Name: formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling
Uploaded: 2018-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הצ'כית (GACR, גרנט 17-12816S).

כל הניסויים בוצעו בהתאם לכללים על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (311/1997, משרד החקלאות, צ'כיה), אשר תואם הצהרת הלסינקי.
1. בידוד של הכבד שברים Microsomal ו- Cytosolic
<ol><li>הכן שברים subcellular הכבד (microsomes עשיר אנזימי P450 או cytosols עשיר reductases או peroxidases מסיסים) של חולדות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית...

בנייר זה, הוכח מתודולוגיה נרחב נגיש ללמוד את העוצמה של כימיקלים להיות bioactivated כדי intermediates מטבולית, וכתוצאה מכך הדור ה-DNA קוולנטיות adducts. זה הוא נושא קריטי, כי הערכה של עוצמת כימיקלים סביבתיים או סמים של הפעלת אנזימטי שלהם כדי מטבוליטים יצירת DNA קוולנטיות adducts הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפ...

חילוף החומרים של ואינטראקציות (כימיקלים סביבתיים או תרופות) מתרחשת בשני שלבים1. שלבים I ו- II במטרה להבהיר את תרכובות הידרופוביות במקור (לא מסיסים במים) יותר הידרופילית (מסיסים במים), ובכך הופך אותם excretable בקלות באמצעות שתן, צואה או זיעה. שלב I (functionalization) תגובות כוללים חמצון, הפחתה, ו hydroxylation מזורז על ידי אנזימים כגון ציטוכרום P450s (P450s, CYPs), peroxidases (כלומר., cyclooxygenase, קוקס), אלדו-keto reductases (AKRs), ו microsomal פלווין המכילים monooxygenases (FMOs). שלב אני כולל גם הפחתת תגובות, מתווכת על ידי מגוון רחב של reductases דהיינו microsomal nadph ל: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ו- NAD (P) cytosolic H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthine אוקסידאז (XO) אלדהיד אוקסידאז (AO)1 . בשלב השני (נטיה), קבוצות פונקציונליות שצורפו בשלב אני משמשות נזווג מולקולות קוטביות קטנות כדי להגביר עוד יותר את הקוטביות. דוגמאות של אנזימים נחשב להשתתף התגובה של שלב II כוללים sulfotransferases (ים), N, O- acetyltransferases (Nat), methyltransferases כגון catechol -O- methyltransferase (COMT), גלוטתיון S- transferases (GSTs), uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. הסיווג של אנזימים בשלב I או II עם זאת, לא נוקשה, ולא ניתן לקבץ כמה אנזימים ניתן לטעון גם בקטגוריה.
אנזימי P450 (EC 1.14.14.1) הן heme המכיל חלבונים המצויים אורגניזמים שונים, אשר להשתתף ביואמסה של כימיקלים רבים, ותזרז את ההמרה3,4. אנזימי P450 לעודד hydroxylation של סובסטרטים רבים, עם תגובת איפה אטום אחד של dioxygen מוחדרים המולקולה של ואינטראקציות, בעוד האטום השנייה של חמצן הוא מופחת כדי ליצור מים על ידי התגובה כי דורש שני אלקטרונים [המשוואה (1 3,)]4:
RH + O2 + nadph ל + H+ ← ROH + H2O + NADP+ (1)
אנזימי P450 לוקליזציה. ממברנה רשתית תוך-פלזמית בתרבית של תאים (מערכות P450 microsomal) הם חברי המערכת multienzyme monooxygenase, אשר בהמשך מכיל ניקוטין: ציטוכרום P450 רדוקטאז (POR) ציטוכרום b5 , המצע של האנזים כינה NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז. תיאוריה מקובלים hypothesizes כי התורם האלקטרונים שני לצורך P450 היא מערכת ניקוטין/בבקשה. בכל זאת, ציטוכרום b5 עשוי לשמש גם כתורם אלקטרונים עבור P450, כלומר תורם של האלקטרון הפחתת P450 במהלך הפחתת השני של מחזור התגובה שלה, שבו היא פועלת יחד עם NADH: ציטוכרום b5 3,2,רדוקטאז4.
יונקים לנצל את אנזימי P450 שונים (למשל, האנזימים של משפחות 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, ו 27) לסינתזה של תרכובות אנדוגני יקרי ערך, כמו סטרואידים, להשתמש בהם עבור קטבוליזם של מוצרים טבעיים2,3 . אחרים CYP בתרבית של האנזימים, כגון CYP1A2 האנושי, 2C 9, 2C 19, 2D 6 ו 3A4, לעכל אקסוגני כימיקלים המשמשים כמו סמים. 5 , 6 אנזימים החשובים ביותר ותזרז את חילוף החומרים של תרופות הם CYPs של תת משפחה 3A, במיוחד CYP3A4. ההמרות של ואינטראקציות, כגון פרו-מסרטנים ו- pro-חשיפה לרעלים, הן מתווכת על-ידי CYP1A1 האנושי 1A2, 1B1, 2A6, 2E1,2,3A45. רוב CYPs אלה נמצאים הכבד (למעט CYP1A1 ו- 1B1). ובכל זאת, CYPs גם מבוטאים במספר האיברים extrahepatic. P450s כזה יכול להיות משמעות רבה, בעיקר כאשר להשתתף הם בחילוף החומרים bioactivation של כימיקלים (תרופות) intermediates הממוגן ב איברים אלה7. P450s שונים הם המושרה על ידי מספר תרכובות מצעים שלהם, למרות שזה לא בהכרח המקרה.
אנזימי P450 רבים לשחק תפקיד רעילות כימית (סמים). הם יכולים להמיר את ואינטראקציות לא רק מטבוליטים דטוקסיפיקציה שלהם, אך גם להפעיל אותם למינים תגובתי, המשנים את מקרומולקולות אנדוגני, כי בנוסף התערוכה מאפיינים ביולוגיים שונים, בדרך כלל גורם הרעילות שלהם. ה-DNA, שומנים, חלבונים ייתכן המטרות ולשנותן שלהם על-ידי electrophiles תגובתי רדיקלים המופקים כימיקלים מופעל. במקרה של ה-DNA, פתרון מספר גנים חשובים תגובות ומנגנונים שלהם ידועים כבר2,3,4,5.
השינויים ב- DNA עלולה לגרום ירידה בשליטה צמיחת תאים, תופעה זו נחשבת הגורם השולט המובילים להתפתחות של תהליכים מסרטנים. הדור של DNA קוולנטיות adducts עם כימיקלים בעל העוצמה מסרטנים נאמד כמו אחד הצעדים החשובים ביותר בשלב הייזום של מסרטנים מעבד8,9,10,11. הוכח כי היחסים בין היווצרות של דנ א adducts, tumorigenesis להתרחש, ואילו ירידה בכמות הדנ א adducts אחראי chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. היווצרות של גורם מסרטן/סמים-derived DNA adducts תלוי בסיסים בודדים של דנ א, מושפע את רצפי הבסיסים האלה ב- DNA. התיקונים של ה-DNA adducts תלויות שלהם מיקום (על צירוף ד. נ משועתקים או שאינם עיבד) וסוגים של נוקלאוטיד ששונה רצפים8,11,12,15, 16.
במאמר זה נתאר תהליכי ניצול ההמרה מזורז-אנזים של כימיקלים (תרופות) לחקור מחוזקה תופעל לתוך מטבוליטים אשר שינוי ה-DNA (הפקת דנ א adducts). עבור איגוד ה-DNA קוולנטיות, המתחם בדיקה בדרך כלל צריך להיות מופעל גם על-ידי תגובות חמצון או מוטעה, בהתאם סמים בודדים. הפעלת חימצוני או מוטעה של כימיקלים שנבדקו מתווך על ידי מערכת אנזימטיות תלויות-P450 נוכח השבר subcellular microsomal או על ידי הפחתה reductases להציג את שניהם microsomes (POR, NADH: ציטוכרום b5 רדוקטאז, אנזימי P450) והן בחלקים הסלולר cytosolic subcellular (NQO1, הקמב ץ, AO, peroxidase). מטבוליטים תגובתי לאחר מכן לאגד דנ א ויוצרים דנ א adducts. בגלל תגובות חמצון והן חותכות חשוב להפעיל מספר תרופות אלו מינים תגובתי, מתוארים ההליכים ניסיוני העסקת מערכת אנזימטי חמצון/צמצום. יתר על כן, adducts השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות הדנ א הללו מתוארים בפירוט.
שני הליכים עצמאיים כדי לקבוע אם הכימיקל מבחן, מופעל על ידי מערכות אנזימטיות, מאוגד ל- DNA מומלצים: 32P-postlabeling טכניקה של המתחם רדיואקטיבי התווית על-ידי ניצול (למשל., 3H או 14 C). הראשון מומלץ טייס, הקרנת וזמינותו P-postlabeling 32. הקביעה של תוכן ה-DNA פתרונות, להעריך במדויק, חייב להופיע לפני שתי השיטות.
32P-postlabeling טכניקה מנצל את הידרוליזה אנזימטי של דנ א שונה על-ידי כימיקלים לא רדיואקטיבי (מסרטן/סמים) 3´-phosphodeoxynucleosides, זרחון נוספים עם זרחן רדיואקטיבי (32P)-5´- הו גם ההפרדה של כימיקלים-deoxynucleotide adducts מן deoxynucleotides (שלא שונתה) נורמלי מאת כרומטוגרפיה17 (איור 1). דנ א שונה על-ידי תרכובת כימית hydrolyzed לפי תערובת של endonuclease נוקלאז micrococcal, אקסונוקלאז, המכונה phosphodiesterase הטחול. התערובת של הידרוליזה DNA המכיל שני רגיל (יבוצעו בהם שינויים) ולשנות deoxyribonucleoside 3´-monophosphates הוא הגיב עם ATP [γ -32P] בנוכחות המוביל (שאינו רדיואקטיבי) ATP ו- T4-polynucleotide קינאז ב- pH 9.5 על טופס 5´- 32התווית על-ידי P 3´, 5´-bisphosphates ("רגילה" הליך באיור1). ה-pH בסיסי בשימוש הוא מסוגל מזעור פעילות אנזים של T4-polynucleotide קינאז כדי dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates-3´ עמדה. ההפרדה והרזולוציה של 32התווית על-ידי P adducts מן deoxynucleotides שכותרתו ששונו על ידי כימיקלים לא מבוצע על ידי אניון רב-כיווני-המרת שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) על polyethyleneimine (פיי) תאית (איור 2 ). בשלבים • תנאי הראשון והשני (בכיוון D1 ו- D2), שכותרתו deoxynucleotides (שלא שונתה) רגילה, כמו גם [32P] פוספט נמצאים eluted מן ההתחלה של צלחת TLC-פיי-תאית באמצעות פתרונות מים של אלקטרוליט על חתיכת קצר נייר כרומטוגרפי חלה על ראש הלוח TLC, ואילו deoxynucleotides המכיל כימיקלים מאוגד בתערוכה מאפיינים הידרופובי (מסרטן/סמים-adducts) נשמרים בתחילתו של פיי-תאית צלחת בנוסף לפתור עם מספר מערכות הממס שונות בכיוונים D3, D4 (איור 2). לוקליזציה של adducts מתבצעת באמצעות מסך משופרת autoradiography; adducts מופרדים מזוהים כמו כתמים כהים לזיהוי על סרטי צילום רנטגן. האזורים של כתמים טוחנות מהצלחת ומשמשת לכמת רדיואקטיביות על-ידי גזים או Cerenkov לספור. פוספור אחסון הדמיה שיטה כי כבר מותאם כדי למפות ולכמת את הדנ א adducts על chromatograms זוהה על ידי 32P-postlabeling assay גם משמש כיום. 18 Imager מיידית המכונה לעתים קרובות מנוצל לשם איתור כזה, כימות של דנ א adducts. שיטה זו מספקת יותר מ 10 פעמים רגישות גבוהה יותר לגילוי 32P מאשר בטכניקה של מסך משופרת autoradiography19.
כמויות של ה-DNA adducts נחושים כמו ערכים של קרוב משפחה adduct תיוג (RAL), מחושב באמצעות המשוואה (2) כדלקמן:
cpm. adduct deoxynucleotides RAL =---(2) פעילות ספציפית של 32P-ATP (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides
הערכים של RALs הם היחס של הרוזן שערי adducted deoxynucleotides מעל ספירת המחירים של סכום [adducted ונורמלי (שלא שונתה) deoxynucleotides]20,deoxynucleotides21. עם זאת, חישוב זה מבוסס על שוויון תיוג היעילות של adducts ו- deoxynucleotides נורמלי22. ההליך ("רגילה") הקלאסית של 32P-postlabeling טכניקה מתאימה עבור דנ א שונים adducts (מגושם ו/או ללא עבים adducts), לעומת זאת, הרגישות אינה מספקת כדי לזהות adducts שנמצאו כמויות נמוכות ב- DNA. באמצעות הליך זה, הסכום של adduct ב- deoxynucleotides 107 יבוצעו בהם שינויים ב- DNA (0.3 fmol adduct/µg ה-DNA) הוא לזיהוי.
מגוון של שינויים של זו הקלאסית 32הליך P-postlabeling כבר נעזרו להעלות את רמת הרגישות של הטכניקה. עד 10-100 פעמים רגישות גבוהה יותר של נחישות של adducts על ידי 32P תיוג הושגה באמצעות הגבלת רמות של ATP [γ -32P] (ההליך התעצמות). 23 , 24 הליך נוסף במתן שעלייה הרגישות של שיטת P-postlabeling 32מנצל של דגירה של מתעכל DNA המכיל adducts עם נוקלאז P1 (מתוך Penicillium citrinum)21 (איור 1). אנזים זה מעדיף dephosphorylate שלא deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, ואילו deoxynucleotides עם כימיקלים מאוגדת (נוקלאוטידים adducted) הם בעצם לא מצעים של אנזים זה. לכן, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (כלומר, deoxyribonucleosides) הם לא phosphorylated על ידי T4-polynucleotide קינאז מאת [32P] פוספט וγ -32P] ATP. עם זאת, חלקם של נוקלאוטידים איפה כימיקלים מאוגדים (adducted deoxynucleotides), כגון arylamine adducts שהוחלפו-C8 של deoxyguanosine, יכול bedephosphorylated על ידי אנזים זה. לעומת זאת, רוב השני adducts (למשל, adducts שהוחלפו ב N2 של deoxyguanosine) הם לא dephosphorylated על ידי נוקלאז P1. שינוי זה של 32P-postlabeling הופך שיטה זו במידה ניכרת רגיש יותר, הגדלת הרגישות שלה על-ידי סדרי גודל יותר משלושה. יתר על כן, גירסה זו של 32P-postlabeling מספק שיטה שבו גבוה יותר כמויות של DNA (5-10 µg) ו עודף של הספק ללא ATP [γ - 32P] יכול להיות מנוצל.
שיטה נוספת להעשיר adducts, שתואר על ידי גופטה25, מנצל את physicochemical מאפייני מגושם deoxynucleotide adducts, אשר ניתן לחלץ לתוך n-butanol בנוכחות שלב העברת הסוכן tetrabutylammonium כלוריד (יפורסם בהמשך) (איור 1) לפני [32P] פוספט תיוג, ואילו deoxynucleotides שלא שונתה מופקים לקוי על ידי הממס האורגני הזה. עם זאת, פחות הידרופוביות adducts, המורכב על דוגמה של deoxynucleotides שונה עם moieties מגושם הלא-ארומטי או אלקיל קטן משקעים, לא ביעילות יחולצו עם n-butanol. לפיכך, הם בעיקרו של דבר בלתי מורגשת כאשר הם נותחו על ידי שינוי זה של 32שיטת P-postlabeling.
שתי הגרסאות כאמור של 32P-postlabeling להגביר הרגישות ואת כימות של ה-DNA adducts מאוד (עד שלושה סדרי גודל), להיות מסוגל לזהות את אחד adduct לכל 109,10 נורמלי נוקלאוטידים (0.3 - 3 (קרית אתא) / µg דנ א). שתי השיטות המומלצות עבור בדיקות הכימיקלים ליעילות שלהם לאגד covalently דנ א, ו, לכן, הם מתוארים בעבודה זו בפרטים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0032.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A156.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Penta</td>
			<td>70390-11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADPH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose 6-phosphate dehydrogenase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supersomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human liver microsomes</td>
			<td>Corning Gentest</td>
			<td>452172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Hydroxypyrimidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H56800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>524711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease P1 from Penicillium citrinum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrabutylammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>86870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>437603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4-polynucleotide kinase</td>
			<td>USB Corp</td>
			<td>70031Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]ATP</td>
			<td>Hartman Analytic GmbH</td>
			<td>FP-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI-impregnated cellulose TLC plates</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>801053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packard Instant Imager A202400</td>
			<td>Packard</td>
			<td>G120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellipticine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>285730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Nitrobenzanthrone</td>
			<td colspan="2">prepared (synthesized) as shown in ref. 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

formation of covalent dna adducts by enzymatically activated carcinogens and drugs in vitro and their determination by 32p-postlabeling

DNA קוולנטיות adducts שהוקמה על ידי כימיקלים או סמים עם העוצמה מסרטנים נשפטים כאחד הגורמים החשובים ביותר בשלב הייזום של תהליכים מסרטנים. איגוד קוולנטיות זה, הנחשב הגורם tumorigenesis, עכשיו מוערך של הדוגמה המרכזית של carcinogenesis כימי. כאן, שיטות מתוארים העסקת את התגובות על ידי ציטוכרום P450, אנזימים ביואמסה נוספים כדי לחקור את העוצמה של כימיקלים או סמים עבור ההפעלה שלהם כדי מטבוליטים ויוצרים את הדנ א הללו adducts. ההליכים מוצגים המתארים את ניתוקה של שברים הסלולר הפו אנזימים ביואמסה (microsomal cytosolic דגימות עם cytochromes P450 או אחרים ביואמסה אנזימים, קרי, peroxidases, nadph ל: ציטוכרום P450 oxidoreductase, oxidoreductase H:quinone NAD (P) או xanthine אוקסידאז). יתר על כן, מתוארות שיטות זה יכול לשמש עבור ההפעלה מטבולית של כימיקלים שנותחה על ידי אנזימים אלה, כמו גם עבור בידוד של דנ א. עוד יותר, השיטות המתאימות מסוגל זיהוי וכימות DNA כימית/סמים-נגזר adducts, דהיינו, שינויים שונים של הטכניקה P-postlabeling 32, העסקתם של רדיואקטיבי שכותרתו ניתח כימיקלים, הם מוצגים בפירוט.

באמצעות פרוטוקולים המתוארים כאן על הניצול של הפעלת מזורז-אנזים (קרי, P450, peroxidase, רדוקטאז) לחקור את העוצמה של כימיקלים (חומרים מסרטנים/תרופות) כדי להיות מטבוליזם כדי intermediates וכתוצאה מכך קוולנטיות שלהם איגוד ה-DNA (דור של דנ א adducts), היינו מסוגלים לפתור (i) מנגנון של פעילות פר...

Watch this Scientific Journal Video about Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling at JoVE.com

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

היווצרות קשרי ערכיות דנ א Adducts על ידי חומרים מסרטנים Enzymatically מופעל, סמים במבחנה ונחישות שלהם על ידי 32P-postlabeling

הערכת עוצמת סביבתיים כימיקלים, תרופות, להיות enzymatically bioactivated כדי intermediates יצירת DNA קוולנטיות adducts, הוא שדה חשוב בהתפתחות של סרטן וטיפול שלה. שיטות מתוארים עבור הפעלת מתחם לטופס שה-DNA adducts, כמו גם טכניקות שלהם זיהוי, כימות.

Covalent DNA adducts formed by chemicals or drugs with carcinogenic potency are judged as one of the most important factors in the initiation phase of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling

Covalent Binding of Antibodies to Cellulose Paper Discs and Their Applications in Naked-eye Colorimetric Immunoassays

קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין

This report presents two methods for the covalent immobilization of capture antibodies on cellulose filter paper grade No. 1 (medium-flow filter paper) ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...