Name: a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel
Uploaded: 2018-04-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

Detta arbete finansierades av den Guangdong naturvetenskap Foundation i Kina (2015A030313500), den provinsiella nyckel internationella Cooperative Research Platform och stora vetenskapliga forskning projekt av Guangdong högre utbildning (2015KGJHZ015), vetenskapen och Plan för Guangdong tobak monopolförvaltningen (201403, 201705), vetenskap och teknik Plan i Guangdong i Kina (2016B020201001), den nationella innovationsprojekt utbildning för studenter (201711078001). Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i denna publikation är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av oss jordbruksdepartementet. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.

1. beredning av PCR produkter av SSR markörer
<ol><li>Förbereda alla kemikalier och reagenser för PCR-reaktioner inklusive mall DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (innehållande 2 × PCR buffer, 0,4 mM för varje dNTP, 3 mM av MgCl2, 0,1 U/µL av Taq-DNA-polymeras och färgämnen), 10 µM varje framåt och bakåt grundfärger , och destillerat eller avjoniserat vatten (dH2O). Obs: De SSR-markörer som används i den aktuella studien var PT51333 (vidarebefordra primer sekvens: 5 ' - GCACCTT...

<ol>
	<li>Jiang, G. L., Anderson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+markers+and+marker-assisted+breeding+in+plants.">Molecular markers and marker-assisted breeding in plants.</a> Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).</li><li>Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphism+revealed+by+simple+sequence+repeats.">Polymorphism revealed by simple sequence repeats.</a> Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).</li><li>Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genic+microsatellite+markers+in+plants:+features+and+applications.">Genic microsatellite markers in plants: features and applications.</a> Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).</li><li>Tuler, A. C., Carrijo, T. T., N&#243;ia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SSR+markers:+a+tool+for+species+identification+in+Psidium+(Myrtaceae).">SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae).</a> Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).</li><li>Bassam, B. J., Caetano-Anoll&#233;s, G., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+silver+staining+of+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).</li><li>Liang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+effective+method+for+silver+staining+of+PCR+products+separated+in+polyacrylamide+gels.">A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).</li><li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels.">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).</li><li>Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+silver+staining+and+recovery+of+PCR+products+separated+on+polyacrylamide+gels.">Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels.</a> Biotechniques. 17, 915-919 (1994).</li><li>Ji, Y., Qu, C., Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).</li><li>Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+sensitive+method+of+DNA+silver+staining+in+polyacrylamide+gels.">Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).</li><li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silver+staining+procedure+for+nucleic+acids+in+polyacrylamide+gels+without+fixation+and+pretreatment.">A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment.</a> Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).</li><li>Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+method+for+silver-staining+DNA+in+large+numbers+of+polyacrylamide+gels.">An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).</li><li>Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+way+to+detect+small+polymorphic+bands+in+plants.">Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants.</a> Genome Data. 5, 218-222 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simple+and+effective+silver+staining+protocol+for+detection+of+DNA+fragments.">Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments.</a> Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).</li><li>Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+high-throughput+polyacrylamide+gel+electrophoresis+system+for+genotyping+with+microsatellite+DNA+markers.">A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers.</a> Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).</li><li>Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microsatellite+markers+in+eastern+white+pine.">Characterization of microsatellite markers in eastern white pine.</a> Genome. 39, 1102-1108 (1996).</li></ol>

Tvättning av gel efter impregnering är ett viktigt steg. Otillräcklig tvätt tid och vatten volym kan orsaka ofullständig avlägsnande av impregnering lösning på ytan av plattan och gelen, och resultera i en mörk bakgrund. Utveckla tid är ett annat viktigt steg, överexploatering kan resultera i en mörkbrun bakgrund med låg kontrast bild av DNA-fragment. Dessutom påverkar det impregnering steget avsevärt färgning effektivitet av DNA-fragment. Trots att förlänga impregnering tiden över 5 min eller öka AgN...

Utvecklingen av PCR-baserade markörer har revolutionerat vetenskapen om växtgenetik och avel1. Enkel sekvens upprepade (SSR) markörer är bland de vanligaste och mest mångsidiga DNA-markörerna. Deras breda genomet täckning, överflöd, genomet specificitet och repeterbarhet är några av fördelarna med SSR markörer utöver sin codominant arv för detektion av heterozygot genotyper2. Flera studier har använt SSR markörer att undersöka genetisk mångfald, spåra anor, konstruera genetisk koppling kartor och karta gener för ekonomiskt viktiga drag3,4.
PCR-produkter av SSR markörer skiljs vanligen använda agaros eller polyakrylamid gel elektrofores och sedan visualiseras med silverfärgning eller under UV-ljus efter färgning med etidiumbromid. Silverfärgning av DNA-fragment i polyakrylamidgeler är känsligare än andra färgning metoder5,6 och har använts i stor utsträckning att upptäcka DNA-fragment som SSR markörer7.
Som många biologiska laboratorietekniker, har silverfärgning av polyakrylamidgeler stadigt förbättrats sedan dess första rapporteras som en fragment visualisering teknik i 19798. Tekniken ändrades initialt för upptäckt av DNA-fragment av Bassam o.a. 6 1991 och sedan förbättras genom Sanguinetti och medarbetare9 1994. Metoden har optimerats ytterligare sista några decennier6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de flesta av dessa uppdaterade versioner av protokollen har dock vissa nackdelar såsom hög teknisk efterfrågan och långa handläggningstiden för fixering och montering6, som begränsa tillämpningen av dessa protokoll7, 11. En optimal protokoll som kombinerar låg kostnad med hög verkningsgrad för DNA fragment upptäckt behövs omgående för rutinmässiga tillämpningen av silver färgning i biologisk forskning.
Dessutom Polyakrylamidgelen kan delas in i denatureringen och icke-denatureringen polyakrylamidgeler, och båda kan användas för detektion av SSR markörer använder silver färgning metod. Effekten av och upplösning som avsevärt skiljer sig inte, men icke-denatureringen polyakrylamidgeler är lättare att bearbeta och ta mindre tid16.
På grundval av den tidigare forskningen15är syftet med den aktuella studien att beskriva en optimerad silver färgning protokoll i detalj för snabb, enkel och billig upptäckt av SSR markörer i en icke-denatureringen polyakrylamidgel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR master mix (Green Taq Mix)</td>
			<td>Vazyme Biotech Co. Ltd, China</td>
			<td>#P131-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-2000 bp DNA Ladder</td>
			<td>Bio-Rad, USA</td>
			<td>#170-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL500 DNA marker</td>
			<td>Takara Bio Inc., Japan</td>
			<td>#3590A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#6381-92-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#79-06-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#39;-methylene-bis-acrylamide</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-26-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sangon Biotech Shanghai, China</td>
			<td>#110-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bind-silane</td>
			<td>Solarbio Beijing, China</td>
			<td>#B8150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AgNO3</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#7761-88-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1310-73-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-19-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CO3</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#497-19-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HNO3</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#7697-37-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O3.5H2O</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China</td>
			<td>#10102-17-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eriochrome black T(EBT)</td>
			<td>Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China</td>
			<td>#1787-61-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tray</td>
			<td>Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS-1 Shaker</td>
			<td>Qilinbeter JiangSu, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenQ M800 Scanner</td>
			<td>BenQ, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DYY-6C Power supply</td>
			<td>Beijing Liuyi Instrument Factory, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High throughout vertical gel systems, JY-SCZF</td>
			<td>Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fast silver staining protocol enabling simple and efficient detection of ssr markers using a non-denaturing polyacrylamide gel

Enkel sekvens upprepa (SSR) är en av de mest effektiva markörer som används i växt- och genetisk forskning och molekylär avelsprogram. Silverfärgning är en allmänt använd metod för detektion av SSR markörer i en polyakrylamidgel. Konventionella protokoll för silverfärgning är dock tekniskt krävande och tidsödande. Som många andra biologiska laboratorium har tekniker, silver färgprotokoll stadigt optimerats för att effektivisera upptäckt. Här rapporterar vi förenklade silver färgning metod som avsevärt minskar kostnaderna för reagens och förbättrar detektion upplösning och bildkvalitet tydligheten. Den nya metoden kräver två stora steg (impregnering och utveckling) och tre reagenser (silvernitrat, natriumhydroxid och formaldehyd), och endast 7 min behandling för en icke-denatureringen polyakrylamidgel. Jämfört med tidigare rapporterade protokoll, denna nya metod är enklare, snabbare och använder färre kemiska reagenser för SSR upptäckt. Därför gynnar detta enkla, Billiga och effektiva silver färgning protokoll genetisk kartläggning och markör-assisted avel av en snabb generering av SSR markör data.

De PCR-amplikoner producerades med hjälp av motsvarande SSR primer par i blommande kinakål och tobak. Efter elektrofores, var polyakrylamidgeler färgas med ovanstående silver färgning protokollet, som otvetydigt upptäckt banding mönster av SSR markörer (figur 1).
För att jämföra olika silver färgprotokoll upptäckt effektivitet, PCR-produkter av SSR markörer i tobak och blommande Kinak?...

Watch this Scientific Journal Video about A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel at JoVE.com

A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel

Vi rapporterar här, enkel och billig silver färgning protokoll som kräver endast tre reagenser och 7 min behandling, och lämpar sig för snabb generering av hög kvalitet SSR data i den genetiska analysen.

En snabbt Silver färgning protokoll möjliggör enkel och effektiv upptäckt av SSR markörer med en icke-denatureringen polyakrylamidgel

Simple Sequence Repeat (SSR) is one of the most effective markers used in plant and animal genetic research and molecular breeding programs. Silver ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

Med hjälp av en fluorescerande PCR-kapillärgelelektrofores Technique att genotypa CRISPR / Cas9-medierad Knockout mutanter i en hög kapacitet Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

En Array-baserad jämförande genomisk hybridisering plattform för effektiv upptäckt av kopia antalet variationer i snabbt Neutron-inducerad Medicago truncatula mutanter

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effektiv produktion och identifiering av CRISPR/Cas9-genererade gen Knockouts i det modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

En enkel, snabb och kvantitativa analysen till åtgärd reparation av DNA-protein antipyridinantikropp på plasmider transfekterade i däggdjursceller

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

En snabb och kvantitativ metod för posttranslationella modifieringen och Variant aktiverad mappning av peptider till genomen

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...