Name: size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans
Uploaded: 2018-02-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Vi tackar Doktorsprogrammet molekylära biovetenskaper (MOBI) och avdelningen för biologi vid Middle Tennessee State University (MTSU) för att tillhandahålla finansiering för denna studie. Projektet var också delvis finansierad av ett specialprojekt bidrag till D.E.N. av stiftelsen MTSU.

Obs: C. neoformans är en patogen som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) och forskare som arbetar med det måste vidta lämpliga försiktighetsåtgärder. Detaljerade förfaranden på hur att säkert arbete med BSL-2 patogener kan hittas på Center for Disease Control (CDC) webbplats, men det är viktigt att notera att alla personer som kommer i kontakt med C. neoformans ordentligt bör utbildas i hanteringen patogena agens och bör alltid bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), allmänt latex eller ...

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

Decennier, har kapseln varit ett stort fokus på forskning för både mykologer och kliniker intresserad C. neoformans och kryptokockos beror på dess roll som en större virulens faktor för patogen. Med mikroskopi att mäta skillnader i storlek mellan stammar och under olika tillväxt villkor kan ge viktig information om patogenen och dess svar på olika stimuli (dvs, det olika miljöförhållanden, potentiella läkemedelsbehandlingar, etc.) här har vi sammanställt en metod för att framkal...

Som drabbar en kvarts miljon människor varje år och leder till mer än 180 000 dödsfall årligen, är Cryptococcus neoformans en patogen, intracellulära jäst och vilka smittämnen av kryptokockos1,2, 3. hårdast är HIV-positiva patienter i fattiga länder som inte har tillgång till antiretroviral behandling, vilket gör dem mycket mottagliga för den sjukdom4,5,6. Data från CDC visar att i subsahariska Afrika, C. neoformans dödar fler människor än tuberkulos årligen och mer varje månad än någon ebolautbrottet på posten1. Vanligaste exponeringsvägen uppstår från att andas in desiccated sporer som är vardagsmat i den miljö7. Ovanför inlåtande lungorna, finns det flera virulensfaktorer som bidrar till framgång för C. neoformans inom infekterade individer. Polysackarid kapseln anses mikrobs primära virulens faktor, som acapsular stammar inte är virulent8.
Cryptococcal kapseln består av tre principen komponenter: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), och mannoproteins (MPs)9. MPs är en relativt liten cellväggen-associerade komponent i kapseln, de är immunogena och kan främja en mestadels pro-inflammatoriska svar9,10. Däremot GXM och GalXM utgör huvuddelen av kapseln (> 90% av vikten) och har immunsuppressiva effekter11. Förutom dess immunmodulerande effekter skapar den snabba utvidgningen av kapsel i vivo en mekanisk barriär ingestion av värd Fagocytos celler (dvs, neutrofiler och makrofager)12. C. neoformans kapseln och dess syntes är komplexa, men sammantaget ökade kapsel diameter är korrelerad med ökad virulens6,13,14. Mot denna bakgrund är det viktigt för C. neoformans forskare att kunna snabbt och exakt kvantifiera kapsel mätningar.
Både C. neoformans cellen och dess polysackarid kapsel är dynamiska strukturer och visa förändringar över tid15. Kapseln kan ändra i densitet, storlek och montering som svar på förändringar i den mottagande miljö16,17,18. Lågt järn eller näringsnivå, exponering för serum, människans fysiologiska pH och ökade CO2 är kända för att initiera kapsel tillväxt16,18,19,20. Dessutom har forskarna visat strukturförändringar som resulterar i betydande skillnader i immunoreaktivitet under en infektion, utlåning en fördel till C. neoformans över dess värd21,22. Detta är känt eftersom arkitekturen av C. neoformans kapseln har analyserats i en mängd olika sätt. Elektronmikroskopi, exempelvis har avslöjat att kapseln har en heterogen matris med ett inre elektron-täta lager under en yttre, mer genomsläppliga lager23. Ljusspridning och användning av optisk pincett låtit forskare att ytterligare klarlägga dess makromolekylära boenden24. Analysera resultaten från både statiska och dynamiska ljusspridning mätningar, vet vi att den polysackarid kapseln har en komplex förgrenade struktur23. Optisk pincett har använts för att testa styvhet struktur samt utvärdera dess antikropp reaktivitet24. Särklass mest ofta sysselsatta analys av C. neoformans kapseln är dock mätningen av dess storlek.
För att kvantifiera kapsel storlek, forskare använder vad som borde vara en enkel mätning: linjär diametern på kapseln. Digitala Mikroskop används för att fånga bilder av flera C. neoformans celler (allmänt hundratals) färgas med tusch eller fluorescerande färgämnen. Varje cell kropp och omgivande kapsel storlek mäts. Uppgifterna sammanställs, och den genomsnittliga diametern av kapseln beräknas genom att subtrahera cellkroppen diameter från hela cellen diameter (cell kropp + kapsel). Fram till denna punkt, har dessa mätningar gjorts manuellt. Medan generellt korrekt, har denna metod nackdelar för forskare. Stora datamängder kan ta dagar eller veckor att analysera för hand. Och eftersom dessa mätningar sker manuellt, subjektivitet och mänskliga misstag kan påverka resultatet.
Automatiserad computational bildanalys har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare inom många områden i molekylär cellbiologi, möjliggör snabbare och mer tillförlitlig analys av biologiska bilder 25,26,27. Exakt bild analystekniker är nödvändiga att gruvan kvantitativ information från vad är ofta komplexa och enorma datamängder. Vissa mätningar, särskilt mätning av C. neoformans kapsel, har dock svårt att automatisera. Att korrekt identifiera gränssnittet mellan cellväggen och kapsel, som allmänt visas som en mörk ring när fotograferad av faskontrast mikroskopi, kan vara besvärligt att lösa med hjälp av ett enkelt tröskelvärde. Ytterligare, C. neoformans celler i kultur tenderar att klumpa ihop och korrekt segmentering av cellerna är nödvändigt för noggranna mätningar.
Syftet med detta projekt var att a illustrera en av standardprotokollen för kapsel induktion i C. neoformans, (ii) jämför och kontrast India färgpulver och fluorescens färgning som de tillhör för att kapsel diameter mätningar, (iii) utveckla enkla, kalkylmässiga metoder att mäta kapsel diameter använder bilder av India färgpulver färgade celler med hjälp av ett bildbehandlingsprogram för analys, och, (iv) bedöma fördelar och begränsningar för att mäta kapsel diameter manuellt och använda programvara automation. Vi finner att av de två färgning metoderna, fluorescerande märkning av cellväggen och kapsel, medan mer tidskrävande, gav de mest konsekventa resultat mellan experiment. Men båda metoderna aktiverat oss att framgångsrikt skilja mellan lab och kliniska C. neoformans kapsel stammar uppvisar olika storlekar. Vidare kunde vi automatisera mätning av kapsel diameter från India färgpulver målat bilder och fann att detta var ett lönsamt alternativ till manuell mätning av kapsel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

Den polysackarid kapseln av Cryptococcus neoformans är primära virulens faktor och en av mest studerade vanligaste aspekter av denna patogena jäst. Kapselns storlek kan variera kraftigt mellan stammar, har förmågan att växa snabbt när introducerade stressande eller låg näringsrika förhållanden och har varit positivt korrelerad med stam virulens. Av dessa skäl är storleken på kapseln av stort intresse för C. neoformans forskare. Tillväxten av C. neoformans kapseln induceras under fenotypiska test för att förstå effekterna av olika behandlingar på jäst eller storlek skillnader mellan stammar. Här beskriver vi en av standardmetoderna för kapsel induktion och jämför två godkända metoder för färgning och mäta kapsel diameter: (i) Indien bläck, en negativ fläcken, används i samband med konventionella ljusmikroskopi och (ii) Co färgning med fluorescerande färgerna av både cellväggen och kapsel följt av konfokalmikroskopi. Slutligen visar vi hur mätning av kapsel diameter från Indien färgfläckade prover kan vara automatiserad använder computational bildanalys.

För att illustrera kapsel induktion, cell färgning, bildbehandling och mätteknik, vi använde tre stammar av C. neoformans: det gemensamma, välkarakteriserad laboratoriet stam, H99S30, och två kliniskt isolerade stammar av tidigare okänd kapsel diameter, B18 och B5231.
Arbetsflödet för kapsel induktion, färgning och bild förvärv med tusch visas i <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Mätning av kapsel Diameter i Cryptococcus neoformans

Den polysackarid kapseln är primära virulens faktorn i Cryptococcus neoformans, och dess storlek korrelerar med stam virulens. Kapselns diameter mätningar används i fenotypiska test och att mäta terapeutisk effekt. En standardmetod för kapsel induktion presenteras här, och två metoder för färgning och mäta diameter jämförs.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Mätning av cytosoliska Ca 2 + I enstaka kontraktila lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Mätning av γHV68 infektion hos möss

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Mätning av taktil allodyni i en murin modell av bakteriell prostatit

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualisera Icke lytisk Exocytos av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Från Makrofager Använda Digital Light mikroskopi

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Makrofag Kolesterol Utarmning och dess effekt på Fagocytos av<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistisk Transformation av en fluorescerande taggade gen i Opportunistic svamppatogen<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

mätning av<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivitet av HIV-1 Preintegration Anläggningar

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatiserad mätning av Cryptococcal arter polysackarid kapsel och cellkroppen

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

En metod för mätning av Saliv-körtel funktion hos möss

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...