Name: isolation protocol of mouse monocyte-derived dendritic cells and their subsequent in vitro activation with tumor immune complexes
Uploaded: 2018-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes at JoVE.com

De protocollen hieronder verwijzen naar het isolement van de muis MoDC, maar de algemene beginselen kunnen toepassen op andere DC deelverzamelingen cellen, ook. 12 - 16-week-oude C57Bl/6j muizen werden onderhouden in een Amerikaanse Vereniging voor de accreditatie van Laboratory Animal Care-geaccrediteerd dier faciliteit. Alle protocollen werden goedgekeurd door Stanford University en Tel-Aviv University institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. isolatie van Tumor verbonden monocyt-afgel...

<ol>
	<li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li><li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic-cell-based+therapeutic+cancer+vaccines.">Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines.</a> Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).</li><li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+function+of+dendritic+cell+subsets.">Development and function of dendritic cell subsets.</a> Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+monocytes+and+macrophages:+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny.">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li><li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+Immunity+Is+Required+for+Effective+Cancer+Immunotherapy.">Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy.</a> Cell. 168 (3), 487-502 (2017).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unsupervised+High-Dimensional+Analysis+Aligns+Dendritic+Cells+across+Tissues+and+Species.">Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species.</a> Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).</li><li>Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+use+of+dendritic+cells+for+cancer+therapy.">Clinical use of dendritic cells for cancer therapy.</a> Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).</li><li>Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradigm+Shift+in+Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy:+From+in+vitro+Generated+Monocyte-Derived+DCs+to+Naturally+Circulating+DC+Subsets.">Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets.</a> Front Immunol. 5, 165 (2014).</li><li>Banchereau, J., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+as+therapeutic+vaccines+against+cancer.">Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer.</a> Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).</li><li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dendritic+cells.">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2001).</li><li>Greter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+controls+nonlymphoid+tissue+dendritic+cell+homeostasis+but+is+dispensable+for+the+differentiation+of+inflammatory+dendritic+cells.">GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells.</a> Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).</li><li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor+on+dendritic+cell+levels+in+mouse+lymphoid+organs.">The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs.</a> Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).</li><li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c(+)MHCII(+)+Macrophages+and+Dendritic+Cells.">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li><li>Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+gating+for+spleen+monocyte+and+DC+subsets:+differences+in+autoimmune+NOD+mice+and+with+acute+inflammation.">Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation.</a> J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).</li><li>Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+spleen+monocytes+can+upregulate+CD11c+expression+without+converting+into+dendritic+cells.">Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).</li><li>Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-induced+in+vivo+expansion+of+splenic+dendritic+cells+and+their+strong+costimulation+activity.">GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity.</a> J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).</li><li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC-based+cancer+vaccines.">DC-based cancer vaccines.</a> J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).</li><li>Melief, C. J., van der Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+of+established+(pre)malignant+disease+by+synthetic+long+peptide+vaccines.">Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines.</a> Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).</li><li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+via+dendritic+cells.">Cancer immunotherapy via dendritic cells.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).</li><li>Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy:+State+of+the+Art+and+Beyond.">Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).</li><li>Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complex-mediated+antigen+presentation+induces+tumor+immunity.">Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity.</a> J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).</li><li>Schuurhuis, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complex-loaded+dendritic+cells+are+superior+to+soluble+immune+complexes+as+antitumor+vaccine.">Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine.</a> J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).</li><li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+IgG+combined+with+dendritic+cell+stimuli+induce+antitumour+T-cell+immunity.">Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity.</a> Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).</li><li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+and+SHP-1+are+DC-intrinsic+checkpoints+for+tumor+immunity.">Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity.</a> JCI Insight. 1 (18), e89020 (2016).</li><li>Kenkel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immunosuppressive+Dendritic+Cell+Subset+Accumulates+at+Secondary+Sites+and+Promotes+Metastasis+in+Pancreatic+Cancer.">An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Activation+of+CD103(+)+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition.">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li><li>Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+Limulus+amebocyte+lysate+(LAL)+to+LAL-reactive+glucans.">Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans.</a> J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).</li><li>Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotoxin-mediated+activation+of+cytokine+production+in+human+PBMCs+by+collagenase+and+Ficoll.">Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll.</a> J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).</li><li>Zhang, X., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+selective+priming+effects+on+tumor+necrosis+factor+alpha+and+nitric+oxide+production+in+mouse+peritoneal+macrophages.">Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages.</a> J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).</li><li>Hirohashi, N., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-dose+lipopolysaccharide+(LPS)+pretreatment+of+mouse+macrophages+modulates+LPS-dependent+interleukin-6+production+in+vitro.">Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro.</a> Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).</li><li>Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+responsible+for+the+priming+of+macrophage+activation.">Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).</li><li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inhibitory+receptor+(ILT3)+expressed+on+monocytes,+macrophages,+and+dendritic+cells+involved+in+antigen+processing.">A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing.</a> J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).</li><li>Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+limits+TNF-alpha+production+in+CD16-activated+monocytes.">PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+gamma+receptor+cross-linking+activates+p42,+p38,+and+JNK/SAPK+mitogen-activated+protein+kinases+in+murine+macrophages:+role+for+p42MAPK+in+Fc+gamma+receptor-stimulated+TNF-alpha+synthesis.">Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis.</a> J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).</li><li>Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+CD11b+and+CD11c+beta(2)+integrins+by+antibodies+or+soluble+CD23+induces+macrophage+inflammatory+protein+1alpha+(MIP-1alpha)+and+MIP-1beta+production+in+primary+human+monocytes+through+a+pathway+dependent+on+nuclear+factor-kappaB.">Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB.</a> Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).</li></ol>

Gezien het grote aantal DC vereist voor het vaccineren van muizen (ongeveer 2-4 x 106 DC per één muis), allermeest naar de vaccinatie strategieën in muizen zijn gebaseerd op isolatie van DC van BM en milt gevolgd door hun ex vivo -activering. Echter probeert te activeren tumor DC in vivo, met behulp van dezelfde voorwaarden voor het activeren van de milt en BM DC, vaak niet succesvol in het produceren van effectieve immuniteit geweest. In twee latere publicaties, Carmi et al. hebb...

Dendritische cellen (DC) hebben sinds hun ontdekking, een focus van uitgebreid onderzoek vanwege hun unieke vermogen om T cel differentiatie1scheef. In de afgelopen decennia, heeft een uitgebreide onderzoeksinspanning willen definiëren van de diverse subsets van de DC en hun functie tijdens de progressie van de tumor en immuniteit 2. DCs bestaan uit heterogene cel populaties die van elkaar in hun patroonherkenning receptoren, weefsel distributie verschillen, en trekvogels en antigeen presentatie mogelijkheden3,4,5. In vergelijking met de andere DC deelverzamelingen, monocyt-afgeleide DC (MoDC) zijn veel meer overvloedig in tumoren en kan gemakkelijk worden gegenereerd vanuit het circulerende of tumor-infiltreren monocyten6,,7. Dus, veel klinische proeven die willen profiteren van hun relatieve prevalentie zijn gebaseerd op de in vivo en ex vivo manipulatie van autologe MoDC om te ontlokken van T-cel-immuniteit 8,9.
Evenzo, DC-gebaseerde vaccinatie van het experimentele tumor modellen vereist 2-3 seriële injecties, 5-7 dagen uit elkaar, voor 1-2 x 106 geactiveerde DC met tumor-antigenen gepulseerde. Daarom, om te bereiken deze groot aantal DC, meeste muis studies hebben voornamelijk gebruikt MoDC gekweekt uit het beenmerg (BM) precursoren in GM-CSF voor 7-9 dagen (IL-4 niet nodig is in de muisinstelling van de)10,11. Echter heeft gezien dat GM-CSF knock-out muizen hebben over het algemeen normale DC compartiment- 12,13, en gezien de gemengde bevolking verkregen uit die cultuur,14 de fysiologische relevantie van deze DC in twijfel getrokken.
DC kan als alternatief worden routinematig geïsoleerd uit cellen van de milt. Echter, DC omvatten slechts ongeveer 0.3-0.8% van totale milt cellen (wat resulteert in ongeveer 7 x 105 DC/milt), en deze cellen, alleen CD103+ DC en MoDC kunt migreren naar de lymfoïde organen. Aangezien MoDCs ongeveer 10-15% van de milt DC populaties15,16 omvatten, rendement meeste protocollen van de isolatie ongeveer 1 x 105 MoDC per milt. Uitbreiding van MoDC kan worden bereikt door het injecteren van transfected cellen B16 die afscheiden van GM-CSF, wat resulteert in een toename van de milt MoDC17100-fold. Het gebruik van MoDC voor het ontwikkelen van DC vaccins is echter beperkt omdat deze procedure niet kan worden gedaan in de mens en de verkregen MoDC zijn al sterk geactiveerd.
Naast het verkrijgen van voldoende aantallen DC, betekent een andere uitdaging voor de ontwikkeling van effectieve DC vaccins tegen autologe kankercellen het ontbreken van voldoende gevaar signalen in de omgeving van de tumor volledig activeren DC. Inductie van co-stimulatory signalen wordt meestal bereikt door activering van patroonherkenning receptoren (PRR), of c-type lectine signalering trajecten18,19,20,21. Een verdere aanpak voor het activeren van DC exploiteert hun vermogen tot het nemen van antigenen door middel van interacties met oppervlakte Fcγ receptoren (FcγR). Inderdaad, een aantal belangrijke manuscripten hebben aangetoond dat injectie van MoDC van BM precursors geactiveerd met tumor-IgG IC tumorgroei in profylactische instellingen kunnen voorkomen, en kan leiden tot de uitroeiing van gevestigde tumoren22,23 .
In twee recente artikels ontdekte Carmi et al. dat in tegenstelling tot BMDC en milt DC, MoDC van het bloed en de tumoren kan niet op IgG IC zonder extra prikkels reageren. Dit bleek te zijn door de aanwezigheid van hoge intracellulaire niveaus van tyrosine fosfatases FcγR signalering van24,25te reguleren. Door het definiëren van een kritisch controlepunt in DC, verstrekt dit werk een belangrijk inzicht verschaffen in de vereisten voor succesvolle DC-gebaseerde vaccinatie. De eis van aanvullende stimuli om FcγR signalering en vermoedelijk signalering van andere lectine receptoren met gebruikmaking van een soortgelijk fosforylatie cascade, aldus onderstreept de noodzaak voor het vermijden van de priming voor DC tijdens hun isolement.
Daarom dit protocol beschrijft de isolatie van de MoDC uit het bloed en tumoren, die aanzienlijk van BM en milt DC afwijken, en hoogtepunten van voorzorgsmaatregelen tijdens het overwegen waard.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PREMIUM</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-5442-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9697-50MG</td>
			<td>Test each lot for endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16140071</td>
			<td>Test each lot for endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 650 MHCII</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF48- CD86</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7-Ly-C6</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7-CD15</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135523</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation protocol of mouse monocyte-derived dendritic cells and their subsequent in vitro activation with tumor immune complexes

Dendritische cellen (DC) zijn heterogene cel populaties die in hun markeringen van de celmembraan, migratiepatronen en distributie, en in hun antigeen presentatie en T-cel activatie capaciteiten verschillen. Aangezien de meeste vaccinaties van experimentele tumor modellen miljoenen DC vereisen, zijn ze wijd geïsoleerd uit het beenmerg of milt. Deze DC verschillen echter aanzienlijk van bloed en tumor DC in hun reacties immuuncomplexen (IC), en vermoedelijk aan andere lectine unnethes-coupled receptoren. Nog belangrijker is, gezien de gevoeligheid van DC naar gevaar-geassocieerde moleculen, de aanwezigheid van endotoxines of antilichamen die dwarslijn activering receptoren in één van de isoleren stappen kan resulteren in de priming voor DC en dus invloed op de parameters, of ten minste de dosering, nodig om ze te activeren. Daarom beschrijven hier we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van MoDC uit bloed en tumoren terwijl het vermijden van hun voortijdige activering. Daarnaast vindt u een protocol voor MoDC activering met tumor IC en hun latere analyses.

In eerste instantie vergeleken we de capaciteit van antilichamen van naïeve syngeneic en allogene muizen aan tumorcellen te binden. Te dien einde, waren B16F10 en LMP cellijnen van de tumor vastgesteld in paraformaldehyde en gewassen uitgebreid. B16F10 is een melanoom cellijn, die werd oorspronkelijk geïsoleerd uit Long metastasen in C57Bl/6 muizen. LMP is een tumor van de alvleesklier cel die werd geïsoleerd uit KrasG12D / +, LSL-Trp53R172H / + en Pdx-1-Cre muizen, en groeit gestaag i...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes at JoVE.com

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Overdracht van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen in tumor-dragende muizen om hun angiogene potentiaal in vivo te bestuderen

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...