Name: size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans
Uploaded: 2018-02-27T15:00:00
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ありがとう分子生命科学 (MOBI) 博士後期課程・生物学部ミドル テネシー州立大学 (MTSU) でこの研究のための資金を提供します。プロジェクトはだった MTSU 財団 D.E.N. に与えられた特別なプロジェクトの補助金によって一部で賄われても。

注: は、クリプトコッカスがバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 病原体とそれを扱う研究者は適切な予防措置を取る必要があります。手続きの詳細な方法に安全に BSL 2 病原体で仕事見つけることができますセンター疾病管理 (CDC) のウェブサイトでは、それは処理のクリプトコッカスと接触しているすべての人はきちんと訓練されることに注意してくださいすることが重要病原体?...

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. 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何十年も、カプセルは mycologists および臨床医クリプトコッカスとクリプトコッカス症病原体の主要な病原因子としての役割のために興味があるための研究の主要な焦点をされています。カプセル サイズの系統間の違いを測定する顕微鏡を用いたと異なる成長の下で条件は、病原体と様々 な刺激 (すなわち、異なった環境条件に対する応答に関する重要な情報を提供できます。?...

毎年 25万人に影響を与えると年間 180,000 以上の死の結果、クリプトコッカスは、細胞内病原性酵母やクリプトコッカス症1,2,の病原3。 直撃鋭く病気4,5,6に受けやすく抗レトロ ウイルス療法に準備ができてアクセスを持っていない貧しい国の HIV 陽性患者であります。CDC からのデータは、サハラ以南のアフリカで、クリプトコッカスを殺すこと結核より多くの人々 毎年、レコード1に任意のエボラ出血熱流行より以上の毎月を示します。露出の最も一般的なルートは、7環境で一般的とされている乾燥の胞子を吸い込むから発生します。肺に入ると、クリプトコッカスの感染した個人内の成功に寄与するいくつかの病原因子があります。多糖類のカプセルは、acapsular 系統ではない病原性8と微生物の主な病原性因子と見なされます。
クリプトコッカスのカプセルは、3 つの主要なコンポーネントの成っている: glucuronoxylomannan (GXM)、galactoxylomannan (GalXM) とマンノタンパク質の利用 (MPs)9。MPs はカプセルの比較的マイナーな細胞壁関連コンポーネント、それらは免疫原性、ほとんどプロ炎症性応答9,10を促進することができます。対照的に、GXM と GalXM カプセルの大部分を構成する (> 重量 90%)11免疫抑制作用を持っていると。その免疫調節効果に加えて体内のカプセルの急速な拡大はホスト貪食細胞 (すなわち、好中球、マクロファージ)12で摂取する機械的な障壁を作成します。クリプトコッカスカプセルとその合成は、複雑ですが、全体的に、高められたカプセル直径増加病原性6,13,14と相関しています。これを考えると、迅速かつ正確に定量化カプセル測定できなければクリプトコッカス研究者にとって重要です。
クリプトコッカスセルとその多糖類カプセル動的構造し、時間15間の変更を表示します。カプセルは、密度、サイズ、およびホスト環境16,17,18の変化に対応したアセンブリに変更できます。低鉄または栄養レベル、血清、人間の生理学的 pH および増加の CO2の露出は、カプセルの成長16,18,19,20を開始する知られています。さらに、研究者は、21,22クリプトコッカスにそのホスト上の優位性を融資感染中陽性で有意差で生じる構造変化を示しています。これは、クリプトコッカスカプセルのアーキテクチャは、さまざまな方法で分析されているために知られています。電子顕微鏡は、たとえば、外部より透過性層23下内側の電子密度の高い層を持つ異種行列をカプセルには明らかにしました。光散乱と光ピンセットの使用は、その高分子プロパティ24をさらに解明する研究者を許可しています。我々 は、多糖類のカプセルは、複雑な分岐構造23知っている両方の静的および動的光散乱測定から結果を分析した。光ピンセットは、構造体の剛性をテストだけでなく、その抗体の反応性の24の評価に使用されています。ただし、クリプトコッカスカプセルのこれまでで最もよく使われる分析のサイズの測定であります。
カプセル サイズを定量化する研究者は、単純な測定をする必要がありますどのようなを使用: カプセルの線径。デジタル マイクロ スコープは、インドのインクまたは蛍光染料で染色複数のクリプトコッカスセル (通常数百) の画像をキャプチャする使用されます。それぞれの細胞体と周囲のカプセルのサイズが測定されます。データがコンパイルされ、カプセルの平均粒径は、セル全体の直径 (セル本体 + カプセル) から細胞体直径を差し引いて計算されます。この時点まで、これらの測定は手動で行われています。一般的に正確にしながら、研究者の欠点があるこの方法。数日かかるまたは手で分析する数週間を大きなデータ セット。主観とヒューマン エラーが結果に影響を与えるこれらの測定は手動で行われるため。
自動計算画像解析生体画像25,26,27のより速くより信頼性の高い分析を有効にする分子細胞生物学の多くの分野の研究者の必要不可欠なツールとなっています。精密な画像解析手法は、私のものは、複雑で膨大なデータ セットから定量的情報に必要です。しかし、いくつかの測定、特にクリプトコッカスカプセルの測定は、自動化が困難されています。正確に細胞壁とカプセルは、一般的に暗いリングの時に位相差顕微鏡を用いたイメージングとして表示されます、インターフェイスを識別することができますシンプルなしきい値を使用して解決するは面倒。さらに、クリプトコッカス培養細胞は一緒に群生する傾向があるし、細胞の正確な分割が正確な測定に必要です。
このプロジェクトの目的は、(i) カプセル誘導クリプトコッカス、 (ii) 比較とコントラスト墨標準プロトコルの 1 つを説明するためにだったし、蛍光染色直径計測をカプセルに関連する (iii) シンプルでインドのインク、画像解析ソフトウェア、(iv) を使用してセルをステンド グラスのイメージを使用してカプセルの直径を測定するための計算方法は、利点と手動でカプセルの直径を計測の自動化ソフトウェアを使用して制限を評価します。2 つの染色法、蛍光細胞壁とカプセルの標識のそれを見つけるより時間がかかる中、実験間の最も一貫した結果を提供します。ただし、両方のメソッドは、正常に区別するために私たちを有効に研究室と臨床クリプトコッカスの系統別展示カプセル サイズ。さらに、インドのインク染色画像からカプセルの直径の測定を自動化し、これはカプセルの手動計測を実行可能な代替であることがわかったことができました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの多糖類のカプセルが主な病原性因子と最もよくこの病原性酵母の側面を検討しました。カプセル サイズ系統によって大きく異なります、ストレスや低栄養状態に導入されたとき、急速に成長する能力を持って、積極的に株の病原性と相関しています。これらの理由から、カプセルのサイズは、クリプトコッカスの研究者の関心です。クリプトコッカスカプセルの成長が表現型のテスト中に系統の酵母やサイズ違いのさまざまな治療法の効果を理解するために誘導されます。ここで述べるカプセル誘導と比較 2 つの受け入れられた方法の染色とカプセルの直径を測定の標準的な方法の 1 つ: (i) インドのインクと、従来の光学顕微鏡と組み合わせて・ (ii) 共同で染色、ネガティブ染色細胞壁と共焦点顕微鏡によるカプセルの両方の蛍光染料。最後に、どのようにインドのインク染色サンプルからカプセルの直径の測定をすることができますを示す計算イメージ分析を使用して自動化します。

3 系統を用いてカプセル誘導、細胞染色、イメージング、および計測技術を示すためには、クリプトコッカス:共通、よ特徴付けられた実験室株、H99S30、および 2 つの臨床分離株の以前不明なカプセルの直径、B18 と B5231。
カプセル誘導、染色、およびインドのインクを使用して画?...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

多糖類のカプセルはクリプトコッカス ・ ネオフォルマンスの主な病原性因子とそのサイズが株の病原性と相関します。カプセル径測定は、表現型のテストと治療効果を測定するために使用されます。カプセル誘導の標準的な方法の紹介、染色し、直径を測定の 2 つの方法が比較されます。

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

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細胞質のCaの測定 2 +絶縁収縮リンパ管における

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

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マウスにおけるγHV68感染の測定

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

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免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

細菌性前立腺炎のマウスモデルにおける接触性アロディニアの測定

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

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の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

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マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

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日和見菌病原体への蛍光タグ付き遺伝子のバイオリスティック変容<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

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の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

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クリプトコッカスの種多糖類カプセルと細胞体の自動測定

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

マウスの唾液腺機能の測定法

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

クリプトコッカス ・ ネオフォルマンスでカプセルの直径のサイズの問題: 測定

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