Name: a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay at JoVE.

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Shanghai Comitato della scienza e della tecnologia (15411951800, 15410723200). Gli autori desiderano ringraziare la Prof. ssa YuMei Wen e Prof. ssa Chao Zhao dell'Università Dipartimento microorganismo patogeno di Fudan per loro assistenza tecnica.

Questo metodo è stato eseguito in conformità con le linee guida approvate e i regolamenti della ricerca etica Comitato di Huashan Hospital, Università di Fudan. Misure di sicurezza standard corrispondenti sono stati seguiti in ogni passo. Per una presentazione schematica, fare riferimento alla Figura 1.
1. cultura e costrutto plasmidico delle cellule
<ol><li>Gestire periodicamente delle cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) in Dulbecco s modified medium del...

<ol>
	<li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Hippel-Lindau+disease.">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li><li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma:+the+pathologist's+viewpoint.">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells/progenitors+in+the+specific+niche.">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li><li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors.">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102 (2014).</li><li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma.">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li><li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas.">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li><li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma.">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li><li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+hemangioblastoma:+histogenesis+of+stroma+cells.">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li><li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas:+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry.">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas.">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma.">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li><li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold:+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma.">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP.">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease.">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).</li><li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model.">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li><li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel.">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li><li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay:+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour.">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).</li><li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer.">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li><li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy:+animal+models+of+the+angiogenic+switch.">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li><li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis:+role+of+the+microenvironment.">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li><li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice.">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li><li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene.">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li><li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis.">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).</li></ol>

Recentemente, più campi di ricerca di biologia vascolare sono stati stimolati dallo studio dell' endotelio angiogenici15. In questo articolo, abbiamo sviluppato uno sferoide endoteliale germogliatura tecnica come modello sperimentale per studiare la formazione del vaso che proviene dalla perdita del gene VHL di funzione in cellule endoteliali manipolate identificare molecole candidate romanzo della cascata angiogenica. Al meglio della nostra conoscenza, questo è il primo rapporto per esaminare g...

Hemangioblastomas (HBs) sono tumori vascolari benigni che si trovano esclusivamente nell'ambito umano sistema nervoso centrale (CNS). Si sviluppano in pazienti con malattia di von Hippel-Lindau (VHL) o lesioni sporadiche. VHL-HBs sono difficili da curare attraverso trattamento chirurgico a causa della frequente ricorrenza e lesioni multiple che derivano da questo genetico disturbo1. Sebbene l'inattivazione del gene soppressore del tumore VHL è stata considerata la causa principale di tumorigenesis di VHL-HBs, l'origine citologica (tra cui neovascolarizzazione) e il processo evolutivo di HBs rimangono in gran parte controverso2. Di conseguenza, una migliore comprensione dei meccanismi biologici HB-neovascolare può fornire utili intuizioni più promettenti strategie anti-vascolare per VHL-HBs.
Recenti ricerche hanno suggerito che HB-neovascolarizzazione è simile alla vasculogenesi embriologica3,4,5. Classico fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)-mediata angiogenesi che ha provenuto dall'endotelio vascolare e che è guidato da perdita VHL di funzione ha provocato la proliferazione e la formazione neovascolare, che è stato sfidato6. Nel 1965, Cancilla e Zimmerman trovato, usando la microscopia, HBs originata dal endotelio7. Più successivamente è stato trovato che le cellule stromal sono derivate da vasoformative elemento8. Nel 1982, Vladimír et al ha trovato che le cellule stromale sono di origine endoteliale9. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le cellule endoteliali vascolari umane sono celle originali di HB-neovascularization10. Anche se è preferibile utilizzare le colture primarie da HB cellule derivate da pazienti ambulatori VHL, la nostra ricerca precedente indicato che colture primarie da HB non sono stabili, e linee cellulari non potevano essere stabilita3. Inoltre, le colture primarie nell'ambiente 3D non ha potevano identificare l'origine citologica della HB-neovascolarizzazione perché essi comprendono i progenitori di HB-vascolare ingredienti10,11. Pertanto, come un modello classico e primitivo delle cellule endoteliali, cellule vascolari endoteliali (HUVEC) potrebbero servire come modello cellulare alternativo per HBs.
Il dosaggio di germogliatura sferoide è un nuovo modello in tessuto ingegneria12,13. In questa carta, un 3D basati su collagene coculture sistema in vitro utilizzando la sferoide germogliatura dosaggio è stato sviluppato, con un obiettivo globale per valutare se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1516px;" width="1516">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:265px;">human umbilical vein endothelial cell</td>
			<td style="width:147px;">Fudan IBS Cell Center</td>
			<td style="width:343px;">FDCC-HXN180</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;26400044</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLKO.1-puro vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8453</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">packing plasmid psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">envelope plasmid pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3D round-bottom 96-well plates</td>
			<td>S-Bio</td>
			<td>MS-9096M</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td style="width:761px;">reduced serum medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15-well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td>Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the &#956;&#8211;Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">endothelial cell growth supplements</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1052</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10-cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Scipu000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">typsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Automated Cell Counter System &#160;</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image Analysis software&#160;</td>
			<td>Winmasis</td>
			<td style="width:343px;"></td>
			<td>http://mywim.wimasis.com&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay

L'inattivazione del gene soppressore del tumore del von Hippel-Lindau (VHL) svolge un ruolo cruciale nello sviluppo dei hemangioblastomas (HBs) entro l'umano sistema nervoso centrale (SNC). Tuttavia, sia l'origine citologica e il processo evolutivo di HBs (tra cui neovascolarizzazione) rimangono discutibili, e anti-angiogenesi per VHL-HBs, basato sul classico HB angiogenesi, hanno prodotto risultati deludenti in studi clinici. Uno dei principali ostacoli per il successo clinico di trattamento anti-vascolare è la mancanza di una conoscenza approfondita della neovascolarizzazione in questo tumore vascolare. In questo articolo, presentiamo una procedura completa per valutare in vitro se l'angiogenesi del tumore classico esiste in HBs, come pure il suo ruolo in HBs. Con questa procedura, i ricercatori possono accuratamente comprendere la complessità del neovascularization HB e identificare la funzione di questa forma comune dell'angiogenesi in HBs. Questi protocolli possono essere utilizzati per valutare la terapia anti-vascolare più promettente per i tumori, che ha alto potenziale traslazionale per trattamento di tumori o per aiutare nell'ottimizzazione del trattamento anti-angiogenico per HBs in futuro traduzioni. I risultati evidenziare la complessità della neovascolarizzazione HB e suggeriscono che questa comune forma l'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB neovascolarizzazione.

Immagini originali vengono prese dal microscopio ottico invertito. Le immagini tipiche del gruppo di controllo e del gruppo VHL sono mostrate nella Figura 2-A1 e Figura 2-A2. La lunghezza di germogliatura del gruppo di controllo è inferiore a quella del gruppo di VHL.
Dopo aver caricato le immagini, la piattaforma online fornisce diret...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Una procedura completa per valutare le prestazioni In Vitro del Hemangioblastoma Neovascularization putativo utilizzando la sferoide germogliatura Assay

Questa carta presenta una procedura completa per valutare in vitro in esistenza l'angiogenesi del tumore classico nel hemangioblastomas (HBs) e del suo ruolo in HBs. I risultati evidenziare la complessità della HB-neovascolarizzazione e suggeriscono che questa forma comune dell'angiogenesi è solo un meccanismo complementare in HB-neovascolarizzazione.

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

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