Name: formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Czech Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (311/1997, Ministeriet for landbrug, Tjekkiet), som er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.
1. isolering af hepatisk mikrosomale og cytosole fraktioner
<ol><li>Forberede lever subcellulært fraktioner (microsomes rig på P450 enzymer eller cytosols rige i reductases eller opløselige peroxidases) fra rotter ved simpel differential centrifugering (105.000 x g). Bemærk: Pe...

I dette papir, er det påvist, bredt tilgængelige metoder til at studere styrken af kemikalier til at være bioactivated til metaboliske mellemprodukter, hvilket resulterer i generation af kovalent DNA adukter. Dette er et afgørende spørgsmål, fordi vurdering af styrken af miljømæssige kemikalier eller lægemidler af deres enzymatiske aktivering til metabolitter generere kovalente DNA adukter er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Ændring af DNA af kræftfremkaldende stoffer betragtes som ?...

Metabolismen af fremmedstoffer (Miljøkontaminanter eller narkotika) forekommer i to faser1. Faser I og II har til formål at gøre de oprindeligt hydrofobe (ikke vandopløselig) forbindelser mere hydrofile (vandopløselige), hvilket gør dem let excretable via urin, afføring eller sved. Fase I (functionalization) reaktioner omfatter oxidation, reduktion, og hydroxylering katalyseres af enzymer såsom cytokrom P450s (P450s, CYPs), peroxidases (dvs., cyclooxygenase, COX), aldo-keto reductases (AKRs), og mikrosomalt Flavin-holdige monooxygenases (FMO'er). Fase I indeholder også reduktion reaktioner, medieret af en række reductases dvs mikrosomale NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytosole NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthin oxidase (XO) og aldehyd oxidase (AO)1 . I den anden fase (konjugering), funktionelle grupper, der var fastgjort i fase brugte jeg konjugat små polære molekyler for at øge polaritet. Eksempler på enzymer anses for at deltage i fase II omfatter sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT'er), methyltransferases såsom catechol -O- methyltransferase (COMT), glutathion S- reaktion transferaser (GSTs), og uridine ud glucuronosyltransferases (UGTs)1. Klassificering af enzymer i fase I eller II er, dog, ikke stive, og nogle enzymer kan velsagtens grupperes i enten kategori.
P450 enzymer (EF 1.14.14.1) er hæm indeholdende proteiner til stede i forskellige organismer, der deltager i biotransformation af mange kemikalier, katalysere deres konvertering3,4. P450 Enzymer katalyserer hydroxylering af mange substrater, med en reaktion, hvor ét atom af dioxygen er indført i molekyle af fremmedstoffer, mens det andet atom ilt, er reduceret til form vand ved den reaktion, der kræver to elektroner [ligningen (1 )]3,4:
RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
P450 enzymer lokaliseret i det endoplasmatiske reticulum membran af mammale celler (mikrosomale P450 systemer) er medlemmer af multienzyme monooxygenase system, hvilket yderligere indeholder NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytokrom b5 , substrat enzymet betegnes som NADH: cytokrom b5 reduktase. En generelt accepteret teori hypothesizes, at donor af to elektroner til P450 er NADPH/POR system. Ikke desto mindre kan cytokrom b5 også fungere som en donor af elektroner for P450, nemlig som en donor af elektron reduktion P450 under anden reduktion af sin reaktion cyklus, hvor det fungerer sammen med NADH: cytokrom b5 reduktase2,3,4.
Pattedyr udnytte forskellige P450 enzymer (f.eks. enzymer familier 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 og 27) til syntese af værdifulde endogene stoffer, såsom steroider, og bruge dem til katabolisme af naturprodukter2,3 . De andre CYP pattedyr enzymer, såsom menneskelige CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2D 6 og 3A4, nedbryde eksogene kemikalier, der anvendes som lægemidler. 5 , 6 de mest vigtige enzymer katalysere metabolisme af narkotika er CYPs af 3A underfamilie, især CYP3A4. Konverteringer af fremmedstoffer, som pro-kræftfremkaldende og pro-giftstoffer, er medieret af menneskelig CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 og 3A42,5. De fleste af disse CYPs findes i leveren (undtagen CYP1A1 og 1B1). Ikke desto mindre, CYPs er også udtrykt i flere ekstrahepatisk organer. Sådanne P450s kunne være af stor betydning, overvejende når deltager de i bioactivation metabolisme af kemikalier (narkotika) til reaktiv mellemprodukter i disse organer7. Forskellige P450s er fremkaldt af flere forbindelser, der er deres substrater, selv om dette ikke nødvendigvis er tilfældet.
Mange P450 enzymer spiller en rolle i kemiske (narkotika) toksicitet. De kan konvertere fremmedstoffer ikke kun i deres metabolitter, afgiftning, men også aktivere dem reaktive arter, som ændrer endogene makromolekyler, der desuden udstiller forskellige biologiske egenskaber, normalt forårsager deres toksicitet. DNA, lipider og proteiner kan være mål for deres ændring af reaktive electrophiles og radikaler genereret fra aktiveret kemikalier. I tilfælde af DNA, løse flere vigtige gen svar og deres mekanismer er allerede kendt2,3,4,5.
Ændringer i DNA kan resultere i en nedgang i celle vækst kontrol, og dette fænomen er anset for at være den dominerende faktor, der fører til udvikling af kræftfremkaldende processer. Generation af kovalent DNA adukter med kemikalier med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste skridt i indledningen fase af kræftfremkaldende processer8,9,10,11. Det blev påvist, at relationer mellem dannelsen af DNA adukter og tumordannelse opstår, mens et fald i mængden af DNA adukter er ansvarlig for naturstoffers8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. dannelsen af kræftfremkaldende/stof-afledte DNA adukter afhænger af enkelte baser i DNA, og påvirkes af sekvenser af disse baser i DNA. Reparationer af DNA adukter er afhængig af deres placering (på den transskriberede eller ikke-transskriberede DNA streng) og typer af modificerede nukleotid-sekvenser8,11,12,15, 16.
I denne artikel vil vi beskrive procedurer udnytter de enzym-katalyserede konvertering af kemikalier (medicin) at undersøge deres potens skal aktiveres i metabolitter, som er modificeret DNA (generere DNA adukter). Kovalente DNA bindende, testforbindelsen bør normalt være aktiveret enten af oxidative eller reduktiv reaktioner, afhængigt af individuelle narkotika. Oxidative eller reduktiv aktivering af testede kemikalier er medieret af et P450-afhængige enzymatisk system i de mikrosomale subcellulært brøkdel eller ved reduktion med reductases findes både i microsomes (POR, NADH: cytokrom b5 reduktase, P450 enzymer) og i cellulære cytosole subcellulært fraktioner (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reaktive metabolitters derefter binde til DNA danner DNA adukter. Fordi både oxidative og reduktiv reaktioner er vigtigt at aktivere flere lægemidler til disse reaktive arter, er de eksperimentelle procedurer beskæftiger oxidation/reduktion af enzymatiske systemet beskrevet. Ydermere, egnede metoder i stand til at påvise og kvantificere disse DNA adukter er beskrevet i detaljer.
To uafhængige procedurer til at bestemme, om teststoffet, aktiveres ved enzymatisk systemer, er bundet til DNA anbefales: 32P-postlabeling teknik og udnytte radioaktivt mærket stof (fx., 3H eller 14 C). For først anbefales pilot, screening 32P-postlabeling assay. Fastlæggelsen af DNA-indhold i løsninger, netop evalueret, skal gå forud for begge metoder.
32P-postlabeling teknikken udnytter enzymatisk hydrolyse af DNA modificeret af ikke-radioaktive kemikalier (kræftfremkaldende/narkotika) til 3´-phosphodeoxynucleosides, ekstra fosforylering med radioaktivt fosfor (32P) på 5´- ÅH adukter holdning og adskillelse af kemikalie-deoxynucleotide fra normal (uændrede) deoxynucleotides ved kromatografi17 (figur 1). DNA modificeret ved kemisk forbindelse er hydrolyseret af en blanding af endonuklease, micrococcal nukleasen og exonuclease, kendt som milt phosphodiesterase. Blandingen af hydrolyseret DNA indeholdende både almindelig (uændrede) og ændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates er reagerede med [γ -32P] ATP i overværelse af carrier (ikke-radioaktive) ATP og T4-polynucleotide kinase ved pH 9.5 til form 5´- 32P-mærket 3´, 5´-bisphosphates ("standard" procedure i figur 1). Den anvendte basisk pH er i stand til at minimere enzymaktiviteten i T4-polynucleotide kinase til dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på position 3´. Adskillelse og opløsning på 32P-mærket adukter fra mærket deoxynucleotides, ikke som ændres af kemikalier er udført af flerstrenget anion-exchange tyndtlagskromatografi (TLC) på polyethyleneimine (PEI) cellulose (figur 2 ). I de første og anden eluering trin (i D1 og D2 retning), er mærket normal (uændrede) deoxynucleotides samt [32P] phosphat elueret fra starten af TLC-PEI-cellulose pladen ved hjælp af vand løsninger af elektrolyt på en kort stykke af kromatografiske papir anvendes på toppen af TLC-pladen, der henviser til, at de deoxynucleotides, der indeholder bundet kemikalier udstiller hydrofobe egenskaber (kræftfremkaldende/stof-adukter) vedligeholdes ved starten af PEI-cellulose plade skal desuden løses med flere forskellige opløsningsmiddel systemer i D3 og D4 retninger (figur 2). Lokalisering af adukter udføres ved hjælp af skærmen forbedret Autoradiografi; den adskilte adukter registreres som mørke genkendelige pletter på X-ray film. Områderne af steder er skåret ud fra pladen og bruges til at kvantificere radioaktivitet af flydende scintillation eller Cerenkov tælle. En storage phosphor billedbehandling metode, der er blevet tilpasset til at kortlægge og kvantificere DNA adukter på kromatogrammer opdaget af 32P-postlabeling assay er nu også bruges. 18 den Instant Imager maskine er ofte udnyttet til sådan påvisning og kvantificering af DNA adukter. Denne metode giver mere end 10 - gange højere følsomhed til at afsløre 32P end teknikken med skærmen forbedret Autoradiografi19.
Mængder af DNA adukter bestemmes som værdier af relativ addukt mærkning (RAL), beregnes ved hjælp af ligningen (2) som følger:
CPM. i addukt deoxynucleotides RAL =---(2) specifikke aktivitet af 32P-ATP (i cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
Værdierne af uindfriede forpligtelser er forholdet mellem tæller satser af adduceret deoxynucleotides over tæller satser for alt [adduceret og normal (uændrede) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Denne beregning er imidlertid baseret på lige mærkning virkningsgrader adukter og normal deoxynucleotides22. Klassisk ("standard") proceduren for 32P-postlabeling teknik er passende for forskellige DNA adukter (pladskrævende og/eller ikke-pladskrævende adukter), men dets følsomhed er ikke tilfredsstillende at opdage adukter findes i små mængder i DNA. Brug denne procedure, kan mængden af en adduct i 107 uændrede deoxynucleotides i DNA (0,3 fmol adduct/µg DNA) påvises.
En række ændringer af denne klassiske 32P-postlabeling procedure har været udnyttet til at ophøje følsomheden af teknikken. Op til 10 til 100 gange højere følsomhed for bestemmelse af adukter af 32P-mærkning er opnået ved hjælp af begrænsende niveauer af [γ -32P] ATP (intensivering procedure). 23 , 24 en yderligere procedure giver en stigning i følsomheden af 32P-postlabeling metode udnytter en inkubation af fordøjet DNA indeholdende adukter med nukleasen P1 (fra Penicillium citrinum)21 (figur 1). Dette enzym foretrækker at dephosphorylate uændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, hvorimod deoxynucleotides med bundne kemikalier (adduceret nukleotider) er stort set ikke substrater af dette enzym. Derfor defosforyleret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) er ikke fosforyleret af T4-polynucleotide kinase af [32P] fosfat fra γ -32P] ATP. Men nogle af nukleotider hvor kemikalier er bundet (adduceret deoxynucleotides), som arylamine adukter substitueret på C8 af deoxyguanosine, kan bedephosphorylated af dette enzym. I modsætning hertil er de fleste andre adukter (fxadukter substitueret på N2 i deoxyguanosine) er ikke defosforyleret af nukleasen P1. Denne ændring af 32P-postlabeling gør denne metode betydeligt mere følsomme, øge sin følsomhed ved mere end tre størrelsesordener. Desuden, denne version af 32P-postlabeling giver en metode hvor højere mængder DNA (5-10 µg) og et overskud af carrier-fri [γ - 32P] ATP kan blive udnyttet.
En anden metode til at berige den adukter, beskrevet af Gupta25, udnytter de fysisk-kemiske egenskaber af pladskrævende deoxynucleotide adukter, der kan udtrækkes til n-butanol i overværelse af en fase transfer agent tetrabutylammonium chlorid (TBA) (figur 1) før [32P] phosphat mærkning, hvorimod umodificeret deoxynucleotides er dårligt udvundet af denne organisk opløsningsmiddel. Men mindre hydrofobe adukter, består for eksempel på deoxynucleotides modificerede med ikke-aromatiske pladskrævende fraspaltning eller små alkyl restkoncentrationer, er ikke effektivt ekstraheret med n-butanol. De er derfor hovedsagelig målbart når analyseres af denne ændring af 32P-postlabeling metode.
Begge de tidligere nævnte versioner af 32P-postlabeling øget følsomhed og kvantificering af DNA adukter enormt (op til tre størrelsesordener), at være i stand til at opdage en addukt pr. 109,10 normale nukleotider (0,3 - 3 Jørgen/µg DNA). Disse to metoder er anbefalet til testning kemikalier til deres effektivitet kovalent binding til DNA, og derfor, de er beskrevet i dette værk i detaljer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0032.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>70390-11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADPH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human liver microsomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>452172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Hydroxypyrimidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H56800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease P1 from Penicillium citrinum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrabutylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4-polynucleotide kinase</td>
			<td>USB Corp</td>
			<td>70031Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]ATP</td>
			<td>Hartman Analytic GmbH</td>
			<td>FP-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>801053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packard Instant Imager A202400</td>
			<td>Packard</td>
			<td>G120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellipticine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>285730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Nitrobenzanthrone</td>
			<td colspan="2">prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

Kovalente DNA adukter dannet af kemikalier eller stoffer med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste faktorer i indledningen fase af kræftfremkaldende processer. Denne kovalent binding, der betragtes som årsag til tumordannelse, vurderes nu som en central dogme af kemiske carcinogenese. Her metoder er beskrevet beskæftiger de reaktioner, der katalyseres af cytochrom P450 og yderligere biotransformation enzymer til at undersøge styrken af kemikalier eller lægemidler til deres aktivering til metabolitter danner disse DNA adukter. Procedurer er præsenteret beskriver isolation af cellulære fraktioner besidder biotransformation enzymer (mikrosomale og cytosole prøver med cytokromer, der P450 eller andre biotransformation enzymer, dvs., peroxidases, NADPH: cytokrom P450 oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, eller xanthin oxidase). Derudover metoder er beskrevet som kan bruges til metabolisk aktivering af analyseret kemikalier af disse enzymer samt dem til isolering af DNA. Yderligere, de relevante metoder i stand til at påvise og kvantificere kemiske/stof-afledte DNA adukter dvs., forskellige modifikationer af 32P-postlabeling teknik og beskæftigelse af radioaktivt mærket analyseret kemikalier, er vist i detaljer.

Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her for udnyttelsen af enzym-katalyserede aktivering (dvs, P450, peroxidase, reduktase) for at undersøge potens af kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) for at blive metaboliseret til mellemprodukter resulterer i deres kovalente binding til DNA (generation af DNA adukter), vi var i stand til at løse en roman mekanisme i den farmakologiske virkning af anticancer agent ellipticine (for en gennemgang under<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Dannelsen af kovalent DNA adukter af enzymatisk aktiveret kræftfremkaldende stoffer og narkotika In Vitro og deres bestemmelse af 32P-postlabeling

Vurdere styrken af miljømæssige kemikalier og lægemidler, er enzymatisk bioactivated til mellemprodukter generere kovalente DNA adukter, er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Metoder er beskrevet for sammensatte aktivering til at danne DNA adukter, samt teknikker til deres påvisning og kvantificering.

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Kovalent binding af antistoffer til cellulosepapir diske og deres anvendelser i Naked-eye Farvemåletekniske Immunoassays

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

En G-quadruplex DNA-affinitet tilgang til oprensning af enzymatisk aktivt G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Meget følsom og kvantitativ påvisning af proteiner og deres isoformer af kapillar isoelektrisk fokusering metode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berigelse af Native lipoprotein partikler med microRNA og efterfølgende bestemmelse af deres absolutte/relative microRNA indhold og deres cellulære overførselshastighed

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Krystallisering og strukturel bestemmelse af et enzym:Substratkompleks ved seriel krystallografi i en alsidig mikrofluidisk chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA-glycosylaseassay ved matrixassisteret laserdesorption/ionisering Time-of-flight Massespektrometrianalyse

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...