Name: formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door Tsjechische Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

Alle dierproeven werden uitgevoerd overeenkomstig de voorschriften voor de zorg en het gebruik van proefdieren (311/1997, ministerie van landbouw, Tsjechische Republiek), die in overeenstemming met de verklaring van Helsinki is.
1. isolatie van hepatische microsomale en cytosolische breuken
<ol><li>Bereiden lever subcellular breuken (microsomes rijk aan enzymen van de P450 of cytosols rijk aan reductases of oplosbare Peroxidasen) van ratten door eenvoudige differentiële centrifugeren (105.0...

In deze paper wordt aangetoond een breed toegankelijke methode om te studeren van de potentie van chemische stoffen als bioactivated metabole tussenproducten, resulterend in de generatie van covalente DNA adducten. Dit is een cruciaal probleem, omdat de evaluatie van de potentie van milieu chemicaliën of drugs van hun enzymatische activatie te metabolieten genereren covalente DNA adducten is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. De wijziging van DNA door kankerverwekkende stoffen b...

Het metabolisme van xenobiotica (milieu chemicaliën of drugs) vindt plaats in twee fasen1. Fasen I en II willen maken van de oorspronkelijk hydrofobe (niet oplosbare) stoffen meer hydrofiele (in water oplosbaar), waardoor ze gemakkelijk excretable zijn via urine, ontlasting of zweet. Fase I (functionalization) Reacties omvatten oxidatie, vermindering, en hydroxylering gekatalyseerd door enzymen zoals cytochroom P450s (P450s, CYPs), Peroxidasen (dwz., cyclooxygenase, COX), aldo-keto-reductases (AKRs), en microsomale Flavin-bevattende monooxygenases (FMO). Fase I bevat ook vermindering reacties, gemedieerd door een scala aan reductases dat wil zeggen, microsomale NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytosolische NAD (P) quinone oxidoreductasen (NQO1), xanthine oxidase (XO) en aldehyde oxidase (AO)1 . In de tweede fase (conjugatie), de functionele groepen die gekoppeld waren in fase zijn ik gewend conjugaat kleine polaire moleculen verder verhogen de polariteit. Voorbeelden van enzymen beschouwd om deel te nemen in de reactie van fase II omvatten sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases zoals catechol -O- methyltransferase (COMT), glutathione S- transferasen (GSTs), en uridine difosfaat glucuronosyltransferases (UGTs)1. De indeling van de enzymen in fase I of II is, echter, niet stijf, en sommige enzymen aantoonbaar kunnen worden gegroepeerd in beide categorieën.
P450 enzymen (EG 1.14.14.1) zijn de Heem met eiwitten aanwezig in verschillende organismen, die deelnemen aan de biotransformatie van veel chemische stoffen, hun conversie3,4te katalyseren. De P450 enzymen katalyseren hydroxylatie van vele verschillende ondergronden, met een reactie waar één atoom van dioxygen is ingevoerd in de molecule van xenobiotica, terwijl het tweede atoom zuurstof is teruggebracht tot vorm water door de reactie die twee elektronen [de vergelijking (1 vereist )]3,4:
RH + O2 NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)
P450 enzymen gelokaliseerd in het membraan van het endoplasmatisch reticulum van zoogdiercellen (microsomale P450-systemen) zijn leden van de multi monooxygenase-systeem, waarin verder NADPH: cytochroom P450 reductase (POR) en cytochroom b5 , het substraat voor het enzym genoemd als NADH: cytochroom b5 reductase. Een algemeen aanvaarde theorie veronderstelt dat de donor van de twee elektronen die nodig zijn voor de P450 het NADPH/POR-systeem is. Niettemin kan cytochroom b5 ook fungeren als een donor van elektronen voor P450, namelijk als donor van het elektron verminderen van P450 tijdens tweede verlaging van haar reactie-cyclus, waar het fungeert samen met NADH: cytochroom b5 reductase2,3,4.
Zoogdieren gebruiken verschillende P450 enzymen (bijvoorbeeld de enzymen van gezinnen 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 en 27) voor de synthese van waardevolle endogene stoffen, zoals steroïden, en ze gebruiken voor katabolisme van natuurproducten2,3 . De andere CYP zoogdieren enzymen, zoals menselijke CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 en 3A4, metaboliseren exogene chemicaliën die worden gebruikt als geneesmiddel. 5 , 6 de belangrijkste enzymen katalyseren metabolisme van drugs zijn CYPs van de onderfamilie 3A, vooral CYP3A4. De conversies van xenobiotica, zoals pro-kankerverwekkende stoffen en pro-toxische stoffen, zijn gemedieerd door menselijke CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 en 3A42,5. De meeste van deze CYPs zijn aanwezig in de lever (behalve CYP1A1 en 1B1). De CYPs zijn echter eveneens uitgedrukt in verscheidene extrahepatic organen. Dergelijke P450s zou van grote betekenis, voornamelijk wanneer nemen ze in bioactivation metabolisme van chemische stoffen (drugs) aan reactieve intermediairen in deze organen7. Verschillende P450s worden veroorzaakt door de diverse verbindingen die hun substraten, maar dit niet noodzakelijkerwijs het geval is.
Vele P450 enzymen spelen een rol in de (drug) chemische toxiciteit. Zij kunnen de xenobiotica omzetten niet alleen in hun metabolieten van detoxificatie, maar ook activeren hen reactieve soorten, waarvoor wijzigen van endogene macromoleculen die bovendien verschillende biologische eigenschappen, meestal veroorzaakt door hun toxiciteit vertonen. DNA, lipiden en eiwitten mogelijk de doelstellingen voor hun wijziging door reactieve elektrofielen en radicalen gegenereerd op basis van geactiveerde chemicaliën. In het geval van DNA, oplossen van verschillende belangrijke gene reacties en hun mechanismen zijn al bekend2,3,4,5.
De veranderingen in DNA kunnen resulteren in een afname van de cel groei controle, en dit verschijnsel wordt beschouwd als de overheersende factor die leidt tot de ontwikkeling van kankerverwekkende processen. De generatie van covalente DNA adducten met chemische stoffen die kankerverwekkend vermogen wordt beoordeeld als een van de belangrijkste stappen in de initiatie fase van kankerverwekkende8,9,10,11 processen. Het bleek dat de relaties tussen de vorming van DNA adducten en tumorvorming optreden, terwijl een daling in de hoeveelheid DNA adducten is verantwoordelijk voor chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. de vorming van kankerverwekkende stof/drug-afgeleid DNA adducten is afhankelijk van individuele basissen van DNA, en wordt beïnvloed door de volgorde van deze basen in DNA. De reparatie van DNA adducten zijn afhankelijk van hun locatie (op de getranscribeerde of niet-getranscribeerd bundel van DNA) en soorten gemodificeerde nucleotide sequences8,11,12,15, 16.
In dit artikel beschrijven we procedures met behulp van het enzym-gekatalyseerde conversie van chemische stoffen (drugs) te onderzoeken hun potentie te worden geactiveerd in metabolieten die gemodificeerd DNA (genereren van DNA adducten). Covalente binding van DNA, de teststof moet meestal worden geactiveerd door oxidatieve of reductieve reacties, afhankelijk van individuele geneesmiddelen. Oxidatieve of reductieve activering van geteste chemische stoffen wordt gemedieerd door een P450-afhankelijke enzymatische systeem aanwezig in de microsomale subcellular fractie of door reductie met reductases presenteren zowel in microsomes (POR, NADH: cytochroom b5 reductase, P450 enzymen) en cellulaire cytosolische subcellular breuken (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reactieve metabolieten daarna binden aan DNA vorming DNA adducten. Omdat zowel oxiderende en reducerende reacties belangrijk zijn voor het activeren van deze reactieve soorten verschillende drugs, worden de experimentele procedures met de enzymatische oxidatie/verwijderingssysteem beschreven. Bovendien, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van deze DNA adducten in detail worden beschreven.
Twee onafhankelijke procedures om te bepalen of de teststof, geactiveerd door enzymatische systems, is gebonden aan DNA worden aanbevolen: de 32P-postlabeling techniek en met behulp van radioactief gelabelde stof (bijv., 3H of 14 C). Voor de eerste wordt piloot, screening van de 32P-postlabeling bepaling aanbevolen. De bepaling van het DNA-gehalte in oplossingen, juist geëvalueerd, moet voorafgaan aan beide methoden.
De 32P-postlabeling techniek maakt gebruik van de enzymatische hydrolyse van DNA gewijzigd door niet-radioactieve chemische producten (carcinogeen/drug) 3´-phosphodeoxynucleosides, extra fosforylatie met radioactief fosfor (32P) bij de 5´- OH adducten positie, en de scheiding van chemische-deoxynucleotide van normale (ongewijzigde) deoxynucleotides door chromatografie17 (Figuur 1). DNA gewijzigd door een chemische verbinding is gehydrolyseerd door een mengsel van endonuclease en micrococcal nuclease exonuclease, bekend als fosfodiësterase milt. Het mengsel van gehydrolyseerde DNA dat beide normaal (ongewijzigd) bevat en bewerkt deoxyribonucleoside 3´-monophosphates is gereageerd met [γ -32P] ATP in het bijzijn van de vervoerder (niet-radioactieve) ATP en T4-polynucleotide kinase bij pH 9,5 naar formulier 5´- 32P-label 3´, 5´-bisphosphates ("standaard" procedure in Figuur 1). De gebruikte alkalische pH is geschikt voor het minimaliseren van de enzymactiviteit van T4-polynucleotide kinase aan dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates op positie 3´. Scheiding en resolutie van 32P-geëtiketteerden adducten van gelabelde deoxynucleotides die niet zijn gewijzigd door chemische stoffen wordt uitgevoerd door meerdere richtingen anion-uitwisseling Dunnelaagchromatografie (TLC) op polyethyleneimine (PEI) cellulose (Figuur 2 ). In de eerste en tweede elutie stappen (in de richting van D1 en D2), worden gelabelde normale (ongewijzigde) deoxynucleotides evenals [32P] fosfaat geëlueerd vanaf het begin van de plaat van de TLC-PEI-gemengd met cellulose met behulp van water oplossingen van elektrolyt op een kort stukje chromatografische papier toegepast op de bovenkant van de TLC-plaat, dat het deoxynucleotides gebonden chemicaliënhoudend exposeren hydrofobe eigenschappen (carcinogeen/drug-adducten) gehandhaafd aan het begin van PEI-gemengd met cellulose plaat blijven worden bovendien opgelost met verschillende oplosmiddel systemen in D3 en D4 richtingen (Figuur 2). Lokalisatie van adducten wordt uitgevoerd met behulp van autoradiografie scherm verbeterd; de gescheiden adducten die worden herkend als donkere herkenbare plekken op X-ray films. De gebieden van spots zijn weggesneden uit de plaat en gebruikt te kwantificeren van de radioactiviteit door vloeibare scintillatietelling of Cerenkov tellen. Een opslag fosfor imaging methode die aangepast is voor kaart en kwantificeren van DNA adducten op chromatogrammen gedetecteerd door de 32P-postlabeling assay wordt nu ook gebruikt. 18 the Instant Imager machine wordt vaak gebruikt voor dergelijke detectie en kwantificering van DNA adducten. Deze methode biedt meer dan 10 - keer hogere gevoeligheid voor het opsporen van 32P dan de techniek van het scherm verbeterd autoradiografie19.
Hoeveelheid DNA adducten als waarden van relatieve labeling (RAL) adduct, berekend met behulp van de vergelijking (2) als volgt worden bepaald:
CPM. in adduct deoxynucleotides RAL =---(2) specifieke activiteit van 32P-ATP (in cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
De waarden van de RAL's zijn de verhouding tussen de tarieven van de graaf van deoxynucleotides geadduceerd over graaf tarieven van totaal [geadduceerd en normale (ongewijzigde) deoxynucleotides]2120,deoxynucleotides. Echter, deze berekening is gebaseerd op gelijke etikettering efficiëntie van adducten en normale deoxynucleotides22. De klassieke ("standaard") procedure van de 32P-postlabeling techniek is geschikt voor verschillende DNA adducten (omvangrijk en/of niet-omvangrijk adducten), de gevoeligheid is echter niet bevredigend te detecteren adducten gevonden in lage bedragen in DNA. Met deze procedure, is het bedrag van een adduct in 107 ongewijzigd deoxynucleotides in DNA (0.3 fmol adduct/µg DNA) aantoonbaar.
Een aantal wijzigingen van deze klassieke 32P-postlabeling procedure hebben gebruikt te verheffen van de gevoeligheid van de techniek. Maximaal 10 tot 100 keer hogere gevoeligheid van bepaling van adducten door 32P-labeling is geboekt met behulp van beperkende niveaus van [γ -32P] ATP (de intensivering procedure). 23 , 24 een verdere procedure die dat een toename van de gevoeligheid van de 32P-postlabeling-methode maakt gebruik van een incubatie verteerd DNA bevatten adducten met nuclease P1 (van Penicillium citrinum)21 (Figuur 1). Dit enzym verkiest te ongewijzigde deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate, overwegende dat de deoxynucleotides met afhankelijke chemicaliën (geadduceerd nucleotiden) in wezen niet de substraten van dit enzym zijn. Daarom gedefosforyleerd deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (d.w.z., deoxyribonucleosides) zijn niet phosphorylated door T4-polynucleotide kinase door [32P] fosfaat uit γ -32P] ATP. Echter, sommige van nucleotiden waar chemicaliën zijn gebonden (geadduceerd deoxynucleotides), zoals arylamine adducten vervangen bij C8 van deoxyguanosine, kan bedephosphorylated door dit enzym. In tegenstelling, de meeste andere adducten (b.v.adducten vervangen op N2 voor deoxyguanosine) zijn niet gedefosforyleerd door nuclease P1. Deze wijziging van 32P-postlabeling maakt deze methode aanzienlijk gevoeliger, verhogen van de gevoeligheid van meer dan drie ordes van grootte. Bovendien, deze versie van 32P-postlabeling biedt een methode waar hogere hoeveelheden DNA (5-10 µg) en een overmaat aan vervoerder-vrije [γ - 32P] ATP kan worden gebruikt.
Een andere methode te verrijken de adducten, beschreven door Gupta25, maakt gebruik van de fysisch-chemische eigenschappen van de omvangrijke deoxynucleotide adducten, die kan worden gewonnen in n-butanol in aanwezigheid van een fase transfer agent tetrabutylammoniumwaterstofsulfaat chloride (TBA) (Figuur 1) vóór [32P] fosfaat labeling, overwegende dat ongewijzigde deoxynucleotides slecht worden geëxtraheerd door dit organisch oplosmiddel. Echter, minder hydrofobe adducten, bestaande voor voorbeeld van deoxynucleotides gemodificeerde met niet-aromatische omvangrijk wordt of kleine alkyl residuen, zijn niet effectief gewonnen met n-butanol. Vandaar, zijn zij in wezen niet op te sporen wanneer zijn geanalyseerd door deze wijziging van de 32P-postlabeling methode.
Zowel de eerder genoemde versie van 32P-postlabeling verhoging van de gevoeligheid en de kwantificering van DNA adducten enorm (tot drie ordes van grootte), zijnde kundig voor speurder een adduct per 109,10 normale nucleotiden (0.3 - 3 amol/µg DNA). Deze twee methoden worden aanbevolen voor het testen van de chemicaliën voor hun efficiëntie covalent binden aan DNA en daarom worden ze beschreven in dit werk in details.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0032.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>70390-11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADPH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human liver microsomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>452172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Hydroxypyrimidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H56800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease P1 from Penicillium citrinum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrabutylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4-polynucleotide kinase</td>
			<td>USB Corp</td>
			<td>70031Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]ATP</td>
			<td>Hartman Analytic GmbH</td>
			<td>FP-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>801053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packard Instant Imager A202400</td>
			<td>Packard</td>
			<td>G120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellipticine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>285730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Nitrobenzanthrone</td>
			<td colspan="2">prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

Covalente DNA adducten gevormd door chemicaliën of drugs met kankerverwekkend vermogen worden beoordeeld als een van de belangrijkste factoren in de initiatie fase van kankerverwekkende processen. Deze covalente binding, die wordt beschouwd als de oorzaak van tumorvorming, wordt nu geëvalueerd als een centrale dogma van chemische carcinogenese. Hier worden de methoden beschreven die de reacties gekatalyseerd door cytochroom P450 en extra biotransformatie enzymen te onderzoeken van de potentie van chemicaliën of drugs voor hun activatie naar metabolieten vormen deze DNA adducten. Procedures worden gepresenteerd met een beschrijving van het isolement van cellulaire breuken bezitten biotransformatie enzymen (microsomale en cytosolische monsters met cytochromes P450 of andere biotransformatie enzymen, dat wil zeggen, Peroxidasen, NADPH: cytochroom P450 oxidoreductasen, NAD (P) quinone oxidoreductasen of xanthine oxidase). Bovendien worden de methoden beschreven die kunnen worden gebruikt voor de metabole activering van geanalyseerde chemische stoffen door deze enzymen, alsmede die voor isolatie van DNA. Verder, de passende methoden die kunnen detecteren en kwantificeren van de chemische stof/drug-afgeleid DNA adducten, d.w.z., verschillende wijzigingen van de 32P-postlabeling techniek en werkgelegenheid van de radioactieve gelabelde geanalyseerd van chemische stoffen, zijn in detail weergegeven.

Met behulp van de protocollen die hier beschreven voor het gebruik van enzym-gekatalyseerde activering (dat wil zeggen, P450 peroxidase, reductase) te onderzoeken van de potentie van chemische stoffen (kankerverwekkende stoffen/drugs) om te worden gemetaboliseerd tussenproducten resulterend in hun covalente binden aan DNA (generatie van DNA adducten), we waren in staat om op te lossen (i) een nieuw mechanisme van de farmacologische werking van de ellipticine van antikanker agent ...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

Covalente binding van antilichamen aan Cellulose Paper Discs en hun toepassingen in het blote oog Colorimetrisch Immuniteitsonderzoeken

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Zeer gevoelige en kwantitatieve detectie van eiwitten en hun Isoforms door capillaire elektrisch gericht methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...