometrie berekeningen gebruikt. Analyse van de Spectrometrie van de massa van de boxed band in lane 4 gedetecteerd 259/280 YfeA aminozuren, gepresenteerd in groene hoogtepunt. Aminozuren aanwezig in de volwassen polypeptide zijn vertegenwoordigd in vette hoofdletters zwarte tekst en samenstellen van de gekloofd signaal peptide aminozuren zijn vertegenwoordigd in cursieve tekst in kleine letters grijs. D. YfeA verrijking - slecht voorbeeld. SDS-pagina gel van YfeA zuivering van periplasma breuk, met behulp van de kleurovergang elutie stap uit anion uitwisseling. SDS-pagina gel toont verrijking van YfeA over zuivering stappen. Zwarte pijl geeft de positie van elektroforetische migratie van grote eiwit verontreinigingen verbeterd tijdens anion uitwisseling chromatografie. Moleculair gewicht normen getoond op rechts. (1) superdex 200 pg gel filtratie kolom piek. (2) Q anion uitwisseling kolom 250 mM NaCl stap kleurovergang elutie. (3) periplasma breuk. Beeldverwerking van SDS-pagina gel van D berekent marginale algemene verrijking van YfeA door densitometrie tot een maximum van 20% van de gel filtratie product. Blauwe vakken geven aan YfeA/totale signaal voor densitometrie berekeningen gebruikt. Massa spectrometrie van de analyse van de van de band aangegeven door zwarte pijl in baan 1 26 unieke peptiden van LivJ gedetecteerd (39 kDa), 25 unieke peptiden van EfeO (41 kDa), en 17 unieke peptiden van LivK (39 kDa). Alle drie verontreinigingen zijn periplasmische E. coli SBPs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig2.jpg"> Figuur 2. APO-YfeA en holo YfeA gel filtratie chromatogrammen. Zwarte pijl geeft de positie van dode volume. Gel filtratie pieken voor apo YfeA (zwarte curve) en YfeA (blauwe kromme) Toon beide eiwit holo stelt Elueer op het dezelfde elutievolume, die aangeeft dat apo die yfea gezuiverd uit het periplasma afvalfractie heeft een soortgelijke hydrodynamische straal als holo die yfea gezuiverd van totaal cellulaire inhoud na het indrukken van het Frans.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig3.jpg"> Figuur 3. APO-YfeA en holo YfeA crystal morphologies. Holo YfeA kristalliseert als een monolithische kristal, terwijl apo YfeA in het algemeen gejumeleerde kristallen in dezelfde kristallisatie staat produceert. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig4.jpg"> Figuur 4. APO-YfeA en holo YfeA X-ray fluorescentie spectra. A. Röntgen fluorescentie spectra van holo YfeA die uit de minimale media M9 met geen extra overgangsmetalen suppletie, groene curve heeft gezuiverd. Karakteristieke pieken zijn gelabeld voor mangaan, ijzer en zink. B. Röntgen fluorescentie spectra uit YfeA monster geproduceerd in het kader van YfeBCDE. Karakteristieke pieken zijn gelabeld voor mangaan, ijzer en zink. Blauwe curve. Röntgen fluorescentie spectra van YfeA gezuiverd van het kader van YfeBCDE en succesvolle versplintering van het periplasma breuk met minimale besmetting van cytoplasmatische overgangsmetalen en/of holo YfeA eiwit. Rode curve. Röntgen fluorescentie spectra van YfeA vanuit de context van YfeBCDE met mislukte fractionering van lysis van de buitensporige en significante besmetting van cytoplasmatische overgangsmetalen en/of holo YfeA eiwit gezuiverd. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig5.jpg"> Figuur 5. Generalized workflow voor fractionering. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig6.jpg"> Figuur 6. 60 min radioactief metalen opname fractionering gegevens. Elk experiment drie keer werd uitgevoerd, en foutbalken geven standaarddeviatie. Rode balk. E. coli -cellen die geen de Yfe vervoerder vervoer ongeveer ~ 50% van de 52Mn in het cytoplasma na 60 minuten, en handhaven van lage niveaus van periplasmische 52Mn. blauwe balk. E. coli cellen met het Yfe vervoerder vervoer > 90% van de 52Mn in het cytoplasma na 60 minuten en handhaven van lage niveaus van periplasmische 52Mn. groene balk. E. coli cellen waarin alleen YfeA vervoer ongeveer ~ 25% van de 52Mn in het cytoplasma en ~ 25% van de 52Mn in het periplasma behouden na 60 minuten.
De radiometal gebruikt in dit werk, 52Mn (t-1/2 = 5.59 d), werd geproduceerd op de UAB Cyclotron faciliteit (Birmingham, AL) door proton bombardement op een natuurlijke Cr-doel, en gezuiverd als eerder gemeld19. Let op: 52Mn is een positron emitter (β+avg = 242 keV, 29,4%), en ook verschillende hoge energie gammastralen uitzendt met hoge intensiteit (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Ik = 90.0%, 94,5%, 100%). Om deze redenen, moet het experiment worden uitgevoerd overeenkomstig de beginselen van straling bescherming van ALARA, zoals hierboven beschreven. Alle items die zijn aangewezen als radioactief afval moeten worden op de juiste manier opgenomen, duidelijk gemarkeerd en verwijderd volgens de vastgestelde procedures.

Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Essentieel metalen opname bij gram-negatieve bacteriën: Röntgen fluorescentie, radio-isotopen, en cel fractionering

Een protocol voor de winning van een chaperone periplasmische overgangsmetalen in het kader van haar eigen bindende partners, en biofysische karakterisering van de inhoud van het substraat door Röntgen fluorescentie en radiometal opname wordt gepresenteerd.

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray poederdiffractie in Conservation Science: Towards Routine kristalstructuurbepaling van Corrosie Producten over Heritage Kunstobjecten

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kwantificeren van Röntgen fluorescentie gegevens met behulp van MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-gevoelige detectie van de chemie in batterijen door zachte X-ray Absorptie spectroscopie en Resonant inelastisch X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-gemedieerde nucleatie en groei van Palladium metalen nanodeeltjes

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Kwantificering van metaal uitspoeling in geïmmobiliseerde metaal Affiniteits chromatografie

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologische monsters voorbereiding voor soortvorming bij cryogene temperatuur met behulp van hoge-resolutie röntgenabsorptiespectroscopie

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...