Name: a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay at JoVE.

Este trabajo fue financiado por becas del Comité de Shanghai de ciencia y tecnología (15411951800, 15410723200). Los autores desean agradecer al Prof. YuMei Wen y Prof. Chao Zhao de la Universidad del Departamento de microorganismo patógenos de Fudan para su asistencia técnica.

Este método fue realizado según las directrices aprobadas y regulaciones de la investigación ética Comité de Huashan Hospital, Universidad de Fudan. Correspondientes medidas de seguridad estándar se siguieron en cada paso. Una presentación esquemática, por favor consulte la figura 1.
1. cultura y construcción del plásmido de la célula
<ol><li>Habitualmente, mantener las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en Dulbecco de modificado medio del águ...

<ol>
	<li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Hippel-Lindau+disease.">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li><li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma:+the+pathologist's+viewpoint.">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells/progenitors+in+the+specific+niche.">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li><li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors.">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102 (2014).</li><li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma.">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li><li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas.">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li><li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma.">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li><li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+hemangioblastoma:+histogenesis+of+stroma+cells.">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li><li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemangioblastomas:+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry.">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas.">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li><li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma.">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li><li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold:+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma.">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP.">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li><li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease.">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).</li><li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model.">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li><li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel.">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li><li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay:+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour.">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).</li><li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer.">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li><li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy:+animal+models+of+the+angiogenic+switch.">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li><li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis:+role+of+the+microenvironment.">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li><li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice.">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li><li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene.">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li><li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis.">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).</li></ol>

Recientemente, varios campos de investigación de la biología vascular fueron estimulados por el estudio del endotelio angiogénicos15. En este artículo, hemos desarrollado un esferoide endotelial brotación técnica como un modelo experimental para estudiar la formación de vasos que origina la pérdida del gen VHL de función en las células endoteliales manipuladas para identificar moléculas de nuevo candidato de la cascada angiogénica. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer...

(HBs) los hemangioblastomas son tumores vasculares benignos que se encuentran exclusivamente en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Se desarrollan en pacientes con enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) o lesiones esporádicas. BVS-HBs son difíciles de curar a través de tratamiento quirúrgico debido a la frecuente repetición y lesiones múltiples que resultan de esta genética desorden1. Aunque la inactivación del gen supresor VHL tumor se ha considerado la causa principal de la tumorigénesis de BVS-HBs, el origen citológico (incluyendo el neovascularization) y el proceso evolutivo de HBs siendo polémico en gran parte2. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos biológicos de HB-neovascular puede proporcionar ideas útiles sobre las estrategias más prometedoras vasculares para BVS-HBs.
La investigación reciente ha sugerido que HB-neovascularización es similar a la vasculogénesis embriológico3,4,5. Clásico factor de crecimiento endotelial (VEGF)-angiogénesis mediada que origina el endotelio vascular y que es conducido por pérdida de la BVS de la función dio lugar a la proliferación y la formación neovascular, que ha sido desafiado6. En 1965, Cancilla y Zimmerman encontró, utilizando microscopía electrónica, que HBs se originaron en el endotelio7. Más tarde se encontró que las células del estroma se derivan vasoformativas elemento8. En 1982, Jurco et al encontraron que las células del estroma son de origen endotelial9. Por lo tanto, la hipótesis de que las células endoteliales vasculares humanas son las células originales de neovascularización de la HB10. Aunque es mejor utilizar los cultivos primarios de células HB de cirugías pacientes VHL, nuestra investigación anterior indicó que cultivos primarios de HB no son estables, y las líneas celulares no pueden ser establecido3. Por otra parte, los cultivos primarios en el entorno 3D no pudieran identificar el origen citológico de neovascularización de HB porque incluyen los progenitores de HB-vascular ingredientes10,11. Por lo tanto, como un modelo primitivo y clásico de las células endoteliales, las células endoteliales vasculares humanas (HUVEC) podían servir como modelo celular alternativo para HBs.
El ensayo de despunte de esferoide es un nuevo modelo en tejido ingeniería12,13. En este papel, un cocultivo de colágeno-basado 3D sistema en vitro con el esferoide brotación ensayo fue desarrollado, con una meta para evaluar si la angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1516px;" width="1516">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:265px;">human umbilical vein endothelial cell</td>
			<td style="width:147px;">Fudan IBS Cell Center</td>
			<td style="width:343px;">FDCC-HXN180</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>&#160;26400044</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PLKO.1-puro vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#8453</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">packing plasmid psPAX2&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12260</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">envelope plasmid pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#12259</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3D round-bottom 96-well plates</td>
			<td>S-Bio</td>
			<td>MS-9096M</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Opti-MEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td style="width:761px;">reduced serum medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15-well plate</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81501</td>
			<td>Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the &#956;&#8211;Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">endothelial cell growth supplements</td>
			<td>Sciencell</td>
			<td>#1052</td>
			<td style="width:761px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10-cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Scipu000813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">typsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Automated Cell Counter System &#160;</td>
			<td>BioTech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Image Analysis software&#160;</td>
			<td>Winmasis</td>
			<td style="width:343px;"></td>
			<td>http://mywim.wimasis.com&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vitro performance of the putative hemangioblastoma neovascularization using the spheroid sprouting assay

La inactivación del gen de supresor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) desempeña un papel crucial en el desarrollo de hemangioblastomas (HBs) en el sistema de nervioso central (SNC) humano. Sin embargo, el origen citológico y el proceso evolutivo de HBs (incluyendo el neovascularization) siguen siendo polémicas, y anti-angiogénesis para la BVS-HBs, basados en el clásico HB angiogénesis, han producido resultados decepcionantes en ensayos clínicos. Un obstáculo importante para la traducción clínica exitosa de tratamiento vascular es la falta de un conocimiento profundo del neovascularization en este tumor vascular. En este artículo, presentamos un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en HBs, así como su papel en HBs. Con este procedimiento, los investigadores pueden comprender la complejidad de la neovascularización de la HB con precisión e identificar la función de esta forma común de la angiogénesis en HBs. Estos protocolos pueden utilizarse para evaluar la terapia vascular más prometedor para los tumores, que tiene alto potencial traslacional para tratamiento de tumores o para ayudar en la optimización del tratamiento anti-angiogénico para HBs en el futuro las traducciones. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta angiogénesis forma común es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

Imágenes originales son tomados por microscopio de luz invertida. Las imágenes típicas del grupo control y el grupo de la BVS se muestran en la figura 2-A1 y figura 2-A2. La longitud de brote del grupo de control es más corta que el del grupo VHL.
Después de subir las imágenes, la plataforma online ofrece análisis de resultados d...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Un procedimiento integral para evaluar el rendimiento In Vitro de la neovascularización de Hemangioblastoma putativo con el esferoide brotación ensayo

Este trabajo presenta un procedimiento general para evaluar en vitro si angiogénesis tumoral clásico existe en los hemangioblastomas (HBs) y su papel en HBs. Los resultados destacan la complejidad de la neovascularización de la HB y sugieren que esta forma común de angiogénesis es solamente un mecanismo complementario en la neovascularización de la HB.

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

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La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

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Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

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