Name: a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay at JoVE.

Este trabalho foi financiado por doações da Xangai, Comitê de ciência e tecnologia (15411951800, 15410723200). Os autores desejam agradecer a Prof YuMei Wen e Prof Chao Zhao da Universidade para sua assistência técnica departamento de microorganismo patogênicos de Fudan.

Esse método foi realizado em conformidade com as directrizes aprovadas e regulamentos da investigação ética Comissão de Huashan Hospital, Universidade de Fudan. Medidas de segurança padrão correspondente foram seguidas em cada etapa. Para uma apresentação esquemática, por favor consulte a Figura 1.
1. celular cultura e construção do plasmídeo
<ol><li>Rotineiramente, manter a veia umbilical humana endothelial da pilha (HUVEC) no Dulbecco modificada do suplementad...

<ol>
	<li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Hippel-Lindau+disease.">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li><li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma:+the+pathologist's+viewpoint.">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells/progenitors+in+the+specific+niche.">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li><li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors.">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102 (2014).</li><li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma.">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li><li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas.">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li><li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma.">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li><li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+hemangioblastoma:+histogenesis+of+stroma+cells.">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li><li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas:+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry.">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas.">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma.">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li><li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold:+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma.">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP.">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease.">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).</li><li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model.">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li><li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel.">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li><li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay:+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour.">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).</li><li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer.">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li><li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy:+animal+models+of+the+angiogenic+switch.">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li><li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis:+role+of+the+microenvironment.">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li><li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice.">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li><li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene.">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li><li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis.">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).</li></ol>

Recentemente, vários campos de pesquisa da biologia vascular foram estimulados pelo estudo do endotélio angiogênico15. Neste artigo, nós desenvolvemos um esferoide endotelial brotando técnica como modelo experimental para estudar a formação de vasos que se origina a perda do gene da BVS da função nas células endoteliais manipuladas para identificar moléculas candidato romance do angiogênico cascata. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para examinar os efeitos ...

Hemangioblastomas (HBs) são tumores vasculares benignos encontrados exclusivamente dentro do sistema nervoso central humano (CNS). Eles desenvolvem em pacientes com doença de von Hippel-Lindau (BVS) ou lesões esporádicas. BVS-HBs são difíceis de curar através de tratamento cirúrgico devido a frequente recorrência e desordem de múltiplas lesões que resultam genética1. Embora a inactivação do gene supressor de tumor da BVS tem sido considerada a causa de tumorigênese da BVS-HBs, a origem citológica (incluindo a neovascularização) e processo evolutivo de HBs permanecem em grande medida controversa2. Portanto, uma melhor compreensão dos mecanismos biológicos HB-neovascular pode fornecer insights úteis sobre antivasculares mais promissoras para BVS-HBs.
Recente pesquisa sugeriu que HB-neovascularização é semelhante ao embriológicas vasculogenesis3,4,5. Clássico vascular fator de crescimento endotelial (VEGF)-mediada angiogênese que originou o endotélio vascular e que é impulsionado pela perda da BVS da função resultou na proliferação e formação neovascular, que tem sido desafiado a6. Em 1965, Cancilla e Zimmerman encontrado, usando microscopia eletrônica, que HBs originaram-se o endotélio7. Mais tarde verificou-se que as células do estroma são derivadas de vasoformative elemento8. Em 1982, Jurco et al . encontraram que as células do estroma são de origem endotelial9. Portanto, formulamos a hipótese que vascular em células endoteliais humanas é as células originais do HB-neovascularização10. Embora seja melhor usar as culturas primárias de HB células derivadas de cirurgias pacientes BVS, nossa pesquisa anterior indicou que culturas primárias de HB não são estáveis, e linhas de célula não podem ser estabelecida3. Além disso, as culturas primárias no ambiente 3D não conseguiu identificar a origem citológica do HB-neovascularização porque eles incluem os progenitores de HB-vascular ingredientes10,11. Portanto, como um modelo primitivo e clássico das células endoteliais, células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) poderiam servir como um modelo alternativo de celular para HBs.
O ensaio de germinação esferoide é um novo modelo em tecido engenharia12,13. Neste trabalho, um 3D baseados em colágeno coculture sistema em vitro usando o spheroid brotando do ensaio foi desenvolvido, com um objectivo global para avaliar se a vasculogênese clássico existe em HBs, bem como seu papel na HBs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1516px;" width="1516">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:265px;">human umbilical vein endothelial cell</td>
			<td style="width:147px;">Fudan IBS Cell Center</td>
			<td style="width:343px;">FDCC-HXN180</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;26400044</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLKO.1-puro vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8453</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">packing plasmid psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">envelope plasmid pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3D round-bottom 96-well plates</td>
			<td>S-Bio</td>
			<td>MS-9096M</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td style="width:761px;">reduced serum medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15-well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td>Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the &#956;&#8211;Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">endothelial cell growth supplements</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1052</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10-cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Scipu000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">typsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Automated Cell Counter System &#160;</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image Analysis software&#160;</td>
			<td>Winmasis</td>
			<td style="width:343px;"></td>
			<td>http://mywim.wimasis.com&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay

A inactivação do gene supressor de tumor da von Hippel-Lindau (BVS) desempenha um papel crucial no desenvolvimento da hemangioblastomas (HBs) dentro do sistema nervoso central humano (CNS). No entanto, tanto a origem citológica e o processo evolutivo da HBs (incluindo a neovascularização) permanecem controversas, e antiangiogênese para BVS-HBs, baseados no clássico HB angiogênese, têm produzido resultados decepcionantes em ensaios clínicos. Um grande obstáculo para o sucesso clínico tradução de tratamento anti-vascular é a falta de uma compreensão completa de neovascularização neste tumor vascular. Neste artigo, apresentamos um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em HBs, bem como seu papel na HBs. Com este procedimento, pesquisadores com precisão podem compreender a complexidade do HB neovascularização e identificar a função desta forma comum de angiogênese em HBs. Estes protocolos podem ser usados para avaliar a terapia anti-vascular mais promissor para os tumores, que tem alto potencial de translação para tratamento de tumores ou para ajudar na otimização do tratamento antiangiogênico para HBs, no futuro, traduções. Os resultados destacam a complexidade da HB neovascularização e sugerem que esta angiogênese formulário comum é apenas um mecanismo complementar em HB neovascularização.

Imagens originais são tomadas pelo microscópio invertido. As imagens típicas do grupo controle e o grupo BVS são mostradas na Figura 2-A1 e Figura 2-A2. O comprimento de germinação do grupo controle é mais curto que a do grupo BVS.
Depois de carregar as imagens, a plataforma on-line fornece resultados de análise diretamente. A s...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Um procedimento abrangente para avaliar o desempenho In Vitro da neovascularização de Hemangioblastoma putativo usando o Spheroid brotando do ensaio

Este trabalho apresenta um procedimento abrangente para avaliar em vitro se vasculogênese clássico existe em hemangioblastomas (HBs) e seu papel na HBs. Os resultados destacam a complexidade do HB-neovascularização e sugerem que esta forma comum de angiogênese é apenas um mecanismo complementar no HB-neovascularização.

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

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