Name: formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00
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这项研究得到了捷克科学基金会 (GACR, 格兰特 17-12816S) 的支持。

所有动物实验都是按照《赫尔辛基宣言》 (311/1997, 捷克共和国农业部) 的规定进行的, 这是根据《关于保护和使用实验动物的条例》进行的。
1. 肝微粒体和胞浆组分的分离
<ol><li>用简单的微分离心法 (10.5万 x g) 制备大鼠肝脏亚细胞分 (微粒富含 P450 酶或富含硝酸或可溶性过氧化物的 cytosols)。 注: 颗粒和上清液分别作为微粒和 cytosols。<ol>
<li>用50毫米三盐酸缓冲液将肝...

本文展示了一种广泛应用的方法来研究化学物质对代谢中间体 bioactivated 的效力, 从而产生共价 DNA 加合物。这是一个关键的问题, 因为评价环境化学物质或药物对产生共价 DNA 加合物的代谢产物的作用, 是癌症及其治疗发展的一个重要领域。致癌物质对 DNA 的修饰被认为是肿瘤发展的原因, 现在被判定为致癌物质引起的致癌的中心教条。这一建议得到了各种结果的证实, 例如: (一) 各种致癌物的致癌?...

外来化合物 (环境化学物质或药物) 的新陈代谢发生在两个阶段 1.阶段 I 和 II 的目的是使最初疏水性 (不水溶性) 化合物更亲水性 (水溶性), 从而使它们容易 excretable 通过尿, 粪便或汗水。第一阶段 (功能化) 反应包括氧化、还原和羟化酶催化的酵素, 如细胞色素 P450s (P450s, CYPs), 过氧化物 (I. e, 环氧合酶, COX), 酮酮硝酸 (AKRs) 和微粒体黄素含 monooxygenases (FMOs)。第一阶段还包括减少反应, 介导的各种硝酸即,微粒体: 细胞色素 P450 还原酶 () 和胞浆 NAD (P) H: 醌氧化还原酶 (NQO1), 黄嘌呤氧化酶 (XO) 和醛氧化酶 (AO) 1.在第二阶段 (共轭) 中, 第一阶段所附的官能团用于共轭小极性分子, 进一步增加极性。考虑参与第二阶段反应的酶的例子包括 sulfotransferases (结果), N, O-乙酰转移酶 (NATs), 甲基转移酶如邻苯二酚-O-甲基 (COMT), 谷胱甘肽 S-转移酶 (禾采赞) 和苷二磷酸 glucuronosyltransferases (UGTs) 1。然而, I. 期和 II. 类酶的分类并不是硬性的, 有些酶可以被归类为任何一类。
P450 酶 (EC 1.14.14.1) 是含有多种生物的蛋白质的血红素, 参与多种化学物质的转化, 催化其转化为3,4。P450 酶催化许多基质的羟基化, 反应中, 氧气的一个原子被引入外来化合物分子中, 而第二个氧原子通过需要两个电子的反应而被还原形成水 [方程 (1)]3,4:
RH + O2 + NADP + h+ →卢武铉 + h2O + + (1)
哺乳动物细胞内质网膜中的 P450 酶 (微粒 P450 系统) 是酶甲烷系统的成员, 进一步包含了细胞色素 P450 还原酶 () 和细胞色素 b 5 , 该酶的基质称为 NADH: 细胞色素b5 还原酶。一个普遍接受的理论假设, P450 所需的两个电子的供体是系统。然而, 细胞色素b5 也可能充当 P450 电子的捐助者, 即作为电子减少 P450 的捐助者, 在其反应周期的第二次还原期间, 它与 NADH 一起行动: 细胞色素b5 还原酶2,3,4。
哺乳动物利用各种 P450 酶 (例如,家庭5、8、11、17、19、21、24、26和27的酶, 用于合成有价值的内源化合物, 如类固醇, 并用于天然产物的分解代谢2,3.其他 CYP 哺乳动物的酶, 如人类 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 和 3A4, 代谢外源化学药品作为药物。5,6最重要的酶催化代谢的药物是 CYPs 的3A 亚科, 特别是 CYP3A4。外来化合物的转换, 如亲致癌物和亲毒物, 由人类 CYP1A1、1A2、1B1、2a6 型坦克、2E1和3A4 2 5 介导.大多数这些 CYPs 都存在于肝脏中 (除了 CYP1A1 和 1B1)。然而, CYPs 也表达在一些肝外器官。这种 P450s 可能具有很大的意义, 主要是在参与它们在 bioactivation 代谢化学物质 (药物) 到反应中间体的这些器官7。各种 P450s 都是由其基底的几种化合物引起的, 但不一定如此。
许多 P450 酶在化学 (药物) 毒性中起着作用。它们不仅可以将外来化合物转化为解毒代谢物, 还能将它们激活到反应性物种, 从而改变另外表现出不同生物特性的内源大分子, 通常会引起它们的毒性。DNA、脂质和蛋白质可能是由活性化学物质产生的反应性 electrophiles 和自由基修饰的靶点。在 DNA 的情况下, 解决几个重要的基因应答及其机制已经被称为2,3,4,5。
DNA 的变化会导致细胞生长控制的减少, 这种现象被认为是导致致癌过程发展的主要因素。生成具有致癌效力的化学物质的共价 DNA 加合物被认为是致癌过程启动阶段最重要的步骤之一8, 9, 10, 11.结果表明, dna 加合物的形成与肿瘤发生之间存在关系, 而 dna 加合物的数量减少化学 8, 9, 10,11,12,13,14. 致癌/药物衍生的 dna 加合物的形成依赖于 dna 的个体基础, 并受 dna 中这些碱基序列的影响。dna 加合物的修复依赖于它们的位置 (在转录或非转录 dna 链上) 和类型的修改核苷酸序列8, 11, 12, 15, 16。
在本文中, 我们描述了使用酶催化转化的化学物质 (药物) 的过程, 以调查其效力, 以活化成代谢物, 改变 dna (生成 dna 加合物)。对于共价 DNA 结合, 测试化合物通常应由氧化或还原反应激活, 取决于个别药物。被测试的化学物质的氧化或还原活化由 P450-dependent 酶系统介导的微粒体亚细胞分数或减少与硝酸目前在微粒 (NADH: 细胞色素b5 还原酶, P450 酶) 和细胞胞浆亚组分 (NQO1, XO, AO, 过氧化物酶)。反应性代谢产物随后绑定到 dna 加合物 dna 的形成。由于氧化和还原反应对于激活几种药物对这些活性物种都很重要, 本文介绍了采用氧化还原酶体系的实验过程。此外, 还详细介绍了能够检测和量化这些 DNA 加合物的适当方法。
两个独立的程序, 以确定测试化学, 激活的酶系统, 是绑定到 DNA 的建议: 32p-postlabeling 技术和利用放射性标记化合物 (e. g, 3H 或14C)。对于第一个飞行员, 建议筛选32p-postlabeling 检测。精确评价的溶液中 DNA 含量的测定必须在两种方法之前。
32p-postlabeling 技术利用非放射性化学物质 (致癌物/药物) 修饰的 DNA 的酶水解, 3´-phosphodeoxynucleosides, 在5´中加磷酸化与放射性磷 (32P)-OH 位置, 并通过色谱17 (图 1) 将化学核苷酸加合物从正常 (未修改) deoxynucleotides 分离出来。该化合物修饰的 DNA 由限制性、micrococcal 核酸酶和 exonuclease 的混合物水解而成, 称为脾脏磷酸二酯酶。含有正常 (未修改) 和修饰的 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates 的水解 DNA 的混合物, 与 [γ-32P] atp 在 9.5 pH 值的载体 (非放射性) atp 和 T4-polynucleotide 激酶的存在下反应, 形成 5´-32P 标记的3´、5´ bisphosphates ("标准" 过程图 1)。所使用的碱性 pH 值能将 T4-polynucleotide 激酶的酶活性降到最低, dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´ monophosphates。在聚乙烯亚胺 (PEI) 纤维素上采用多向阴离子交换薄层色谱 (TLC)对32 P 标记的加合物进行分离和解析, 其标记 deoxynucleotides 不经化学修饰 (图2).在第一和第二洗脱步骤 (在 D1 和 D2 方向), 标记正常 (未修改) deoxynucleotides 以及 [32P] 磷酸盐是洗脱从开始的薄层-裴-纤维素板使用电解液的水溶液到一个短的片断色谱纸应用于薄层板的顶部, 而含有束缚化学物质 (致癌物/药物-加合物) 的 deoxynucleotides 在培纤维素板的起始处保持, 以进一步解决在 D3 和 D4 方向有几个不同的溶剂系统 (图 2)。加合物的定位是使用屏幕增强显影进行的;分离的加合物被发现作为黑暗的可认识的斑点在 x 射线影片。斑点的区域从板材被切除并且用于定量放射性由液体闪烁或切伦科夫计数。目前还使用了一种存储荧光粉成像方法, 用于在32P-postlabeling 检测的图谱上对 DNA 加合物进行映射和量化。18快速成像机经常用于检测和量化 DNA 加合物。此方法比屏幕增强显影19技术提供的检测32P 的灵敏度高10倍。
DNA 加合物的数量被确定为相对加合标记 (RAL) 的值, 使用等式 (2) 计算如下:
cpm.在加合 deoxynucleotides RAL =-----------------------------------------------------------------------------------------(2) 32p-ATP (cpm/pmol) x pmol deoxynucleotides 的特定活动
RALs 的值是 adducted deoxynucleotides 的计数率与总计 [adducted 和正常 (未修改) deoxynucleotides] deoxynucleotides20、21的计数率的比率。但是, 此计算基于加合物和正常deoxynucleotides22 的相同标记效率。32postlabeling 技术的经典 ("标准") 过程适用于各种 dna 加合物 (笨重和/或非笨重的加合物), 然而, 它的灵敏度并不令人满意, 以检测在 DNA 中发现的低量加合物。使用此过程, 107中未修改的 deoxynucleotides dna (0.3 fmol 加合/µg dna) 中的加合量是可检测的。
对这种经典的32postlabeling 程序进行了多种修改, 提高了该技术的灵敏度。通过对 [γ-32P] ATP (强化过程) 的限制水平, 对32p 标记测定加合物的灵敏度达到了 10-100 倍以上。23,24进一步的过程, 增加了32p-postlabeling 方法的灵敏度, 利用含有加合物的消化 DNA 的孵化与核酸酶 P1 (从青霉马勃) 21(图 1)。这种酶倾向于 dephosphorylate 未修改的 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates, 而 deoxynucleotides 与绑定化学品 (adducted 核苷酸) 本质上不是这种酶的基质。因此, 去磷酸化 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates(即、deoxyribonucleosides) 不是由[32 p] 磷酸盐从γ-32 p] ATP 磷酸化而成的。然而, 某些化学物质被束缚的核苷酸 (adducted deoxynucleotides), 如 C8 脱氧的芳胺类加合物, 可以用这种酶 bedephosphorylated。与此相反, 大多数其他加合物(例如, 加合物在 N 2 脱氧中替换) 不是核酸酶 P1 去磷酸化的.对32postlabeling 的这种修改使此方法具有更高的灵敏度, 从而提高了三多个数量级的敏感性。此外, 此版本的32p-postlabeling 提供了一种方法, 即可以利用较高数量的 DNA (5-10 µg) 和过量的无载波 [γ- 32P] ATP。
加合物25 描述的另一种方法是利用笨重的核苷酸加合物的物理化学性质, 可以在相转移剂四丁基的存在下提取到 n 丁醇中。氯化物 (TBA) (图 1) 在 [32P] 磷酸盐标记之前, 而未修改的 deoxynucleotides 是由这种有机溶剂提取出来的。然而, 较少疏水性加合物, 例如 deoxynucleotides 改性与非芳香的笨重的基团或小烷基残渣, 没有有效地提取与n-丁醇。因此, 在对32postlabeling 方法进行此修改分析时, 它们基本上是无法检测到的。
前面提到的32postlabeling 的版本都增加了 DNA 加合物的灵敏度和量化能力 (多达三级), 能够检测到每109、10正常核苷酸 (0.3-3 amol/µg DNA)。这两种方法被推荐用于测试化学品的效率, 以共价键绑定到 DNA, 因此, 他们在这项工作中详细描述。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0032.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>70390-11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADPH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human liver microsomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>452172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Hydroxypyrimidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H56800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease P1 from Penicillium citrinum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrabutylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4-polynucleotide kinase</td>
			<td>USB Corp</td>
			<td>70031Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]ATP</td>
			<td>Hartman Analytic GmbH</td>
			<td>FP-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>801053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packard Instant Imager A202400</td>
			<td>Packard</td>
			<td>G120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellipticine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>285730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Nitrobenzanthrone</td>
			<td colspan="2">prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

由化学物质或具有致癌效力的药物形成的共价 DNA 加合物被认为是致癌过程起始阶段最重要的因素之一。这种共价键被认为是肿瘤发生的原因, 现在被评估为化学致癌的中心教条。在这里, 使用细胞色素 P450 和其他生物转化酶催化反应的方法来研究化学物质或药物对形成这些 DNA 加合物的代谢物的活性的效力。介绍了用细胞色素 P450 或其他生物转化酶 (微粒体和胞浆样品) 分离具有生物转化酶的细胞组分的方法, 即, 过氧化物, 细胞色素 P450 氧化还原酶 (P) H: 醌氧化还原酶, 或黄嘌呤氧化酶)。此外, 描述的方法可以用于代谢活化的分析化学物质的这些酶, 以及那些分离的 DNA。此外, 能够检测和量化化学/药物衍生 DNA 加合物的适当方法,即,对32 P postlabeling 技术的不同修改和使用放射性标记分析的化学品, 是详细显示。

使用这里描述的协议, 利用酶催化活化 (即, P450, 过氧化物酶, 还原酶), 以调查化学物质 (致癌物/药物) 的效力, 将代谢成中间体, 导致其共价绑定到 dna (生成 dna 加合物), 我们能够解决 (i) 抗癌剂 ellipticine 药理作用的新机制 (查看,29, 30, 31), (二) 两种病因学肾病与上尿路癌相关的植物生物碱马兜铃酸 ...

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Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

酶活化致癌物和药物对共价 DNA 加合物的生成研究体外及其对32 P-postlabeling 的测定

评价环境化学物质和药物的效力, 将其酶 bioactivated 到产生共价 DNA 加合物的中间体, 是癌症及其治疗发展的一个重要领域。方法描述了复合活化形成 DNA 加合物, 以及检测和定量的技术。

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

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