Name: paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de NSF carrière AWARD 1553023 en NIH/NIAID award R01AI103369.

1. de groei van Pseudomonas aeruginosa kolonie Biofilms
<ol><li>Bereiding van Medium-dubbelgelaagde platen<ol>
<li>Bereiden van een 10 g/L trypton, 10 g/L agar (Zie Tabel van materialen) oplossing in gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 20 minuten afkoelen tot 50-60 ° C in een waterbad.</li>
		<li>45 mL van de oplossing van de agar-trypton giet in een vierkante schotel van 100 x 100 mm (Zie Tabel van materialen) met behulp van een conische buis van 50 mL. De agar te st...

<ol>
	<li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development.">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li><li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP.">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm.">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms.">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li><li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections.">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li><li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA.">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).</li><li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biofilms+in+Tissue+Specimens.">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li><li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models.">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li><li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence.">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538 (2017).</li><li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms.">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysogeny+at+mid-twentieth+century:+P1,+P2,+and+other+experimental+systems.">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria.">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li><li>Zupan&#269;i&#269;, D., Ter&#269;elj, M., &#352;trus, B., Verani&#269;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section?.">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy.">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li><li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments:+fixation+of+pure+actin+filament+pellets.">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li><li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse.">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li><li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+crosslinking:+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes.">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li><li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li></ol>

Paraffine-insluiting en dun-afdelen weefselsteekproeven is een klassieke histologische techniek die toelaat beeldvorming van micro-morfologische structuren en wordt vaak gebruikt op eukaryotische weefsels, en met enig succes is vereffend met microbiële monsters8 ,9. Terwijl cryoembedding voor sterke eigendomsvoorbehoud endogene en immunefluorescentie signaal zorgt, is het insluiten van paraffine over het algemeen beter als het biedt beter behoud van morfologie<...

Meeste microben hebben de capaciteit om formulier biofilms, samengehouden gemeenschappen van cellen door zelf geproduceerde matrices. Biofilms kunnen worden gekweekt in vele soorten van fysieke setups, met verschillende regimes van nutriënten en substraat bepaling. Specifieke tests voor biofilm vorming neiging om opbrengst reproduceerbare meercellige structuren, en gemeenschappelijke platforms voor fylogenetisch divers soort de Gemeenschap of de macroscopische niveau in acht worden genomen. Wanneer microben zijn gegroeid als kolonies op solide medium onder een atmosfeer, macroscopische morfologie brengt informatie over de capaciteit voor de productie van de matrix en vaak correleert met andere eigenschappen 1,2,3. De interne architectuur van microbiële kolonies bieden ook aanwijzingen met betrekking tot de biofilm-specifieke chemie en fysiologie, maar moeizaam te karakteriseren. Recente toepassingen van cryoembedding en cryosectioning technieken aan bacteriële kolonies hebben ingeschakeld beeldvorming en visualisatie van specifieke kenmerken op ongekende resolutie 4,5,6. Studies met dierlijk weefsel hebben echter aangetoond dat paraffine insluiten biedt superieure behoud van morfologie in vergelijking met cryoembedding 7 en is gebruikt voor het visualiseren van bacteriën in weefsels 8,9. Daarom hebben we een protocol voor fixatie, paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie biofilms ontwikkeld. Hier beschrijven we de voorbereiding van Pseudomonas aeruginosa PA14 kolonie-biofilm dunne secties 10,11, maar we hebben ook met succes deze techniek toegepast om biofilms gevormd door de bacteriën Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, en Vibrio cholerae12.
Het proces van paraffine-insluiting en dun-afdelen biofilms volgt een eenvoudige logica. Ten eerste, de biofilms zijn ingekapseld in een laagje agar morfologie behouden tijdens de verwerking. Ten tweede, de ingekapseld-biofilms zijn ondergedompeld in een hechtmiddel aan dwarslijn macromoleculen en micromorfologie behouden. Deze zijn vervolgens gedehydrateerde met alcohol, gewist met een meer niet-polair oplosmiddel en vervolgens geïnfiltreerd met vloeibare paraffine. Zodra het geïnfiltreerd, worden de monsters ingebed in de wax blokken voor het segmenteren. Secties zijn gesneden, gemonteerd op dia's en vervolgens gerehydrateerd om hen terug te keren naar een meer oorspronkelijke staat. Vanaf dit punt, kunnen zij worden gekleurd of bedekt met montage medium voor microscopische analyse.
Dit protocol produceert dunne secties van microbiële biofilms geschikt voor histologisch analyse. Kolonie biofilm substructuren worden weergegeven als dunne secties opgesteld op basis van deze methode zijn beeld door de lichte microscopie. Biofilms kunnen ook worden gekweekt op media met fluorescerende vlekken specifiek voor afzonderlijke functies of gekleurd bij de rehydratie stap, onmiddellijk voorafgaand aan de montage (stappen 9.5-9.6). Ten slotte kunnen microben worden ontworpen om te produceren van fluorescente proteïnen in een constitutief of gereglementeerde mode waardoor in situ rapportage van de cel distributie of gen expressie binnen deze Gemeenschappen. We hebben deze methoden gebruikt om te bepalen van de kolonie biofilm diepte, cel distributie, verdeling van de matrix, groeipatronen en Spatio genexpressie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">5 3/4&#34; Pasteur pipette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">13-678-6A</td>
			<td style="width:577px;">Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Agar&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Pyrex</td>
			<td style="width:161px;">5340</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chemically-resistant Marking Pen</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">103051-182</td>
			<td>Manufacturer: Leica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Clear Fingernail Polish&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Congo Red Indicator Grade</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">AAAB24310-14</td>
			<td>Manufacturer: Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Coomassie Blue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">EM-3340</td>
			<td>Manufacturer: EMD Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 247 04</td>
			<td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Embedding Mold&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>3D printed in-house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Embedding Mold (commercial)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol 200P</td>
			<td style="width:191px;">Decon Labs, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:161px;">2701</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fine-tipped Brush</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought, paint brush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Coverslips 60x22mm</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-519-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Rehydration Mailer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">21043</td>
			<td>20 slide mailer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 899 90150</td>
			<td>Manufacturer: National Diagnostics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Histosette, Embedding Casette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15 182 701A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">L-lysine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP386 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Low Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">22 210 048</td>
			<td>Manufacturer: Sturkey&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89080-004</td>
			<td>Promo-pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:191px;">See comments section</td>
			<td style="width:161px;">See comments section</td>
			<td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Microtome&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">905200U/00016050</td>
			<td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td>
			<td style="width:191px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:161px;">RSOF0010-500A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Paraplast Xtra (paraffin wax)</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">15159-486</td>
			<td>Manufacturer: McCormick Scientific&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Petri Dishes Square 100x100x15mm</td>
			<td style="width:191px;">Laboratory Disposable Products&#160;</td>
			<td style="width:161px;">D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">EMD Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:161px;">PX1405-1</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P380-500</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Razor Blades&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">55411-050</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Slide Warmer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0865259</td>
			<td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">0241-1KG</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">BDH9296.500</td>
			<td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Suprafrost Histology Slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue Flotation Water Bath&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0815797</td>
			<td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Automatic Tissue Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">813160U/Q#00009061</td>
			<td>Model: STP120 Tissue Processor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tryptone&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">T9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Y9010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

Afdelen via het insluiten van paraffine is een grotendeels gevestigde techniek in eukaryotische systemen. Wij bieden hier een methode voor de fixatie, insluiten, en segmenteren van intact microbiële kolonie biofilms gebruik van paraffine geperfundeerd. Aan te passen deze methode voor gebruik op de kolonie biofilms, we ontwikkelde technieken voor het behoud van elk monster op het substraat van de groei en het lamineren met een agar-overlayer, en lysine toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing. Deze optimalisaties verbeteren monster bewaring en het behoud van micromorphological functies. Monsters voorbereid op deze wijze zijn vatbaar voor dunne segmenteren en imaging door licht, fluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie. Wij hebben deze techniek toegepast om de kolonie biofilms van Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisen Vibrio cholerae. Het hoge niveau van detail zichtbaar in de monsters die zijn gegenereerd door deze methode, gecombineerd met verslaggever stam engineering of het gebruik van bepaalde kleurstoffen, spannende inzichten in de Fysiologie en de ontwikkeling van microbiële gemeenschappen kan bieden.

Deze methode genereert biofilm dun-secties waarin verschillende morfologische kenmerken en de zones van de genexpressie door DIC, fluorescentie microscopie en TEM beeld kunnen worden. Hoewel DIC geschikt zijn met behulp van een 40 X olie onderdompeling doelstelling kan voldoende zijn om te laten zien van sommige morfologische kenmerken (figuur 2E), we hebben gevonden dat fluorescentie microscopie van stammen ontworpen om constitutively express fluorescent pro...

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis at JoVE.com

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms

Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

Neutrophils are the first line of defense deployed by the immune system during microbial infection. In vivo, neutrophils are recruited to the site of ...