Name: a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Guangdong Natural Science Foundation i Kina (2015A030313500), provinsielle nøkkel International Cooperative Research plattformen og store vitenskapelig forskning prosjekt av Guangdong høyere utdanning (2015KGJHZ015), vitenskap og Teknologiplan Guangdong tobakk monopol administrasjon (201403, 201705), vitenskap og teknologiplan Guangdong i Kina (2016B020201001), National innovasjon treningsprosjektet for studenter (201711078001). Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det oss Department of Agriculture. USDA er like muligheter leverandøren og arbeidsgiver.

1. forberedelse av PCR produkter av SSR markører
<ol><li>Forberede alle kjemikalier og reagenser PCR reaksjoner inkludert mal DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (inneholder 2 × PCR buffer, 0.4 mM av hver dNTP, 3 mM MgCl2, 0.1 U/µL Taq DNA utvalg og fargestoffer), 10 µM hver vanlige og motsatte primere , og destillert eller vaskebuffer vann (dH2O). Merk: SSR markører brukes studien var PT51333 (videresende primer sekvens: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' og omvendt primer rekkefølgen: 5 "...

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genic+microsatellite+markers+in+plants:+features+and+applications.">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li><li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., N&#243;ia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers:+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+(Myrtaceae).">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li><li>Bassam, B. J., Caetano-Anoll&#233;s, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li><li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels.">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li><li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels.">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li><li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels.">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, 915-919 (1994).</li><li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li><li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment.">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li><li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels.">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li><li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

Vask av gel etter impregnering er kritiske. Utilstrekkelig vask kan tid og forårsake ufullstendig fjerning av impregnering løsning på overflaten av platen og gel, og føre til en mørk bakgrunn. Riktig utvikling tid er et viktig skritt, over-utvikling kan medføre mørkebrunt bakgrunn med lav kontrast bilde av DNA. I tillegg påvirker impregnering trinnet betydelig flekker effektiviteten av DNA. Selv om utvide impregnering tiden over 5 min eller øke AgNO3 beløpet i impregnering løsningen ikke betydelig b...

Utviklingen av PCR-baserte markører har revolusjonert vitenskapen om anlegget genetikk og avl1. Enkel sekvens gjenta (SSR) markører er blant de mest brukte og mest allsidige DNA-markørene. Deres bred genomet dekning, overflod, genomet spesifisitet og repeterbarhet er noen av fordelene ved SSR markører i tillegg til sin codominant arv for påvisning av heterozygote genotyper2. Flere studier har brukt SSR markører å undersøke genetisk mangfold, følge forfedre, konstruerer genetisk kobling kart og kart gener for økonomisk viktigste trekk3,4.
PCR produkter for SSR skilles vanligvis bruker agarose eller polyakrylamid gel geleelektroforese og deretter visualisert med sølv flekker eller under UV-lys etter farging med ethidium bromide. Sølv farging av DNA i polyakrylamid gels er mer følsomme enn andre flekker metoder5,6 og har vært mye brukt til å oppdage DNA fragmenter som SSR markører7.
Som mange biologiske laboratorier teknikker, har sølv flekker polyakrylamid gelé stadig økt siden sin første rapporteres som et fragment visualisering teknikk i 19798. Teknikken ble først endret for oppdagelsen av DNA fragmenter av Bassam et al. 6 i 1991 og deretter forbedret av Sanguinetti og kolleger9 i 1994. Metoden er blitt fremme optimert i de siste par tiår6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. men de fleste av disse oppdaterte versjoner av protokollene har fortsatt noen ulemper som høy teknisk etterspørsel og lenge saksbehandlingstid for fiksering og montering6, som begrenser anvendelsen av disse protokollene7, 11. En optimal protokoll som kombinerer lav pris med høy effektivitet av DNA fragment er et presserende behov for rutinemessig bruk av sølv flekker i biologisk forskning.
I tillegg polyakrylamid gel kan deles inn i denaturing og ikke-denaturing polyakrylamid gels, og begge kan brukes for påvisning av SSR markører bruker sølv flekker metoden. Effekten og oppløsning som avviker ikke i vesentlig, men ikke denaturing polyakrylamid gels er enklere å håndtere og ta mindre tid16.
Basert på den tidligere forskning15er målet med denne studien å beskrive en optimalisert sølv flekker protokollen for rask, enkel og rimelig påvisning av SSR markører i en ikke-denaturing polyakrylamid gel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td>
			<td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td>
			<td>#P131-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-2000 bp DNA Ladder</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>#170-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL500 DNA marker</td>
			<td>Takara Bio Inc., Japan</td>
			<td>#3590A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#79-06-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-26-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind-silane</td>
			<td>Solarbio Beijing, China</td>
			<td>#B8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#7761-88-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNO3</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7697-37-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O3.5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#10102-17-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriochrome black T(EBT)</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1787-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS-1 Shaker</td>
			<td>Qilinbeter JiangSu, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenQ M800 Scanner</td>
			<td>BenQ, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C Power supply</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td>
			<td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

Enkel sekvens gjenta (SSR) er en av de mest effektive markørene brukes i plante- og genetisk forskning og molekylære avlsprogram. Sølv flekker er en mye brukt metode for påvisning av SSR markører i en polyakrylamid gel. Men er konvensjonelle protokoller for sølv flekker teknisk krevende og tidkrevende. Som mange andre biologiske laboratorier har teknikker, sølv Fargeprotokoller stadig blitt optimalisert for å forbedre effektiviteten deteksjon. Her rapporterer vi et forenklet sølv flekker metode som betydelig reduserer reagens kostnader og forbedrer oppdagelsen oppløsning og klarhet. Den nye metoden krever to hovedtrinn (impregnering og utvikling) og tre reagenser (sølv nitrat, natriumhydroksid og formaldehyd), og bare 7 minutter behandling for en ikke-denaturing polyakrylamid gel. Sammenlignet med tidligere rapportert protokoller, denne nye metoden er enklere, raskere og bruker færre kjemiske reagenser til SSR gjenkjenning. Derfor fordelen denne enkel, rimelig og effektiv sølv flekker protokollen genetisk kartlegging og markør-assistert avl av en rask generasjon SSR markøren dataene.

PCR-amplicons ble produsert ved hjelp av tilsvarende SSR primer parene i blomstrende kinesisk kål og tobakk. Etter geleelektroforese, var polyakrylamid geléer farget med over sølv flekker protokollen, som utvetydig oppdaget striper mønstre for SSR (figur 1).
For å sammenligne effektiviteten deteksjon av ulike sølv fargeprotokoller, PCR produkter av SSR markører i tobakk og blomstrende kinakå...

Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Her rapporterer vi et enkelt og rimelig sølv flekker protokollen som krever bare tre reagenser og 7 min behandling, og er egnet for rask generasjon av høy kvalitet SSR data i genetisk analyse.

En rask sølv flekker protokollen muliggjør enkel og effektiv deteksjon av SSR markører bruker en ikke-denaturing polyakrylamid Gel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartlegging av RNA-RNA-interaksjoner globalt ved bruk av biotinylert psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Ved hjelp av en Fluorescent PCR-kapillar-gelelektroforese teknikken for å genotype CRISPR / Cas9-mediert knockout-mutanter i en high-throughput-format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation å studere i Vivo mobilnettet Svar å enkle og komplekse DNA skade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En matrise-basert sammenlignende Genomic hybridisering plattform for effektiv påvisning av kopi nummer variasjoner i rask Neutron-indusert Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produksjon og identifikasjon av CRISPR/Cas9-generert Gene Knockouts i modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

En enkel, rask og kvantitative analysen mål reparasjon av DNA-protein krysskoblinger på plasmider transfekterte i pattedyrceller

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral formidlet produksjon av transgene mus: en enkel og svært effektiv metode for direkte av grunnleggerne

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En rask og kvantitativ metode for post-translasjonell modifikasjon og Variant aktivert tilordning av peptider å genomer

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...