Name: a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

Эта работа финансировалась фонд естественных наук Гуандун Китая (2015A030313500), провинциальные ключ международного кооперативного исследовательская платформа и крупные научно исследовательский проект Гуандун высшего образования (2015KGJHZ015), Наука и Технология план администрации монополии табака Гуандун (201403, 201705), науки и технологии план Гуандун Китая (2016B020201001), национальной инновационной учебного проекта для студентов (201711078001). Упоминание названия торговых или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. USDA — равных возможностей поставщика и работодателем.

1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR
<ol><li>Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl2, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовк...

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genic+microsatellite+markers+in+plants:+features+and+applications.">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li><li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., N&#243;ia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers:+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+(Myrtaceae).">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li><li>Bassam, B. J., Caetano-Anoll&#233;s, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li><li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels.">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li><li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels.">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li><li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels.">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, 915-919 (1994).</li><li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li><li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment.">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li><li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels.">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li><li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чре?...

Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения1. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов2. Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт3,4.
Продукты PCR маркеров SSR обычно разделяются с помощью электрофореза агарозы или геля полиакриламида и затем визуализируется с Серебряный пятнать или под УФ света после окрашивания бромидом ethidium. Серебряный пятнать фрагментов ДНК в полиакриламидных гелей более чувствительны, чем другие пятная методы5,6 и широко используется для обнаружения фрагментов ДНК как ССР маркеры7.
Как много методов биологической лаборатории серебро Окрашивание акриламидных гелей неуклонно улучшилось после ее первых сообщанными как метод визуализации фрагмента в 1979 году8. Техника первоначально была изменена для обнаружения фрагментов ДНК Бассам и др. 6 в 1991 году и затем улучшить Сангинетти и coworkers9 в 1994 году. Метод был оптимизирован в последние несколько десятилетий6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Однако, большинство этих обновленных версий протоколов до сих пор некоторые недостатки, такие как высокий спрос технических и долго время для фиксации обработки и монтажа6, которые ограничивают применение этих протоколов7, 11. Это оптимальный протокол, который сочетает в себе лоу кост с высокой эффективностью обнаружения фрагментов ДНК срочно необходима для обычного применения Серебряный пятнать в биологических исследованиях.
Кроме того гель полиакриламида можно подразделить денатурируя и не денатурации полиакриламидные гели, и оба могут быть использованы для обнаружения маркеров SSR с помощью Серебряный пятнать метод. Эффект и разрешение которых существенно не отличается, но не денатурации полиакриламидных гелей проще процесс и занять меньше времени16.
На основе предыдущих исследований15целью настоящего исследования является описать оптимизированный Серебряный пятнать протокол в деталях для быстро, просто и лоу кост обнаружения маркеров SSR-Денатурирующий гель полиакриламида.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td>
			<td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td>
			<td>#P131-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-2000 bp DNA Ladder</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>#170-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL500 DNA marker</td>
			<td>Takara Bio Inc., Japan</td>
			<td>#3590A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#79-06-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-26-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind-silane</td>
			<td>Solarbio Beijing, China</td>
			<td>#B8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#7761-88-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNO3</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7697-37-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O3.5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#10102-17-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriochrome black T(EBT)</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1787-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS-1 Shaker</td>
			<td>Qilinbeter JiangSu, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenQ M800 Scanner</td>
			<td>BenQ, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C Power supply</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td>
			<td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.

Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазон...

Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.

Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Сопоставление взаимодействия РНК-РНК в глобальном масштабе с использованием биотинилированного псоралена

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Использование Флуоресцентный ПЦР-капиллярного электрофореза гель Техника генотипу CRISPR / cas9-опосредованной Нокаут Мутанты в формате высокой пропускной способностью

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Эффективное производство и генерируемые идентификации ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена нокауты в модели системы данио рерио

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Высокоэффективные гена срыв мышиных и человека гемопоэтических предшественников клеток ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Простой, быстрый и количественные Assay мера ремонт ДНК белковых сшивки на плазмид Transfected в клетки млекопитающих

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Лентивирусные опосредованной производства трансгенных мышей: простой и очень эффективный метод для непосредственного изучения учредителей

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Быстрый и количественный метод для столб-поступательные изменения и вариант включено сопоставление пептидов в геномов

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...