Name: a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Guangdong Natural Science Foundation van China (2015A030313500), de provinciale sleutel International Cooperative onderzoeksplatform en de grote wetenschappelijke onderzoek Project van Guangdong hoger onderwijs (2015KGJHZ015), de wetenschap en Plan van de technologie van Guangdong tabak monopolie beheer (201403, 201705), de wetenschap en de technologie Plan van Guangdong van China (2016B020201001), het nationale innovatie opleidingsproject voor Voorgraadse studente (201711078001). Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.

1. bereiding van PCR producten van SSR Markers
<ol><li>Alle chemische stoffen en reagentia voorbereiden met PCR reacties, met inbegrip van sjabloon DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (met 2 × PCR buffer, 0,4 mM voor elke dNTP, 3 mM van MgCl2, 0.1 U/µL van de polymerase van DNA Taq en kleurstoffen), 10 µM van elk vooruit en achteruit inleidingen , en gedestilleerd of gedeïoniseerd water (dH2van O). Opmerking: De markeringen van de SSR gebruikt in de huidige studie werden PT51333 (toekomen ...

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genic+microsatellite+markers+in+plants:+features+and+applications.">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li><li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., N&#243;ia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers:+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+(Myrtaceae).">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li><li>Bassam, B. J., Caetano-Anoll&#233;s, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li><li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels.">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li><li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels.">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li><li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels.">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, 915-919 (1994).</li><li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li><li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment.">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li><li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels.">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li><li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

Het wassen van gel na bevruchting is een cruciale stap. Onvoldoende wassen tijd en water volume kan leiden tot de onvolledige verwijdering van bevruchting oplossing op het oppervlak van de plaat en de gel, en resulteren in een donkere achtergrond. De passende ontwikkeling tijd is een andere belangrijke stap, overmatige ontwikkeling kan resulteren in een donker-bruine achtergrond met laag contrast foto van DNA-fragmenten. Bovendien heeft de bevruchting stap aanzienlijk invloed op kleuring efficiëntie van DNA-fragmenten. ...

De ontwikkeling van PCR-gebaseerde markers heeft een revolutie teweeggebracht in de wetenschap van plantengenetica en fokken1. Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) markeringen behoren tot de meest gebruikte en meest veelzijdige DNA-merkers. Hun brede genoom dekking, overvloed, genoom specificiteit en herhaalbaarheid zijn enkele van de verdiensten van SSR markeringen naast hun codominant erfenis voor de detectie van heterozygoot genotypen2. Verschillende studies hebben SSR markeringen gebruikt om te onderzoeken van genetische diversiteit, bijhouden van afkomst, genetische koppeling kaarten bouwen, en genen voor economisch belangrijke traits3,4.
PCR producten van SSR markers worden vaak gescheiden met behulp van agarose of polyacrylamide-gel-elektroforese en vervolgens gevisualiseerd met zilveren kleuring of onder UV-licht na kleuring met ethidiumbromide. Zilveren kleuring van DNA fragmenten in polyacrylamide gels is gevoeliger dan het andere kleuring methoden5,6 en is wijd verbeid gebruikt om DNA-fragmenten zoals SSR markeringen7detecteren.
Zoals vele biologische laboratoriumtechnieken verbeterd zilveren kleuring van polyacrylamide gels gestaag is sinds haar eerste worden gerapporteerd als een fragment visualisatie techniek in 19798. De techniek werd in eerste instantie voor de opsporing van DNA-fragmenten gewijzigd door Bassam et al. 6 in 1991 en vervolgens verbeterd door Sanguinetti en collega's9 in 1994. De methode heeft verder geoptimaliseerd in de laatste paar decennia6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de meeste van deze bijgewerkte versies van de protocollen hebben echter nog steeds enkele nadelen zoals hoge technische vraag en lange verwerkingstijd voor fixatie en montage6, die de toepassing van deze protocollen7beperken, 11. Een optimale protocol dat goedkope met een hoog rendement van DNA fragment detectie combineert is dringend nodig voor routinematige toepassing van zilver kleuring in biologisch onderzoek.
Daarnaast polyacrylamidegel kan worden onderverdeeld in denatureren en niet-denaturering polyacrylamide gels en allebei kunnen worden gebruikt voor het detecteren van merkers van de SSR met behulp van de methode kleuring zilver. Het effect en de resolutie die niet aanzienlijk van elkaar verschillen, maar niet-denaturering polyacrylamide gels zijn gemakkelijker te proces en nemen minder tijd16.
Op basis van het vorige onderzoek15is het doel van de huidige studie om te beschrijven van een geoptimaliseerde zilver protocol in detail voor snelle, gemakkelijke en goedkope detecteren van SSR merkers in een niet-denaturering polyacrylamidegel kleuring.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td>
			<td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td>
			<td>#P131-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-2000 bp DNA Ladder</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>#170-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL500 DNA marker</td>
			<td>Takara Bio Inc., Japan</td>
			<td>#3590A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#79-06-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-26-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind-silane</td>
			<td>Solarbio Beijing, China</td>
			<td>#B8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#7761-88-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNO3</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7697-37-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O3.5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#10102-17-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriochrome black T(EBT)</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1787-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS-1 Shaker</td>
			<td>Qilinbeter JiangSu, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenQ M800 Scanner</td>
			<td>BenQ, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C Power supply</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td>
			<td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) is één van de meest effectieve markers in plantaardige en dierlijke genetische onderzoek en moleculaire veredeling programma's gebruikt. Zilveren kleuring is een veel gebruikte methode voor het detecteren van SSR merkers in een polyacrylamide-gel. Conventionele protocollen voor Zilveren kleuring zijn echter technisch veeleisende en tijdrovende. Net als veel andere biologische laboratorium zijn technieken, zilveren kleuring protocollen gestaag geoptimaliseerd om detectie efficiëntie te verbeteren. Wij rapporteren hier een vereenvoudigde silver kleuring methode die aanzienlijk vermindert reagens kosten en verbetert de opsporing resolutie en afbeelding duidelijkheid. De nieuwe methode vereist twee hoofdstappen (bevruchting en ontwikkeling) en drie reagentia (zilvernitraat, natriumhydroxide en formaldehyde) en slechts 7 min van verwerking voor een niet-denaturering polyacrylamide-gel. Vergeleken met de eerder gemelde protocollen, deze nieuwe methode is gemakkelijker, sneller en gebruikt minder chemische reagentia voor SSR detectie. Deze eenvoudige, goedkope en effectieve zilver kleuring protocol profiteert dus, genetische kartering en marker-assisted breeding door een snelle generatie van SSR marker gegevens.

De PCR waarbij werden geproduceerd met behulp van de bijbehorende SSR primerparen bloeiende Chinese kool en tabak. Na elektroforese, waren de gels van polyacrylamide gekleurd met behulp van de bovenstaande zilver kleuring protocol, dat ondubbelzinnig de banding patronen van SSR markers (Figuur 1 ontdekt).
Om te vergelijken de efficiëntie van de detectie van verschillende zilver kleuring van protoco...

Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Een Array gebaseerde vergelijkende Genomic hybridisatie Platform voor de efficiënte opsporing van kopie-nummer variaties in snelle neutronen geïnduceerde Medicago truncatula mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Een snelle en kwantitatieve methode voor de posttranslationele wijziging en Variant ingeschakeld toewijzing van peptiden aan Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...