Name: essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation
Uploaded: 2018-02-01T15:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Dataene ble også samlet på GM/CA@APS, som er finansiert helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute (ACB-12002) og National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Denne forskningen brukt ressurser av avansert Foton kilde (APS), en US Department of Energy (DOE) kontoret av vitenskap bruker anlegget drives for DOE Office of Science av Argonne National Laboratory under Kontraktnr. DE-AC02-06CH11357. Bruk av avansert Foton kilden ble støttet av US Department of Energy, Office of Science, Office for energi basalfag, under Kontraktnr. W-31-109-Eng-38.
Vi ønsker å erkjenne UAB Comprehensive Cancer Center - masse massespektrometri/Proteomikk delt anlegg (P30CA13148-38) for deres hjelp i massespektrometri analyse.
C.D.R. ble støttet av et stipend fra University of Alabama i Birmingham Office of mangfold, egenkapital og inkludering. L.L.R. ble støttet av radiologi avdelingen av University of Alabama i Birmingham. Department of Energy, Office of Science, isotop programmet støttet 52Mn produksjon og A.V.F.M. under gi DESC0015773.

1. bakteriell startkulturer (dag 1)
<ol><li>I en 200 mL skrå kolbe, vaksinere 30 mL av Luria Bertani kjøttkraft (LB) med Escherichia coli belastning BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL celler som inneholder pYFE3 plasmider16.</li>
	<li>Legge til 30 µL av 50 mg/mL ampicillin kolbe ved aspirating med en pipette og 200 µL tips. Riste natten på 225 rpm på 37 grader.</li>
</ol>2. supplert M9 Minimal Media forberedelse (dag 2)
Merk: Dette er tilpasset fra Amresco manuell.
<ol><li>Klargjør 6 L flytende medium ved følgende fremgangsmåte. I en 2 L skrå kolbe, legge til 10,5 g av M9 minimal media 1 L ultra ren H2O. Autoclave 121 grader i 20 minutter og deretter avkjøles til romtemperatur.</li>
	<li>Tas aseptisk legge følgende sterilt supplement løsninger: 2 mL/L 1 M MgSO4, 10 mL/L av 20% w/v glukose, 0.1 mL/L 1 M CaCl2og 1 mL/L av 50 mg/mL ampicillin. Utføre dette trinnet i en biologisk sikkerhet regjering å opprettholde et sterilt miljø. Varm media å 37 grader.</li>
</ol>3. bakteriell subkultur
<ol><li>Legge til 5 mL/L av natten startkulturer M9 minimal media ved aspirating med en automatisk pipette og 5 mL tips. Riste subkultur kontinuerlig på 225 rpm på 37 grader 9 h. Merk: I dette trinnet YfeABCDE er overexpressed av autoinduction fra sin opprinnelige Y. pestis promoter.</li>
	<li>Gjenopprette celler sentrifugering 4500 x g i 30 min på 4 grader. Resuspend celler i 50 mL av en iskald fosfat buffer løsning (20 mM Na2HPO4 pH 7.6, 50 mM NaCl) av aspirating med Pipetter og 1 mL tips og Frys over natten på-80 grader.</li>
</ol>4. celle fraksjoneres (3. dag)
<ol><li>Tine rørets på 4 ° C og pellets celler 4000 x g for 20 min på 4 grader. Resuspend celler i 50 mL av iskalde høy salt buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl, og 2 mM EDTA) av aspirating med en automatisk pipette og 25 mL tips. Inkuber suspensjon over isen for 20 min, med sporadiske inversjon for å blande.</li>
	<li>Pellets cellene på 4500 x g for 20 min på 4 grader. Resuspend cellene i 50 mL av iskalde lav salt buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0) av aspirating med en automatisk pipette og 25 mL tips. Inkuber suspensjon over isen for 20 min, med sporadiske inversjon for å blande.</li>
	<li>Pellets spheroplasts 4500 x g for 20 min på 4 grader. Gjenopprette nedbryting som inneholder periplasm. Resuspend pelleted spheroplasts i fosfat bufret saltvann (trinn 3,2) av aspirating med en automatisk pipette og 25 mL tips, og lyse cellene av tre sykluser av franske Press celle Trykk på 1500 psi. Merk: En fransk Trykk celle trykk kan være vanskelig å operere og bruker en hydraulisk pumpe for å kjøre celle lysis. Vær forsiktig når engasjerende den hydrauliske pumpen, sikre riktig justering av stempelet ved å trykke og holde hendene fri av den hydrauliske pumpen.</li>
	<li>Pellets mobilnettet rusk 50.000 x g for 20 min på 4 grader. Gjenopprette nedbryting inneholder cytoplasma. Hvis nødvendig, kan ytre og indre membraner være ytterligere fraksjonert16.</li>
</ol>5. protein rensing med FPLC
<ol><li>Umiddelbart etter fraksjoneres, kan du filtrere periplasmic delen bruker en 0,45 µm membran enhet. Bruke filtere Luer lås sprøyte for enkel og rask filtrering. Equilibrate en 5 mL Q anion exchange kolonne med 20 mM Tris pH 7.6, 0,05% w/v-NaN3 laste buffer ved en strømningshastighet på 5 mL/min.</li>
	<li>Last periplasmic filtratet på pre equilibrated 5 mL Q anion exchange kolonnen med 20 mM Tris pH 7.6, 0,05% w/v-NaN3 laste buffer ved en strømningshastighet på 2 mL/min. fortsette å vaske 5 mL Q anion exchange kolonnen med 20 mM Tris pH 7.6 , 0,05% w/v-NaN3 lasting buffer før en planlagt lesning av A280 oppnås på en strømningshastighet på 5 mL/min.</li>
	<li>Elute bundet protein med 20 mM Tris pH 7.6, 0,05% w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl av lineær gradient over 10 kolonnen volumer på en strømningshastighet på 5 mL/min. kombinere brøker som inneholder en280 topp. Apo YfeA elutes mellom 200 mM NaCl og 300 mM NaCl.</li>
	<li>Konsentrere seg eluate av sentrifugal konsentrator til volumet når ~ 5 mL.</li>
	<li>Equilibrate en Superdex 200 pg gel filtrering kolonne med 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 50 mM NaCl, 0,05% w/v-NaN3 gel filtrering buffer ved en strømningshastighet på 2,5 mL/min.</li>
	<li>Last konsentrert anion utveksle eluate på pre equilibrated Superdex 200 pg gel filtrering kolonnen og rense bruker gel filtrering buffer fra trinn 5.5 på en strømningshastighet på 2,5 mL/min. kombinere brøker som inneholder en280 topp tilsvarer en ~ 30 kilodalton (kDa) protein. Merk: Følgende referanse er et eksempel FPLC eksperiment for å demonstrere de protokoll17.</li>
</ol>6. protein krystallisering
<ol><li>Konsentrere gel filtrering eluate av sentrifugal konsentrator til en siste protein konsentrasjon av 22 mg/mL.<ol>
<li>Beregn konsentrasjonen protein ved A280 lesing av 1.276 mg/mL. Denne teoretisk utryddelse koeffisienten ble spådd av ExPASY ProtParam18. Merk: En A280 eksempel lesing av 5.104 AU tilsvarer en 4.000 mg/mL løsning; 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4.00 mg / mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mix 1.5 µL av protein med 1,5 µL av 30% w/v pinne 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 0,05% w/v-NaN3 sitter slipp eller henger slipp oppsett av aspirating med en pipette og 10 µL tips.</li>
	<li>Inkuber krystallisering drops på 293 K for 2-4 uker.</li>
	<li>Flash-fryser krystallene i flytende nitrogen basseng for forsendelse til synchrotron.</li>
</ol>7. X-ray fluorescens (med GM/CA Beamline programvare)
<ol><li>Gå til kategorien Hutch Bruk energi varenummer sette energi til 10.0 keV.</li>
	<li>Naviger til skanne kategorien Naviger til interaktiv tab. Mount prøven.</li>
	<li>Velg Optimaliser fluorescens signal. Input 4.00 s under tid varenummer. Velg ta fluorescens spektrum. Vis spekteret Plot -kategorien.</li>
</ol>8. MAD avsøke for metall energi absorpsjon Peak (med GM/CA Beamline programvare)
<ol><li>Flytte prøven av bjelken. Naviger til skanne kategorien Naviger til kategorien periodesystemet Velg K-kanten av element av interesse. Merk: Energi verdien i energi underoverskrift er i eV.</li>
	<li>Gå til kategorien Hutch Bruk energi varenummer sette energi til verdien i trinn 8.1 i keV.</li>
	<li>Flytte prøven til bjelken. Naviger til skanne kategorien Naviger til Auto tab. Input 2,00 s under tid varenummer.</li>
	<li>Velg Start søk. Vis MAD skanningen ved hjelp av kategorien Plot . Merk: Energi verdien i Peak varenummer er i eV i stedet for keV.</li>
	<li>Velg gjort med fluorescens.</li>
	<li>Flytte prøven av bjelken. Gå til kategorien Hutch bruk energi varenummer sette energi til verdien i trinn 8.4 rundet opp neste eV (dvs. topp: 9658.3 eV, angi energi til 9659 eV).</li>
	<li>Flytte prøven til bjelken. Samle datasett. Gjenta trinn 8.1-8.6 for alle metaller rundt.</li>
</ol>9. analytisk protokoll for radioaktivt metall opptaksanalyse
<ol><li>I en 14 mL kultur tube, vaksinere 5 mL av LB med E. coli belastning BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL celler som inneholder pYFE3 plasmider16. Legge til 5 µL av 50 mg/mL ampicillin ved aspirating med en pipette og 10 µL tips. Rist på 225 rpm på 37 grader 7 h.</li>
	<li>Pellets cellene på 15.000 x g for 1 min ved hjelp av en tabletop sentrifuge. Vask cellene i 1 mL av supplert M9 minimal media av aspirating med en pipette og 1 mL tips. Gjentas én gang.</li>
	<li>I en 50 mL konisk tube supplert subkultur cellene i 30 mL M9 minimal media med aspirating med en pipette og 1 mL tips. Rist på 225 rpm på 37 grader 9 h.</li>
	<li>Bestemme mengden av radioaktivitet kreves for å oppnå ca 100.000 teller per minutt (cpm). Merk: Dette vil variere avhengig av radioisotop og instrument som brukes til å søke. For eksempel gir et utvalg som inneholder 7,4 kilobecquerel (kBq) (0,2 microcurie (µCi)) av 52Mn en lesning av 550 000 cpm på en automatisert gamma detektor (NaI). Dermed mengden av radioaktivitet for å få antall 100.000 cpm kan bestemmes ved hjelp av følgende ligning: 100.000 cpm/550 000 cpm * 7.4 kBq (0,2 µCi) = 1.35 kBq (0.036 µCi). Forsiktig: radioaktivitet resulterer i utgivelsen av ioniserende stråling, som er farlige. Når du arbeider med radioaktivitet alltid bruke det riktige skjerming for magnetisme og følger prinsippene av som lav som rimelig oppnåelig (ALARA) ved å øke avstanden og skjerming samtidig redusere eksponeringstid. Bare opplært personale skal håndtere radioaktivitet i spesielt angitte laboratorier, som er lisensiert for bruk av radioaktivt materiale.</li>
	<li>Multiplisere den nødvendige radioaktiviteten beregnet trinn 9,4 av det totale volumet av subkultur, til å bestemme den totale mengden radioaktivitet nødvendig. Legge dette beløpet (fortrinnsvis i et lite volum på 50-100 µL) til røret som inneholder subkultur slik at det er 100.000 cpm/mL, og vortex for 30 s. Merk: For 31 mL av subkultur, den totale mengden radioaktivitet kreves er 1.35 kBq (0.036 µCi) x 31 mL = 41,3 kBq (1,12 µCi).</li>
	<li>Aliquot 1 mL av subkultur (nå inneholder radioaktivt tracer) i enkelte 1,5 mL sentrifuge rør av aspirating med en pipette og 1 mL tips og sted i en 37˚C thermomixer, med vortexing på 1 × g. Inkluder nok rør slik at det er tre replikerer for hver ønsket mål samt tre ekstra gjentak bruke som standarder (sette standarder, utfører ikke fraksjoneres analysen på standarder). Merk: Assaying på 1, 2 og 4 h ville kreve 12 rør totalt.</li>
	<li>Etter inkubasjon sentrifuge rørene på 15 000 × g for 30 s med en Borstemmaskin sentrifuge (fortrinnsvis kjølt ned til 4 grader) og kast supernatants.</li>
	<li>Nytt suspendere cellene i 1 mL av iskald, høyt saltinnhold buffer (trinn 4.1) av aspirating med en pipette og 1 mL tips, og samme sted på is 20 min.</li>
	<li>Pellets cellene igjen på 15.000 × g for 30 s med en Borstemmaskin sentrifuge (fortrinnsvis kjølt ned til 4 grader) og kast supernatants. Merk: Nedbryting inneholder ikke-tilknyttede gratis metal.</li>
	<li>Nytt suspendere cellene i iskald, lav salt buffer (trinn 4.2) av aspirating med en pipette og 1 mL tips og ruge på is 20 min. Merk: Det er viktig å Sug opp forsiktig via pipette for dette trinnet.</li>
	<li>Pellets cellene på 15.000 × g for 30 s, og samler hver av supernatants i nye 1,5 mL sentrifuge rør. Det skal nå være seks rørene per punkt. Merk: Nedbryting inneholder periplasmic fraksjon og pellet inneholder den membranous og cytoplasmatiske fraksjon. Vi kaller pellet cytoplasmatiske brøken.</li>
	<li>Måle radioaktiviteten i hver fraksjon (seks rør per punkt) og standarder satt i trinn 9.6. Bruk mengden av radioaktivitet i standardene for å bestemme den totale mengden radioaktivitet opprinnelig la hvert utvalg.</li>
	<li>For å avgjøre prosentandelen av radioaktivt opptak i periplasm, bruk denne formelen: (gjennomsnittlig cpm av periplasmic brøk/gjennomsnittlig cpm standarder) x 100.</li>
	<li>For å avgjøre prosentandelen av radioaktivt opptak i cytoplasma, bruk denne formelen: (gjennomsnittlig cpm av cytoplasmatiske brøkdel/gjennomsnittlig cpm av) x 100.</li>
	<li>For å avgjøre % totalt opptaket, bruk denne formelen: ((gjennomsnittlig cpm av periplasmic brøk + gjennomsnittlig cpm i tilsvarende cytoplasmatiske brøken) / (gjennomsnittlig cpm for standarder)) x 100.</li>
</ol>

<ol>
	<li>ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity+of+ABC+transporters.">Structural diversity of ABC transporters.</a> J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).</li><li>Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+classification+of+substrate-binding+proteins.">A structural classification of substrate-binding proteins.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).</li><li>Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hinge-bending+in+L-arabinose-binding+protein.+The+&amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34;+model.">Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The &amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34; model.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).</li><li>Hoeppner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+and+Their+Ligands:+Their+Importance+and+How+to+Crystallize+Them.">Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them.</a> Advanced Topics on Crystal Growth. , (2013).</li><li>Lee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Zn(II)-free+Treponema+pallidum+TroA,+a+periplasmic+metal-binding+protein,+reveals+a+closed+conformation.">The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).</li><li>Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+regulatory+role+for+the+histidine-rich+loop+in+the+zinc+transport+protein,+ZnuA.">Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA.</a> Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).</li><li>Yatsunyk, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+metal+binding+properties+of+ZnuA,+a+periplasmic+zinc+transporter+from+Escherichia+coli.">Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli.</a> J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).</li><li>McDevitt, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+for+bacterial+susceptibility+to+zinc.">A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc.</a> PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).</li><li>Cou&#241;ago, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imperfect+coordination+chemistry+facilitates+metal+ion+release+in+the+Psa+permease.">Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease.</a> Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).</li><li>Abate, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo,+Zn2+-bound+and+Mn2+-bound+structures+reveal+ligand-binding+properties+of+SitA+from+the+pathogen+Staphylococcus+pseudintermedius.">Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius.</a> Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).</li><li>Ahuja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+bacterial+ABC+transporter+inhibition+by+an+antibody+fragment.">Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment.</a> Structure. 23 (4), 713-723 (2015).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+Cells.">Fractionation of Cells.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Zhao, H., Martinis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacterial+compartments+to+track+movement+of+protein+synthesis+factors.">Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors.</a> Methods. 113, 120-126 (2017).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).</li><li>Radka, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Yersinia+pestis+virulence+factor+YfeA+reveals+two+polyspecific+metal-binding+sites.">Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).</li><li>Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Scale+Production+and+Purification+of+a+Therapeutic+Antibody.">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J Vis Exp. (119), e55153 (2017).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+PET+Imaging+of+pharmacokinetics+of+manganese+in+mice+using+Manganese-52.">Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52.</a> PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).</li><li>Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transferrin-independent+iron+transport+in+K562+cells.+Unique+properties+provide+evidence+for+multiple+pathways+of+iron+uptake.">Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake.</a> J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).</li><li>Makui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Escherichia+coli+K-12+Nramp+orthologue+(MntH)+as+a+selective+divalent+metal+ion+transporter.">Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter.</a> Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).</li><li>Forbes, J. R., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron,+manganese,+and+cobalt+transport+by+Nramp1+(Slc11a1)+and+Nramp2+(Slc11a2)+expressed+at+the+plasma+membrane.">Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane.</a> Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).</li></ol>

Forfatterne erklærer de har ingen konflikter av interesse.

Celle fraksjoneres er et nyttig verktøy for undersøkelser spesielt innholdet i en mobilnettet kupé, og kan tjene som et nyttig verktøy for å trekke ut små molekyler som metall atomer og macromolecules for eksempel proteiner. Det er verdt å merke seg at celle fraksjoneres er ikke en absolutt teknikk og kan være feil uten oppmerksomheten miksing/rørets inkubasjon temperatur og inkubasjonstiden. Ufullstendig blanding kan føre minimal membranous lyse og dermed ubetydelig fraksjoneres, fraksjoneres ved romtemperatur kan føre til raske lysis av både membraner resulterer i forurensning av periplasmic brøken med cytoplasmatiske innholdet, og utvidet inkubasjon ganger kan også føre til overdreven lyse og dermed brøkdel forurensning. Et rettferdig kompromiss for å oppnå effektiv og relativt komplett ytre membran lysis (samtidig bevare interne membran) er 20 minutters inkubasjon over isen i hypotonisk fraksjoneres buffer. En annen vurdering er metoden ekstraksjon, hvor hardt utvinning av risting eller vortex kunne kompromittere kvaliteten på utdrag som forårsaker protein aggregering. Det anbefales å blande forsiktig som slikkepott, inversjon eller aspirating av pipette å opprettholde høy kvalitet materiale for nedstrøms. Rensing fra preparative celle fraksjoneres kan oppstå med variabel effektivitet som gjenspeiles av figur 1. I ett eksperiment, YfeA begynte som 8% av utdraget periplasmic innholdet (figur 1 c), mens i et annet eksperiment, YfeA begynte som 17% av periplasmic innholdet (figur 1 d). Disse forskjellene kan oppstå fra flere grunner som variabel uttrykk (tilføyer EDTA til vekst medier kan øke uttrykket av gener regulert av sult mekanismer som pels regulering av Yfe selskapet), gjentatt bruk av frosset permanent aksjer, og menneskelig feil. I stedet for å justere inkubasjon tider, er det anbefalt å skalere opp forberedelse. Rensing fra periplasm brøkdel anbefales å inkludere en lineær gradient elueringsrør fra anion exchange brukt kromatografiske trinn. En trinn gradient elueringsrør er et elueringsrør strategi bruker diskret og brå endringene i mobil fase komposisjon (dvs., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etc.). En lineær gradient elueringsrør er et elueringsrør strategi som bruker gradvis endring i mobile fase komposisjon (dvs. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc.). Trinn gradering er nyttig for å skille molekyler som har forskjellige interesseområder for stasjonære fase, og en lineær gradient elueringsrør er nyttig for å skille molekyler som har lignende slektskap for stasjonære fase. Ved rensing protein med ingen kunstige rensing kode (å forbedre affinitet for stasjonære fase) fra en celle kupé som er rik på unike protein arter, anbefales en lineær gradient elueringsrør å skille proteiner av noninterest som kan har lignende slektskap til stasjonære fase som protein av interesse. Vanligvis en avkastning på 1-2 mg renset apo YfeA forventes fra hver liter kultur uttrykke YfeA fra sin endogene Y. pestis promoter.
X-ray fluorescens er en teknikk som gjør at etterforsker å raskt bestemme metall innhold i en prøve, og informere etterforskeren om uventede metall innlemmelse som ellers er ukjent. Selv om EDTA er inkludert i hypertonic fraksjoneres buffer fjerne løst tilknyttet eller gratis metal, kan YfeA avledet fra periplasm brøkdel inneholde noen holo protein. Gitt at metall transport er en dynamisk prosess, kanskje kommer proteininnholdet holo fra YfeA som fortsatt ikke har donert sin Last til YfeBCDE. Det er verdt å merke seg at X-ray fluorescens bare måler metall innholdet og angir ikke om metal er organisert i en krystall gitter, eller spesielt bundet til et protein. For å avgjøre hvis metall er organisert i en krystall gitter og/eller spesielt bundet til et protein molekyl, er røntgen spredning innsamling og behandling nødvendig. Likevel tillater X-ray fluorescens rask eksempel vurdering av metall forurensning og/eller gjenværende holo protein integrering. Synchrotron stråling er begrenset og det er ikke alltid tid til å utvikle en strategi for datainnsamlingen X-ray spredning på hver prøve, dermed X-ray fluorescens er en verdifull teknikk for screening mange krystaller og prioritering for hvilke prøver X-ray spredning data skal samles. Videre kan X-ray fluorescens datainnsamling fra prøver som ikke kan diffract røntgenstråler. Mens samle X-ray fluorescens data, til tider signalet kan være veldig svak og de resulterende spektra uninformative. For å øke styrken på signalet, for X-ray fluorescens eller gal skanning, vurdere å øke eksponeringstiden og/eller redusere røntgenbilde stråle demping. Når et utvalg er identifisert for innsamling av X-ray spredning data, anbefales det å samle X-ray spredning data på en annen del av prøven enn hva som ble brukt for X-ray fluorescens og MAD skanning å minimere stråling skade, forbedre kvaliteten på dataene samling, og minimere fare for reduksjon av unormalt signal.
Påvisning av radioaktivt tracers krever nanomolar mengder materiale eller mindre, og bruk av disse tracers som molekylær sporing gir en enkel og svært følsom metode for leting cellulære prosesser. Radiometal analysen skissert ovenfor kan brukes til å bestemme total metall opptak, distribusjon over mobilnettet rom, samt priser på opptak. Faktisk krever hvert datapunkt tid en 40 minutters fraksjoneres; men som hvert punkt er nådd, er celler umiddelbart pelleted og ruges i høy salt buffer (figur 5trinn 1). Radiometal målinger av media, forkastet høy salt buffer (figur 5trinn 1), og periplasmic og cytoplasmatiske fraksjoner etter (figur 5trinn 3) Angi den høye salt buffer inkubering hell fjerner alle gjenværende unassociated gratis metall som hengende etter den første sentrifugering etter å ha nådd tidspunktet. Den første sentrifugering fjerner de fleste (opp til 80%) av ikke-tilknyttede gratis metall og sentrifugering etter inkubasjon i høy salt bufferen fjerner også flere gjenværende unassociated gratis metal. Langvarig unassociated gratis metall forventes ikke å påvirke betydelig metall transport under 40 minutters fraksjoneres. Påvirkning av 40 minutters fraksjoneres på intracellulær metall transport er en annen vurdering for forsvarlig data tolkning. Nesten oppstår hele fraksjoneres protokollen over isen, bortsett fra de 30 andre sentrifugering mellom trinn. Metall transporttiden kurs eksperimenter har vist at vedlikeholde celler på 4 ° C opphever metall transport20,21,22; Derfor fordi forsøkene oppstår over isen, 40 minutters fraksjoneres forventes ikke å betydelig øke metall nivåer i periplasm av cytoplasma og metall nivåene forventes å være representativt for tidspunkt som cellene var først centrifugalized.
Fastsettelse av relativt opptaket i forskjellige mobilnettet rom kan hjelpe informere XFS data, bekrefte et fysiologiske natur, samt aktiverer etterforsker til videre sondere molekylær detaljer om en mekanisme. For eksempel tillegg av genetisk mutagenese til radiometal opptak eksperimenter gir en direkte metode for å forsterke viktige funksjonelle rester eller molekyler involvert i underlaget transport. Fordelene med radiometal opptak eksperimenter og analyser inkluderer rask behandlingstid, høy gjennomstrømning, høy reproduserbarhet og parallelization eksperimenter sammenligne vekst forhold og genetisk konstruksjoner.

Gram-negative bakterier, er cytoplasmatiske bassenger med overgang metall atomer økt og påfylles av indre membran ABC (ATP-bindende kassett) importører som begrenser metall translokasjon over interne membran. Periplasmic Cluster A-1 substrat bindende proteiner (SBPs) utgjør en gruppe chaperones som binder metall atomer direkte og ferge dem gjennom periplasm å levere dem til beslektet ABC importører1. Andre klynger av SBPs er dedikert til transport av underlag, som sin natur chelated metall (Cluster A-2), karbohydrater (klynger B og D-1) og aminosyrer (klynger B, C, F-2 og F-4); Likevel, uansett underlaget, SBPs følge et evolusjonært bevart c-klemme fold2. Generalisert foreslåtte mekanismen for SBP substrat overføring inkluderer c-klemmen gjennomgår en rekke contortions som ligner en Rosemary3. Vanligvis rense klynge A-1 SBPs i en holo (metall bundet) form, men studie av disse SBPs er begrenset av vanskeligheten i å generere apo (metall-free) skjemaer til protein for eksperimentering4. Til dags dato, strategier for å studere apo klynge A-1 SBPs har vært begrenset til mutagenese, dialyse og delvis rødsprit med ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. strukturelle data fra disse eksperimentene foreslår at klyngen A-1 SBPs ikke følger kanskje nøyaktig Rosemary mekanismen. For tiden mangler i litteraturen er en metode å produsere apo klynge A-1 SBPs i vivo bruker fysiologiske bindende partnere.
Vi viser for første gang ved hjelp av celle fraksjoneres for å rense YfeA, en klynge A-1 SBP fra blodlegemer, paranoid agent av pest, som ble konvertert til skjemaet apo gjennom samspill med sine fysiologiske beslektet YfeBCDE ABC importør i cellen. Vi viser YfeA i skjemaet apo av energi-dispersiv X-ray spektroskopi (EDS), også kjent som X-ray fluorescens. Vi viser også YfeBCDE funksjonalitet ved å kombinere celle fraksjoneres med svært følsom radioaktivt metall opptak studier å skille mellom metall opptak over den ytre membranen og metall import over interne membran. Bruk av en radioaktiv tracer gir for påvisning av pg finans mengder metaller, mye lavere enn grensen for påvisning teknikker slik som Induktivt kombinert plasma massespektrometri (ICP-MS) eller atomic absorpsjon spektroskopi (AAS). Dette gir minimal forstyrrelsene av systemet blir studert. I tillegg krever tradisjonelle metodene ofte større eksempel volumer, ytterligere etterbehandling og lengre snu-tid, som ikke er typisk for radiotracer analyser. Dermed gir bruker en radiotracer en praktisk og enkel metode for overvåking metall distribusjon og opptak i en celle. Det gjenstår for å fastsettes hvis en apo klynge A-1 SBP produsert ved hjelp av denne metoden vil ekko strukturelle observasjonene fra gjeldende praksis brukes til å generere apo protein.
Celle fraksjoneres er en etablert metode for å skille mobilnettet rom implisitt formål å spesielt sondering innholdet i isolasjon12. Celle fraksjoneres er vanlig å bekrefte plasseringen av et molekyl under cellen syklus eller måle aktiviteten til en bestemt rom13. Metall transport aktivitet kan for eksempel være assayed av undersøkelser mobilnettet rom for metall substrat. Integrere celle fraksjoneres kan skille og sammenligning mellom metall opptak over den ytre membranen og metall overføring over interne membran. Disse prosessene kan deretter igjen måles over tid. I tilfelle av protein rensing, de vanligste metodene for cellen lyse og separasjon av løselig komponenter fra uløselig komponenter er mekanisk avbrudd (dvs. sliping, blander), høytrykk homogenisering (dvs. fransk Trykk celle trykk, celle Disrupter), og Ultralydutstyr frekvenser (dvs., sonication)14. Bruk av ultrasoniske frekvenser til lyse cellene er vanligvis best egnet for små volumer; men er sonication kjent for å generere overdreven varme som kan denature protein. For å unngå å generere høy varme, brukes Ultralydutstyr frekvenser vanligvis i sekvensielle korte støt, som kan være tidkrevende og utilsiktet fornedre DNA molekyler i mindre fragmenter. I tillegg kan flere dyre sonication sonder være nødvendig for skytevåpen og analytisk eksperimenter, som hver probe har et begrenset område for eksempel volumet som kan behandles. Bruk av høyt trykk til lyse cellene unngår generere overdreven varme under cellen lysis av skremmende fransk Trykk celle trykk komponenter før lysis eller opererer en celle disruptor ved kalde omgivelser som en kjølerom. Som sonication sonder må flere sett med fransk Trykk celle trykk komponenter kjøpes for å behandle en rekke eksempel volumer. Fransk Trykk celle trykk samlinger er lett å koble men vanskelig å opererer og ren, kan være tunge til å flytte og er utsatt for tilstopping fra tett prøver. Fordeler med å bruke ultralyd frekvenser og høytrykks systemer til lyse cellene inkluderer høy eksempel utvinning, muligheten til å behandle flere eksempler med minimal krysskontaminering, og justerbar skjæring kraft, som kan være tilpasset lysis optimalisering av et bredt spekter av prøven. Optimalisering kan oppstå ved justering av Ultralydutstyr frekvens, varigheten av støt, stempelet press pounds per kvadrat tomme (psi), og antall passerer gjennom pressen. Bruk av mekaniske avbrudd til lyse cellene kan være den mest teknisk trivielt og minst kostbare strategien for cellen lysis. Mekanisk avbrudd kan presentere utfordringer i prøven utvinning og er ikke ideelt for behandling av flere eksempler. Mekanisk avbrudd er mildere smakebiter enn høytrykk eller Ultralydutstyr frekvenser, men er ikke høy gjennomstrømning og er utsatt for ineffektiv lysis. En betydelig eksperimentelle begrensning av mekanisk avbrudd, høytrykk homogenisering og ultralyd frekvenser, er ukontrollerbare avbrudd i hele mobilnettet arkitekturen slik at etter lyse, alle vandig celle komponentene er blandet sammen. Videre, alle cellen avdelinger ikke avbryter samtidig; innholdet rom som lyse tidlig kan derfor bli utsatt pågående forstyrrende styrker lengre enn innholdet i rom som lyse sent. Celle fraksjoneres gir rimelig, teknisk enkel, effektiv rom-baserte separasjon av innholdet mens du unngår behovet for dyrt utstyr og prøve eksponering for harde, forstyrrende styrker.
Når det gjelder SBP, importerte underlaget er gjeninnføres til potensielt apo protein og regenererer holo protein i lyse, før nedstrøms kromatografi eller andre rensing teknikker. Inkludering av EDTA chelator under lysis presenterer en ytterligere hindring, metall affinitet som et første skritt for protein rensing ikke er der mulig fordi EDTA vil kle metal fra kromatografi harpiks og hindre protein bindende15. En enkel og billig løsning er celle fraksjoneres av osmotisk sjokk, der differensial sentrifugering og vanlig laboratoriet reagenser aktivere etterforskeren å ekstra nøye nok protein for funksjonsanalyse. Osmotisk støt fraksjoneres benytter en totrinns endring i osmotisk trykk skille mobilnettet avdelinger. Først en hypertonic buffer fører cellene til crenate som vannet går hver celle og deretter en hypotonisk buffer forårsaker celler å svelle som vann inn hver celle. Ved presis å kontrollere hvor lenge cellene svelle, kan ytre membraner være selektivt lysed (på grunn av opphoping av osmotisk trykk fra innkommende vannet), dermed tømme innholdet i bufferen. Bevaring av indre membraner sikrer at cytoplasmatiske innholdet beholdes i spheroplasts, og er lett skilles fra periplasmic innholdet med sentrifugering.
YfeA er en polyspecific SBP kan binde jern, mangan og sink atomer16. Den relative andelen innarbeidet metall kan endres etter metall tilskudd under vekst, og assayed av X-ray fluorescens som er tilgjengelig på Argonne National Laboratorys avanserte Foton kilden16. X-ray fluorescens gjør etterforsker til raskt profil en bred samling av metaller uten behov for stor eller Diffraksjon kvalitet krystaller, og kan også fange opp data fra protein bunnfall eller proteinaceous løsning.
X-ray fluorescens kan raskt avslører uventede resultater som i dette tilfellet den primære YfeA substratet som sink og ikke dokumentert fysiologiske underlag jern, mangan eller16. Hvis det brukes før X-ray spredning datainnsamlingen, kan røntgen fluorescens informere etterforsker i eksperimentell design, for eksempel hvilke metall energi edge(s) for å bruke for uregelrett X-ray spredning datainnsamling. Bare så nyttig som bestemmer den relative overfloden av et metall, røntgen fluorescens kan også avgjøre om en metall er fraværende i en prøve, å gi en rask metode for å skille krystaller som inneholder apo protein fra holo protein, og beregner metall signalstyrke uten behovet for tidkrevende databehandling. Ved å identifisere en prøve med en sterk metall signal, kan presis bølgelengden bruke uregelrett X-ray spredning datainnsamling bestemmes av flere-bølgelengde uregelrett spredning (MAD) skanning.
Denne detaljerte protokollen er ment å hjelpe nye eksperimentelle kunne utføre cellen fraksjoneres og gjøre effektiv bruk av synchrotron beamline maskinvare til å profilere metall innholdet og fremme studiet av metall-bindende proteiner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1097270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO M9 Medium Broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9688886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, White Powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>230280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation

Vi viser en skalerbar metode for separasjon av bakteriell periplasm fra cytoplasma. Denne metoden brukes til å rense periplasmic protein for Biofysiske karakterisering og måle substrat overføring mellom periplasmic og cytoplasmatiske avdelinger. Nøye begrenser tiden som periplasm er atskilt fra cytoplasma, kan eksperimentator ekstra protein av interesse og analysen hver avdeling for substrat uten bære-over forurensning mellom avdelinger. Utdraget protein fra fraksjoneres kan deretter bli ytterligere analysert for tredimensjonale proteinstrukturer eller substrat bindende profiler. Denne metoden kan eventuelt utføres etter inkubasjon med en radiotracer å bestemme total prosent opptak, i tillegg til distribusjon av tracer (og dermed metall transport) over forskjellige bakteriell avdelinger. Eksperimentering med en radiotracer kan bidra til å skille mellom en fysiologisk substrat og artefactual underlaget, som skyldes mismetallation.
X-ray fluorescens kan brukes til å oppdage tilstedeværelse eller fravær av metall innlemmelse i en prøve, i tillegg til å måle endringer som kan oppstå i metall innlemmelse som et produkt av vekst forhold, rensing forhold eller krystallisering forhold. X-ray fluorescens gir også et relativt mål for overflod for hver metall, som kan brukes til å bestemme den beste metall energi absorpsjon toppen bruke uregelrett X-ray spredning datainnsamling. Radiometal opptak kan brukes som en metode til å validere et substrat oppdaget av X-ray fluorescens fysiologiske natur, samt støtte oppdagelsen av romanen underlag.

SDS side gel og gel filtrering chromatograms var samlet for å vurdere kvaliteten på protein rensing fra preparative periplasm fraksjoneres. Rensing av holo YfeA har vært tidligere beskrevet16; Imidlertid er ikke rensing av apo YfeA rapportert. Strategien for å rense apo YfeA beskrevet av denne metoden bruker en rekombinant vill-type konstruksjon som ikke inneholder en affinitet kode av noe slag, særlig en som kan brukes for protein immunoblot (dvs. hans-tag) og et monoklonalt antistoff som gjenkjenner YfeA ikke har vært beskrevet. Derfor ble massespektrometri analyse benyttet for å kontrollere rensing av YfeA. For å rense YfeA av fraksjoneres, anbefales det å bruke en lineær elueringsrør gradering for anion exchange kromatografi (figur 1). Lineær elueringsrør graderingen forbedrer betydelig YfeA berikelse fra utgjør ca 8% av den periplasm fraksjon 49% av anion exchange produktet som beregnes densitometry (figur 1 c). Denne sammensetningen er forbedret til 61% av gel filtrering og elueringsrør volumet av apo protein er identisk elueringsrør volumet av holo protein (figur 2). Massespektrometri analyse bekrefter rensing av YfeA gjennom oppdagelsen av 92.5% av YfeA aminosyresekvens, 246 totalt YfeA polypeptid spectra, 24 unike peptider og 50 unike polypeptid spectra. Alternativt til kontrast lineær gradient produktet med produktet fra en trinn gradient elueringsrør, var YfeA renset av anion utveksling ved hjelp av en vask trinnvis 50 mm NaCl fulgt et elueringsrør 250 mm NaCl (figur 1 d). Trinn graderingen beriker marginalt YfeA fra komponere 17% av periplasm brøkene 18% av anion exchange produktet som beregnes densitometry. Trinn gradient tilsettes også beriker et protein miljøgifter band som massespektrometri identifisert som inneholder flere E. coli SBPs av lignende molekylvekt. På grunn av oppløsningen grensene for HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, likheten i molekylvekt og strukturer av forurensende SBPs, bedre gel filtrering marginalt YfeA berikelse til 20% av gel filtrering produktet. Bør en lineær elueringsrør gradient være uoppnåelig for anion utveksling, anbefales det å utforske flere trinn vasker i 25-50 mM NaCl trinn å identifisere konsentrasjonen av NaCl kreves for å fjerne disse forurensninger.
Renset apo og holo YfeA utkrystallisere i samme krystallisering vilkår, men bilder av apo og holo YfeA krystall morphologies viser forskjeller i krystall veksten mellom Oslo og holo YfeA stater (Figur 3). I tillegg til massespektrometri bekreftelse bekreftet X-ray Diffraksjon data (vises ikke) samlet fra krystaller vokst fra protein renset ved denne metoden rensing og krystallisering av YfeA. Omfanget av kupé forurensning (cytoplasmatiske sink vende apo å holo protein i periplasm delen) kan vurderes ved å fange X-ray fluorescens spectra (Figur 4). Gitt at sink er den primære substratet bundet til rekombinant YfeA16, kan røntgen fluorescens spectra raskt skille mellom et YfeA utvalg som inneholder en sterk sink signal samsvar med holo YfeA (figur 4A), tegn på tvers forurensning, eller svak sink signal suggestiv av apo YfeA og minimal krysskontaminering (figur 4B). ICP-MS analyse av M9 minimal media bekreftet transisjonsmetall er i sub-micromolar området (vises ikke); Derfor kan påvisning av bare minimale mengder av overgangen metaller forvente etter en vellykket fraksjoneres. Analytisk fraksjoneres (figur 5) kan brukes til å måle radiometal transport priser og fange funksjonelle data. En 60 minutters snapshot sammenligne periplasmic og cytoplasmatiske fraksjoner av E. coli celler uttrykke YfeA bare, den fulle YfeABCDE transporter og ingen YfeABCDE komponenter avslører konsekvensene av uttrykke et enkelt rekombinant protein eller proteinet på metall opptak (figur 6). E. coli celler som uttrykker ingen rekombinante proteiner transportert omtrent halvparten av 52Mn lagt til media til cytoplasma med minimal oppbevaring i periplasm. Negativ kontrollen representerer endogene mangan transport. E. coli celler uttrykke rekombinant YfeA transportert omtrent en fjerdedel av den 52Mn lagt til media til cytoplasma med en annen kvartal beholdt i periplasm. Mangan oppbevaring i periplasm og begrenset transport i cytoplasma demonstrerer metabolske behovet og flaskehalsen pålagt ved å produsere YfeA i fravær av den Yfe transporter. E. coli celler uttrykke rekombinant YfeABCDE transporter transportert nesten 100% av den 52Mn lagt til media til cytoplasma med minimal oppbevaring i periplasm. Utvidet mangan transport i cytoplasma illustrerer den Yfe transporter i mangan transport.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig1.jpg"> Figur 1. Rensing av YfeA av fraksjoneres. A. hypotetisk modell for Yfe transporter. B. SDS side gel for YfeA rensing fra periplasm brøk, bruker lineær gradient elueringsrør fra anion exchange. SDS side gel viser anriking av YfeA (30 kDa) over rensing trinn. Svarte pilen angir plasseringen av electrophoretic migrasjon for YfeA. Molekylvekt standarder på høyre. (1) periplasm brøkdel. (2) Q anion utveksle kolonnen strømme gjennom. (3) Q anion exchange kolonnen peak elueringsrør. (4) superdex 200 pg gel filtrering kolonnen peak. C. YfeA berikelse-godt eksempel. Bildebehandling av SDS side gel fra B beregner samlede anriking av YfeA av densitometry å øke fra 8% av den periplasmic fraksjon til 61% av gel filtrering produktet. Boksene angir YfeA/totalt signal brukes til beregninger som densitometry. Massespektrometri analyse av eske bandet lane 4 oppdaget 259/280 YfeA aminosyrer, presentert i grønn understreke. Aminosyrer finnes i den eldre polypeptid representeres i fet svart bokstaver og aminosyrer komponere kløyvde signal peptid er representert i grå tekst i kursiv håndskrift. D. YfeA berikelse - dårlig eksempel. SDS side gel for YfeA rensing fra periplasm brøk, bruker trinn gradient elueringsrør fra anion exchange. SDS side gel viser anriking av YfeA over rensing trinn. Svarte pilen angir plasseringen av electrophoretic overføring av store protein miljøgifter forbedret under anion exchange kromatografi. Molekylvekt standarder på høyre. (1) superdex 200 pg gel filtrering kolonnen peak. (2) Q anion exchange kolonnen 250 mM NaCl trinn gradient elueringsrør. (3) periplasm brøkdel. Bildebehandling av SDS side gel fra D beregner marginale samlede anriking av YfeA av densitometry opptil 20% av gel filtrering produktet. Boksene angir YfeA/totalt signal brukes til beregninger som densitometry. Masse massespektrometri analyse av den av bandet merket med svarte pilen i lane 1 oppdaget 26 unike peptider av LivJ (39 kDa), 25 unike peptider av EfeO (41 kDa), og 17 unike peptider av LivK (39 kDa). Alle tre forurensninger er periplasmic E. coli SBPs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig2.jpg"> Figur 2. Apo YfeA og holo YfeA gel filtrering chromatograms. Svarte pilen angir plasseringen av ugyldige volum. Gel filtrering topper apo YfeA (svart kurve) og holo YfeA (blå kurve) Vis begge protein stater elute på samme elueringsrør volum, indikerer at apo YfeA renset fra periplasm brøken har en lignende etter radius som holo YfeA renset fra totalt mobilnettet innhold etter franske Trykk.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig3.jpg"> Figur 3. Apo YfeA og holo YfeA krystall morphologies. Holo YfeA krystalliseres som en monolittisk krystall, mens apo YfeA gir vanligvis tvillingmonterte krystaller i samme krystallisering tilstand. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig4.jpg"> Figur 4. Apo YfeA og holo YfeA X-ray fluorescens spektra. A. X-ray fluorescens spektra av holo YfeA som har blitt renset fra M9 minimal medier med ingen ekstra transisjonsmetall kosttilskudd, grønne kurve. Karakteristiske topper er merket for mangan, jern og sink. B. X-ray fluorescens spectra fra YfeA prøve produsert i forbindelse med YfeBCDE. Karakteristiske topper er merket for mangan, jern og sink. Blå kurve. X-ray fluorescens spektra av YfeA renset fra sammenheng med YfeBCDE og vellykket fraksjoneres periplasm brøkdel med minimal forurensning cytoplasmatiske overgangen metaller og/eller holo YfeA protein. Rød kurve. X-ray fluorescens spektra av YfeA renset fra konteksten for YfeBCDE med mislykkede fraksjoneres fra overdreven lyse og betydelig forurensning cytoplasmatiske overgangen metaller og/eller holo YfeA protein. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig5.jpg"> Figur 5. Generalisert arbeidsflyt fraksjoneres. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57169/57169fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57169/57169fig6.jpg"> Figur 6. 60 min radioaktivt metall opptak fraksjoneres dataene. Hvert eksperiment ble utført tre ganger, og feilfelt viser standardavviket. Rødt bar. E. coli celler som ikke inneholder den Yfe transporter transportere ca ~ 50% av de 52Mn i cytoplasma etter 60 minutter, og opprettholde lave nivåer av periplasmic 52Mn. blå linjen. E. coli cellene som inneholder Yfe transporter transport > 90% av de 52Mn i cytoplasma etter 60 minutter og opprettholde lave nivåer av periplasmic 52Mn. grønne linjen. E. coli celler som inneholder bare YfeA transport ca ~ 25% av de 52Mn i cytoplasma og beholde ~ 25% av den 52Mn i periplasm etter 60 minutter.
Radiometal brukt i dette arbeidet, 52Mn (t1/2 = 5.59 d), ble produsert på UAB Cyclotron anlegget (Birmingham, AL) av proton bombardement på en naturlig Cr mål og renset som tidligere rapportert19. Forsiktig: 52Mn er en fantes et positron emitter (β+avg = 242 keV, 29,4%), og avgir også flere høy energi gammastråling med høy intensitet (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Jeg = 90.0% 94,5%, 100%). Grunn av dette må eksperimentet utføres etter stråling beskyttelse prinsippene i ALARA, som beskrevet ovenfor. Alle elementer som radioaktivt avfall skal være riktig inneholdt, tydelig merket, og kastet i henhold til etablerte prosedyrer.

Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Viktig metall opptak i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, Radioisotopes, og cellen fraksjoneres

En protokoll for utvinning av en periplasmic transisjonsmetall Anstandsdame i sammenheng med partnerne innfødt bindende og Biofysiske karakteristikk av innholdet substrat av X-ray fluorescens og radiometal opptak er presentert.

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A fra Gram-negative bakterier

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraksjon i Conservation Science: Mot Rutine Crystal Structure Bestemmelse av korrosjonsprodukter på Heritage Kunstverk

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantifisere X-Ray fluorescens Data ved hjelp av kart

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic brikker for In Situ Crystal X-ray Diffraksjon og In Situ dynamisk lysspredning for føljetong krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-sensitive påvisning av kjemien i batterier gjennom myk X-ray absorpsjon spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-mediert Nucleation og vekst av Palladium metall nanopartikler

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Forbedre høy viskositet utelukkelse av Microcrystals for tid-løst føljetong Femtosecond krystallografi på røntgenlasere

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Kvantifisering av metall utvasking i immobilisert metal affinitet kromatografi

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Biologiske prøver Forberedelse for spesiering ved kryogen temperatur ved bruk av høyoppløselig røntgenabsorpsjonsspektroskopi

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...