Name: essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation
Uploaded: 2018-02-01T15:00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Данные были также собраны в GM/CA@APS, которая финансировалась целиком или частично с федеральных средств от национального института рака (ACB-12002) и национального института Генеральной медицинских наук (AGM-12006). Это исследование используется ресурсы расширенный источник Фотон (APS), Департамента энергетики США (DOE) управление науки пользователя объекта действуют для Доу отделение науки Аргоннской национальной лаборатории по контракту № ДЕ AC02-06CH11357. Использование передовых источника Фотон было поддержано США Министерство энергетики, управление науки, Управление основных энергетических наук, под контракт № W-31-109-Рус-38.
Мы хотели бы отметить ЗАО всеобъемлющем онкологический центр - масс спектрометрии/протеомики Общий фонд (P30CA13148-38) за их помощь в анализе масс-спектрометрии.
C.D.R. была поддержана грантом от университета штата Алабама в Бирмингем управлением многообразия, равенства и включение. L.L.R. была поддержана рентгенологического отделения университета штата Алабама в Бирмингеме. Министерство энергетики, управление науки, изотоп программа поддерживает 52Mn производства и Грант A.V.F.M. под DESC0015773.

<ol>
	<li>ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity+of+ABC+transporters.">Structural diversity of ABC transporters.</a> J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).</li><li>Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+classification+of+substrate-binding+proteins.">A structural classification of substrate-binding proteins.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).</li><li>Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hinge-bending+in+L-arabinose-binding+protein.+The+&amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34;+model.">Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The &amp;#34;Venus's-flytrap&amp;#34; model.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).</li><li>Hoeppner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+and+Their+Ligands:+Their+Importance+and+How+to+Crystallize+Them.">Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them.</a> Advanced Topics on Crystal Growth. , (2013).</li><li>Lee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+Zn(II)-free+Treponema+pallidum+TroA,+a+periplasmic+metal-binding+protein,+reveals+a+closed+conformation.">The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation.</a> J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).</li><li>Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+regulatory+role+for+the+histidine-rich+loop+in+the+zinc+transport+protein,+ZnuA.">Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA.</a> Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).</li><li>Yatsunyk, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+metal+binding+properties+of+ZnuA,+a+periplasmic+zinc+transporter+from+Escherichia+coli.">Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli.</a> J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).</li><li>McDevitt, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+mechanism+for+bacterial+susceptibility+to+zinc.">A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc.</a> PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).</li><li>Cou&#241;ago, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imperfect+coordination+chemistry+facilitates+metal+ion+release+in+the+Psa+permease.">Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease.</a> Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).</li><li>Abate, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apo,+Zn2+-bound+and+Mn2+-bound+structures+reveal+ligand-binding+properties+of+SitA+from+the+pathogen+Staphylococcus+pseudintermedius.">Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius.</a> Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).</li><li>Ahuja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+bacterial+ABC+transporter+inhibition+by+an+antibody+fragment.">Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment.</a> Structure. 23 (4), 713-723 (2015).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+Cells.">Fractionation of Cells.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Zhao, H., Martinis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+bacterial+compartments+to+track+movement+of+protein+synthesis+factors.">Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors.</a> Methods. 113, 120-126 (2017).</li><li>Brown, R. B., Audet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+techniques+for+single-cell+lysis.">Current techniques for single-cell lysis.</a> J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).</li><li>Bornhorst, J. A., Falke, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+proteins+using+polyhistidine+affinity+tags.">Purification of proteins using polyhistidine affinity tags.</a> Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).</li><li>Radka, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Yersinia+pestis+virulence+factor+YfeA+reveals+two+polyspecific+metal-binding+sites.">Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).</li><li>Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Scale+Production+and+Purification+of+a+Therapeutic+Antibody.">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J Vis Exp. (119), e55153 (2017).</li><li>Gasteiger, E., Walker, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+and+PET+Imaging+of+pharmacokinetics+of+manganese+in+mice+using+Manganese-52.">Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52.</a> PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).</li><li>Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+transferrin-independent+iron+transport+in+K562+cells.+Unique+properties+provide+evidence+for+multiple+pathways+of+iron+uptake.">Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake.</a> J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).</li><li>Makui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Escherichia+coli+K-12+Nramp+orthologue+(MntH)+as+a+selective+divalent+metal+ion+transporter.">Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter.</a> Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).</li><li>Forbes, J. R., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron,+manganese,+and+cobalt+transport+by+Nramp1+(Slc11a1)+and+Nramp2+(Slc11a2)+expressed+at+the+plasma+membrane.">Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane.</a> Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).</li></ol>

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Фракционирование клеток является полезным инструментом для специально зондировать содержимое клеточной отсека и может служить полезным инструментом для извлечения мелких молекул, таких как атомы металла, а также макромолекул таких белков. Стоит отметить, что фракционирование ячейки не является абсолютным методом и может быть подвержен ошибкам без тщательного внимания к смешивания/взмучивания, температуры инкубации и время инкубации. Неполные смешивания может привести к минимальным мембранное лизис и таким образом незначительным фракционирования, фракционирование при комнатной температуре может вызвать быстрый лизис обоих мембраны, что приводит к загрязнению периплазматическое фракции цитоплазматических содержимым, и Расширенные инкубации раз может также привести к чрезмерной лизис и, таким образом, доля загрязнения. Разумный компромисс для достижения эффективной и относительно законченным внешней мембраны лизис (при сохранении внутренней мембраны) — 20 минут инкубации над льдом в буфере гипотонический фракционирования. Еще одно соображение является метод извлечения, где суровые экстракции путем встряхивания или вихря может поставить под угрозу качество экстракт например вызывая агрегации белков. Рекомендуется осторожно перемешать такие как шпателем, инверсия или аспирационных пипетку для поддержания высокого качества материала для анализа ниже по течению. Очистка от препаративной клеток фракционирование может произойти с переменной эффективность как видно на рисунке 1. В одном эксперименте, YfeA начал как 8% от извлеченного периплазматическое содержания (рис. 1 c), в то время как в другом эксперименте, YfeA начал в 17% периплазматическое содержания (рис. 1 d). Эти различия могут возникать от нескольких причин, таких как выражение переменной условия (Добавление, ЭДТА в СМИ роста может увеличить экспрессии генов, регулируется голода таких механизмов, как мех регулирование Yfe промоутер), неоднократное использование замороженных Постоянные акции и человеческой ошибки. Вместо того, чтобы корректировать время инкубации, рекомендуется для наращивания масштабов подготовки. Очистка от periplasm фракция рекомендуется включать линейного градиента элюции от анион обмен хроматографического шаг. Шаг градиента элюции является стратегией элюции использует дискретные и резкие изменения в мобильных фазового состава (т.е., 0 мм NaCl, 50 мм NaCl, 150 мм NaCl и т.д.). Линейный градиент элюции является элюции стратегия, которая использует постепенного изменения в мобильных фаза состава (т.е. 0 мм NaCl, 5 NaCl, 10 мм NaCl, и т.д.). Градиент шаг полезным для разделения молекул, которые имеют различные сродства для стационарной фазы, и линейного градиента элюции полезен для разделения молекул, которые имеют аналогичные узы для стационарной фазы. В случае очистки белков с тегом не искусственной очистки (для усиления сродство для стационарной фазы) из клеток отсека, который богат видов уникальных белков, линейного градиента элюции рекомендуется отделить белки беспроцентное, который может Есть аналогичные сродства к стационарной фазы как протеина интереса. Как правило, доход по 1-2 мг очищенного АПО YfeA ожидается от каждого литра культуры, выражая YfeA от его эндогенного Y. pestis промоутер.
Рентгенофлуоресцентный — это метод, который позволяет детектива, чтобы быстро определить содержание металла в образце и информировать следователя о неожиданных металла включения, которые в противном случае было бы неизвестно. Хотя ЭДТА включен в буфере гипертонический фракционирование удалить слабо связанные или бесплатно металл, YfeA, производного от periplasm фракция может содержать некоторые holo белка. Учитывая, что металлические транспорт представляет собой динамичный процесс, возможно содержание белка holo происходит от YfeA, который до сих пор не предоставил его груз YfeBCDE. Стоит отметить что рентгенофлуоресцентный только измеряет общее содержание металлов и не указывать, если приказал в кристаллической решетке металла, или конкретно связан с белком. Чтобы определить, если металл приказал в кристаллической решетке и/или конкретно привязаны к белковой молекулы, требуется рентгеновского рассеяния сбора и обработки данных. Тем не менее рентгенофлуоресцентный позволяет для быстрый пример оценки металлических загрязнения и/или остаточные holo белка интеграции. Синхротронного излучения время ограничено и не всегда время разработать стратегию сбора данных рентгеновского рассеяния на каждый образец, таким образом рентгенофлуоресцентный — это ценный метод скрининга много кристаллов и их приоритетности для которых образцы рентгеновского рассеяние данные должны собираться. Кроме того рентгенофлуоресцентный включает сбор данных от образцов, которые могут не преломлять рентгеновские лучи. Во время сбора данных рентгеновской флуоресценции, порой сигнал может быть очень слабыми и результате спектры малоинформативным. Чтобы улучшить силу сигнала, либо рентгенофлуоресцентный или БЕЗУМНЫЙ сканирование, рассмотреть вопрос об увеличении времени экспозиции или уменьшения рентгеновского пучка затухания. Когда образец определяется для сбора данных рентгеновского рассеяния, рекомендуется собирать данные рентгеновского рассеяния на другой части образца, чем то, что был использован для рентгеновской флуоресценции и MAD, сканирование, чтобы свести к минимуму радиационного повреждения, улучшить качество данных коллекции и свести к минимуму любые возможности для сокращения аномальных сигнала.
Обнаружение радиоактивных трассеров требует наномолярных количеств материала или меньше, и использование этих Трейсеры как молекулярные отслеживания агентов предоставляет простой и чувствительный метод зондирующего клеточных процессов. Radiometal assay изложенные выше может использоваться для определения всего металлические поглощения, распределение по сотовой отсеков, а также темпы поглощения. Действительно каждая точка данных время требует фракционирование 40 минут; Однако как каждый момент времени будет достигнуто, клетки немедленно гранулированных и инкубировали в высокой соли буфера (рис. 5Шаг 1). Radiometal измерения СМИ, отбрасываются высокой соли буфера (рис. 5Шаг 1) и периплазматическое и цитоплазматических фракции после (рис. 5Шаг 3), свидетельствуют о высокой соли буфера инкубации успешно удаляет все оставшиеся несвязанные бесплатно металл, который задержался после первоначального центрифугирования после достижения момента времени. Первоначальный центрифугирования удаляет большинство (до 80%) несвязанные бесплатно металла и центрифугирования после инкубации в буфере высокой соли также удаляет дополнительные оставшиеся несвязанные бесплатно металла. Не ожидается, что любой затяжной несвязанные бесплатно металл значительно влияние металла транспорта в течение 40 минут фракционирования. Влияние фракционирования 40 минут на внутриклеточный транспорт металла является еще одним соображением для интерпретации данных разумно. Практически весь фракционирование протокола происходит над льдом, помимо 30 второй центрифугирования между шагами. Металлический транспорт время курс эксперименты показали, что поддержание клеток при температуре 4 ° C аннулирует металла транспорта20,,2122; Таким образом потому что экспериментов происходит над льдом, фракционирование 40 минут, как ожидается, не значительно увеличить металла уровней в periplasm цитоплазмы и металла уровни, как ожидается, будет представитель моменты времени, в которые были клетки Первоначально centrifugalized.
Определение относительного поглощения в разных отсеках сотовой может помочь информировать XFS данные, подтверждающие физиологический характер субстрата, а также включить следователю для дальнейшего зонд молекулярных детали механизма. Например, добавление генетических мутагенеза radiometal поглощение экспериментов обеспечивает прямой метод для укрепления ключевых функциональных остатков или молекулы участвует в субстрат транспорта. Преимущества radiometal поглощение экспериментов и анализа включают быстрый поворот, высокая пропускная способность, высокая воспроизводимость и распараллеливание экспериментов, сравнивая условия роста и генетической конструкции.

В грамотрицательных бактерий цитоплазматических бассейны атомов переходных металлов увеличилась и пополняется внутренняя мембрана ABC (АТФ привязки кассета) импортеров, которые смягчить металла транслокации через внутреннюю мембрану. Периплазматическое кластера A-1 субстрата связывающих белков (СБП) составляют группу сопровождающих, которые напрямую связать Атомы металла и паром их через periplasm, чтобы доставить их родственных ABC импортеров1. Другие кластеры СБП предназначены для перевозки субстратов, например хелатные металла (Кластер A-2), углеводы (кластеры B и D-1) и аминокислоты (групп B, C, F-2 и F-4); Тем не менее независимо от субстрата, СБП следовать эволюционно сохраняется c-образный зажим раза2. Обобщенные предлагаемый механизм для передачи субстрата SBP включает проходят серию искажения, которые напоминают Дионея3c-образный зажим. Как правило кластер A-1 СБП очищают в Холо (металл прыгните) форме, хотя изучение этих СБП ограничивается трудность в создании формы белка для экспериментов4АПО (металл бесплатно). На сегодняшний день стратегии для изучения АПО кластера A-1 СБП были ограничены мутагенеза, диализа и частичное денатурации с Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) хелатором5,6,,78 , 9 , 10 , 11. структурных данных, поступающих от этих экспериментов показывают, что кластер A-1 СБП не может точно следуют Дионея механизм. В настоящее время отсутствует из литературы является метод производства АПО A-1 СБП кластера в естественных условиях с помощью партнеров физиологических привязки.
Мы демонстрируем в первый раз, используя фракционировки клетки для того чтобы очистить YfeA, кластер A-1 SBP от Yersinia pestis, этиологический агент чумы, который был преобразован в Апо форму путем взаимодействия с его физиологических родственных импортер YfeBCDE ABC в ячейке. Мы покажем, что YfeA в форме энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (ЭЦП), также известный как рентгенофлуоресцентный Апо. Мы также продемонстрировать YfeBCDE функциональность путем объединения фракционировки клетки с высокочувствительным радиоактивных металлических поглощение исследования различать металлические поглощения всей внешней мембраны и металлических импорта через внутреннюю мембрану. Использование радиоактивных трассирующими позволяет для обнаружения ПГ/Л количество металлов, намного ниже, чем предел обнаружения техники такие как индуктивно сочетании плазменной масс-спектрометрии (ИСП-МС) или атомной абсорбционной спектроскопии (ААС). Это позволяет для минимальной возмущений изучаемой системы. Кроме того традиционные методы, перечисленные часто требуют больших объемов выборки, дополнительные постобработки и поворот вокруг времени, которые не являются типичными для радиоиндикаторных анализов. Таким образом используя радиоиндикаторных предоставляет удобный и простой метод для контроля металла и поглощения в ячейке. Это еще предстоит определить, если Апо, произведенных A-1 SBP кластера, с помощью этого метода будет повторить структурных замечаний от текущей практики, используемой для создания апо протеина.
Фракционирование клеток является установленным метод для отделять сотовой отсеков для неявные цели специально зондирующего их содержания в изоляции12. Фракционировки клетки обычно используется для подтверждения местоположения молекулы во время цикла клетки или измерения активности конкретного отсека13. Например можно assayed металла транспортной деятельности путем прощупывания сотовой отсеков для металлической подложки. Встраивание фракционировки клетки позволяет различия и сравнение металла поглощения всей внешней мембраны и металлических передачи через внутреннюю мембрану. Затем эти процессы в свою очередь может быть измерена с течением времени. В случае очищение протеина, наиболее распространенные методы лизис клеток и разделение растворимых компонентов из нерастворимых компонентов являются механические нарушения (то есть, измельчения, смешивания), высокого давления гомогенизации (т.е., Пресс французского давления клеток, клеток аннулятор) и ультразвуковой частоты (т.е., sonication)14. Использование ультразвуковых частот для Лизируйте клетки обычно лучше всего подходит для небольших объемов; Однако sonication известно для создания чрезмерного тепла, которое может денатурировать протеина. Чтобы избежать возникновения избыточного тепла, ультразвуковой частоты обычно применяются в последовательных коротких очередей, которые могут занять много времени и непреднамеренно снижают молекул ДНК на более мелкие фрагменты. Кроме того несколько дорогих sonication зонды могут потребоваться для препаративных и аналитических экспериментов, как каждый датчик имеет ограниченный диапазон для объема образца, который может быть обработан. Использование высокого давления, чтобы лизировать клетки избегает генерации чрезмерного тепла во время лизис клеток, охлаждение компонентов Пресс французского давления клеток до лизис или эксплуатации disruptor ячейки в холодной среде например холодной комнате. Как sonication зонды несколько наборов компонентов Пресс французского давления клеток может потребоваться приобрести обрабатывать широкий спектр образцов томов. Пресс французского давления клеток сборки легко подключиться, но неудобно работать и чистой, может быть тяжелым для перемещения и подвержены засорению из плотной образцов. Преимущества использования ультразвуковой частоты и высоконапорных систем для Лизируйте клетки включают высокий пример восстановления, способность обрабатывать несколько образцов с минимальными перекрестного загрязнения, и регулируемый наклон силы, которая может быть адаптирована для оптимизации лизис широкий спектр типов образцов. Оптимизация может произойти путем корректировки ультразвуковой частоты, длительности очередей, поршневые давления паундов на квадратный дюйм (psi) и количество проходов через прессу. Использование механического нарушения Лизируйте клетки могут быть наиболее технически тривиальным и наименее дорогой стратегия лизис клеток. Механическое разрушение может создавать проблемы в пример восстановления и не является идеальным для обработки нескольких образцов. Механические нарушения мягче образцы чем высокого давления или ультразвуковой частоты, но не высокую пропускную способность и подвержены неэффективных лизис. Существенное ограничение экспериментального механического нарушения, высокого давления гомогенизации и ультразвуковой частоты, является неконтролируемой нарушения всей сотовой архитектуры таким образом, что после лизиса, смешиваются все водные клеточных компонентов вместе. Кроме того все клеточных компартментов не нарушить в то же время; Таким образом содержимое отсеков, которые лизируют рано может быть предметом постоянной подрывной силы больше, чем содержимое отсеков, которые лизируют поздно. Фракционировки клетки позволяет для недорогой, технически простой, эффективной на основе отсек разделение содержимого ячейки избегая необходимости дорогостоящего оборудования и пример воздействия суровых, разрушительные силы.
В случае СПР импортированные субстрат вновь к потенциально апо протеина и восстанавливает holo белка во время лизиса, до течению хроматографии или другие методы очистки. Включение ЭДТА хелатором во время лизис представляет собой дополнительное препятствие, где метал близость в качестве первого шага очистки белков не возможно потому, что ЭДТА полосы металла из смолы хроматографии и предотвратить белка привязки15. Простое и недорогое решение является фракционировки клетки по осмотическим шоком, где дифференциального центрифугирования и общие лабораторные реагенты позволяют следователь тщательно извлечь достаточно белка для функционального анализа. Фракционирование осмотическим шоком использует двухэтапный изменения осмотического давления для отдельных клеточных отсека. Во-первых, гипертонический буфера заставляет клетки на зубчатые, как вода уходит каждой ячейки и во-вторых, гипотонические буфер вызывает клетки к набуханию как вода повторно входит в каждую ячейку. Тщательно контролируя, как долго клетки набухают, наружной мембраны можно выборочно лизированы (из-за накопления осмотического давления от входящей воды), таким образом опорожнения их содержимое в буфер. Сохранение внутренней мембраны гарантирует, что цитоплазматических содержимое сохраняются в spheroplasts и легко отделяются от периплазматическое содержимое центрифугированием.
YfeA является polyspecific SBP способны связывания железа, марганца и цинка атомов16. Относительные пропорции включены металла могут быть изменены согласно металлических добавок во время роста и assayed, рентгенофлуоресцентный такие как доступен в Аргоннской национальной лаборатории Advanced исходного фотона16. Рентгенофлуоресцентный позволяет следователю для быстро профиль широкий Ассамблея металлов без необходимости для больших или дифракционного качества кристаллов и даже может получить данные от поспешного или белковых раствор белка.
Рентгенофлуоресцентный может быстро выявить неожиданные результаты таких, как, в этом случае, основной субстрат YfeA, будучи цинка и не документированы физиологических субстратов железа или марганца16. Если используется перед сбором данных рентгеновского рассеяния, рентгенофлуоресцентный может сообщить следователю в экспериментальный дизайн, например, какие кромки металлической энергии использовать аномальных сбора данных рентгеновского рассеяния. Просто так полезно, как определить относительное обилие металла, рентгенофлуоресцентный можно также определить, если металл отсутствует в образце, обеспечивая быстрый метод разделения кристаллы, содержащие апо протеина от holo белка и оценки металла сигнала без необходимости для времени обработки данных. После выявления образец с сильным сигналом металла, точные длины волны для аномального рентгеновского рассеяния сбора данных может определяться несколькими волны аномальных дисперсии (MAD) сканирования.
Этот подробный протокол призван помочь новым экспериментаторы успешно выполняют клетки фракционирования и эффективное использование оборудования Синхротронное излучение профиль общее содержание металлов и продвигать исследования металла связывающих белков.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1097270100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1760-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMRESCO M9 Medium Broth</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9688886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris, Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, White Powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP922I-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR3-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28-9893-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-1154-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>230280</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

essential metal uptake in gram-negative bacteria: x-ray fluorescence, radioisotopes, and cell fractionation

Мы демонстрируем масштабируемый метод для разделения бактериальный periplasm от цитоплазмы. Этот метод используется для очистки периплазматическое белка для целей биофизические характеристики и мера субстрата передачи между периплазматическое и цитоплазматических отсеков. Тщательно ограничивая время periplasm отделяется от цитоплазмы, экспериментатора может извлечь протеина интереса и пробирного каждого отсека индивидуально для подложки без переноса загрязнения между отсеками. Экстракт белка от фракционирование могут быть далее проанализированы для определения трехмерной структуры или профили субстрата привязки. Кроме того этот метод может выполняться после инкубации с радиоиндикаторных определить общий процент поглощения, а также распределение трассировщик (и следовательно металла транспорт) на различных бактериальных средах. Эксперименты с радиоиндикаторных может помочь продифференцировать между физиологическим субстратом и артефакта субстрата, например тех, которые вызваны mismetallation.
Рентгенофлуоресцентный может использоваться, чтобы обнаружить наличие или отсутствие металлических включения в образец, а также оценки изменений, которые могут возникнуть в металлические включения условий роста, очистка условий или условий кристаллизации как продукт. Рентгенофлуоресцентный также обеспечивает относительный показатель изобилия для каждого металла, который может использоваться для определения лучших пик поглощения металла энергии использовать аномальных сбора данных рентгеновского рассеяния. Radiometal поглощение может использоваться как метод для проверки физиологический характер субстрата, обнаруженных рентгенофлуоресцентный, а так же поддерживает обнаружение Роман субстратов.

Watch this Scientific Journal Video about Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation at JoVE.com

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Основные металлические поглощения в грамотрицательных бактерий: рентгеновская флюоресценция, радиоизотопов и клеточной фракционирования

Протокол для извлечения сопровождающий периплазматическое переходных металлов в контексте своих партнеров родной привязки и биофизические характеристики его содержимое подложки путем рентгеновской флуоресценции и radiometal поглощение представлен.

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Рентгеновская дифракция в порошок по сохранению науки: На пути к Обычной кристаллической структуры Определение продуктов коррозии на наследие предметов искусства

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Количественная оценка рентгеновской флуоресценции данных с использованием карты

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Элементаль чувствительных обнаружение химии в батареи через мягкие рентгеновской спектроскопии поглощения и резонансных неупругого рентгеновского рассеяния

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Лиганд опосредованной зарождения и роста наночастиц металла палладия

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography

Количественная оценка металлоизмов в иммобилизованной хроматографии сродства металла

Contamination of enzymes with metals leached from immobilized metal affinity chromatography (IMAC) columns poses a major concern for enzymologists, as ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...