Name: variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems
Uploaded: 2018-02-06T14:45:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems at JoVE.com

نحن ممتنون جداً لبيتر نايت لإجراء مناقشات مفيدة واستعراض نقدي للمخطوطة. ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبرات نيل رانسون وستيفن مونش وموظفي المختبر بيوستروكتوري أستبوري لإجراء مناقشات مفيدة. تم تمويل هذا العمل من قبل "مجلس البحوث الأوروبي" (FP7-2007-2013)/منسق الإغاثة الطارئة منح اتفاق 322408. ج-البروتين أنتجت باستخدام الموارد التي توفرها منحة "مؤسسة القلب البريطانية" (بهف بيكوغرام/13/83/30485). كما نشكر مؤسسة ويلكوم ترست للمعدات التمويل لدعم الميكروسكوب الإلكتروني في ليدز (090932/Z/09/Z و 094232/Z/10/Z). وتمول "منحة ويلكوم ترست الرياضي" CS.

<ol>
	<li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+Resolution+Barriers+to+Facilitate+Drug+Discovery.">Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Ha, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+complete+COG+tethering+complex.">Molecular architecture of the complete COG tethering complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).</li><li>Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+negative+stain+and+single-particle+image+processing+to+explore+dynamic+properties+of+flexible+macromolecules.">Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules.</a> J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).</li><li>Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative-stain+single+particle+EM+of+the+maltose+transporter+in+nanodiscs+reveals+asymmetric+closure+of+MalK2+and+catalytic+roles+of+ATP,+MalE+and+maltose.">Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy+for+apoE4+POPC+lipoprotein.">An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein.</a> J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).</li><li>Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, 101-147 (1972).</li><li>Massover, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+staining+of+protein+molecules+for+electron+microscopy:+polyiodination+of+the+apoferritin+shell+in+ferritin.">Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin.</a> Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).</li><li>Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Developments+in+Negative+Staining+for+Transmission+Electron+Microscopy.">Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy.</a> Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).</li><li>Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lanthanide+salts+as+alternative+stains+to+uranyl+acetate.">Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate.</a> Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).</li><li>Zhao, F., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).</li><li>Cao, B., Xu, H., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+to+image+bioinorganic+nanohybrids:+the+case+of+phage-gold+nanocomposites.">Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites.</a> Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+shows+superposition+and+large+scale+flexibility+within+cytoplasmic+dynein+motors+moving+along+microtubules.">Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules.</a> Nat Commun. 6, 8179 (2015).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+determination+of+the+helical+repeat+of+tobacco+mosaic+virus.">Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus.</a> Virology. 369 (1), 226-227 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination.">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).</li><li>Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+negative+staining+still+a+place+in+biomacromolecular+electron+microscopy?.">Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy?.</a> Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).</li><li>Garewal, M., Zhang, L., Ren, G., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). 974, 111-118 (2012).</li><li>Walker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-headed+binding+of+a+processive+myosin+to+F-actin.">Two-headed binding of a processive myosin to F-actin.</a> Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Macromolecular+Assemblies+by+Electron+Microscopy.">Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy.</a> Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

ويصف هذه المخطوطة أساليب متعددة لتلطيخ سلبية العينات للمجهر الإلكتروني باستخدام مجموعة متنوعة من تلطيخ الكواشف، بما في ذلك اثنان من الكواشف لانثانيدات رواية (TmAc و ErAc). العديد من الخطوات العملية المصبوغة السلبية يجب أن يكون الأمثل للعينات الفردية بما في ذلك الاختيار من وصمة عار ومقدار الغسيل المطلوبة أن وجدت، وتقنية بلوتينج. هذه المخطوطة يوفر بالتالي أساسا ميكروسكوبيستس تطوير مهام سير العمل الخاصة بهم لمعالجة السلبية يلطخ أنظمة صعبة.
اختيار وصمة عار الغاية عينة تعتمد. قد تتحلل العينات التي تكون حساسة بشكل خاص إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني بتعميم الوصول إلى الخدمات و/أو الجبهة المتحدة، وعلى الرغم من خصائص هذه البقع19مثبت. وفي هذه الحالات، يقوم لانثانيدات البقع مثل TmAc أو ErAc، قد يكون من الأنسب، على الرغم من أن الرقم الهيدروجيني عموما من الإعداد يجب أن يبقى أقل من نقطة isoelectric من البروتين عينة للمساعدة في منع تلطيخ إيجابية. يمكن أن يتحقق هذا يحمض وصمة عار مع حمض الخليك إذا لزم الأمر. لعينات حساسة pH منخفضة بشكل خاص، قد تكون البقع تنغستات أو موليبدات أنيونى أكثر فعالية. على الرغم من أن قد تم العثور على هذه البقع للحث على تشكيل التحف في بعض الحالات، مثل تشكيل رولو في البروتين الدهني عينات20. مرة أخرى، درجة الحموضة من وصمة عار قد تحتاج إلى تعديل، هذه المرة إلى أعلى نقطة isoelectric العينة، للحيلولة دون تلطيخ إيجابية.
غسيل العينة قبل تلطيخ قد تكون ضرورية إذا كان المخزن المؤقت الذي يحتفظ فيه العينة مكون الملح أو الفوسفات عالية. في كثير من الحالات، يمكن إجراء الغسيل بالماء عالي النقاوة ولكن لعينات أكثر حساسية، والتي قد تؤدي إلى تدهور أو تغيرات هيكلية عندما تتعرض للمياه وحدها، قد تحتاج الغسيل المراد تنفيذها مع عازلة متقلبة منخفضة القوة الأيونية8. حتى في ظل ظروف خاضعة للرقابة بعناية، يمكن أن تؤدي بعض إعادة ترتيب الهيكلية على سطح الكربون21الغسيل.
الأسلوب الذي يتم إعداد شبكة من حيث عينة الامتزاز، النشاف وتلطيخ يمكن أن تؤثر أيضا كثيرا ما يلاحظ. الأسلوب الأكثر ملاءمة هو هكذا، مرة أخرى، الغاية عينة تعتمد. ج-البروتين، على سبيل المثال، لوحظ كبنية تشبه خاتم كروي بعد تلطيخ الجانب-وصمة عار، ولكن يبدو أن ذلك قطعة أثرية من عملية المصبوغة، كما كشفت عندما يتم إعداد الشبكات بأسلوب عبها (أو بطريقة التفريغ السريع) (رقم 3 ). في أساليب التنظيف عبها والسريع، الوقت العينة يجب أن تتفاعل مع الكربون هو السطح التأييد قبل تثبيت مصغر15. أيضا تجارب العينة قوات أقل من غضروف انحسار عليها النشاف قبل التثبيت. وهذا يعني أن التغييرات الهيكلية في العينة التي يمكن أن تحدث عند وقت امتصاص المطول على الفيلم الكربون أو من خلال عمل الشعرية إلى أدنى حد. يمكن أيضا استخدام أسلوب التفريغ السريع لحل وقت تحليل عينات. العينة يمكن أن تكون مختلطة مع يجند أو كمادة مضافة في تلميح ماصة لمجموعة فترة من الوقت قبل تقديم الطلب إلى شبكة أو لحظات فقط على سطح الشبكة قبل التثبيت داخل ميلي ثانية.
عمق وصمة عار المطلوبة لتوفير صور الأمثل لنموذج معين هو مرة أخرى تعتمد نموذج2. إذا كان وصمة عار ضحلة جداً، يمكن أن تتلف الجزيئات بشعاع الإلكترون ولكن إذا كان وصمة عار سميكة جداً السمات الهيكلية يمكن أن تضيع. ويتأثر بعوامل متعددة مثل هيدروفيليسيتي على سطح الشبكة، سيفيد طبقة الكربون، ومقدار وصمة عار المطبقة على الشبكة، طول الوقت وصمة عار على اتصال بالشبكة قبل النشاف، مدى النشاف والوقت تا عمق وصمة عار kes للشبكة ليجف تماما. شبكة لن يكون توزيعاً حتى وصمة عار في مجملها وذلك مجالات الشبكة المناسبة لتصوير يتم اختيارها بعناية. وفي الواقع، الشبكات كثيرا ما تختلف في الجودة حتى عندما أعدت في نفس اليوم نفس الظروف. مثال جيد لكيفية تأثير الاختلاف في عمق وصمة عار على مظهر الجزيئات وعمق وصمة عار مناسبة لتصوير يتم توفيرها من قبل برجس وآخرون5.
على الرغم من سلبية المصبوغة بطريقة مرنة وسريعة وبسيطة جداً، العينات البيولوجية ليست كلها قابلة للتصور بهذا الأسلوب. يمكن طي تجميعات هشة أو تفكيكه على الامتزاز، تلطيخ أو التجفيف على الشبكة م22. تلطيخ السلبية يمكن أيضا يؤدي إلى تسطيح الجزيئات والحث على توجهات المفضل من جزيئات الكربون دعم الفيلم7.
وصمة سلبية أداة قيمة لتقييم العينات في حد ذاتها، وأيضا قبل التحليل م البرد ولكن العديد من القوى المادية العينة واجه خلال العملية تكون غير مفهومة. ولذلك، أفضل نهج لاستخدام هو عينة تعتمد درجة عالية ويجب أن تتقرر بالتجربة والخطأ بدلاً من درس بعد بروتوكول ثابت.

على الرغم من الاهتمام مؤخرا بالقرار وصمة الثورة الناتجة عن تحقيق تقدم كبير في البرد-الإلكترون المجهر1 (cryo-م)، سلبية تبقى م تقنية قوية وعنصرا حاسما في مربع الأدوات إلكترون ميكروسكوبيستس. تلطيخ السلبية لا تزال أفضل طريقة للتقييم السريع من عينة قبل تحسين ظروف الشبكة cryo-2. التباين العالي وسرعة إعداد الشبكة من عينات الملون السلبية يجعلها مثالية لتقييم نقاوة العينة وتركيز وعدم التجانس والمرونة كونفورماشونال3. قد أدت إلى العديد من الهياكل الإعلامية بيولوجيا من إعادة البناء وصمة سلبية، على الرغم من قرار هذه التقنية تقتصر على ~ 18 Å القرار4،،من56، وتحقق نتائج أفضل من بعض العينات في وصمة عار من البرد-م لمجموعة متنوعة من الأسباب7.
في وصمة سلبية م، تمتز فوق سطح شبكة م الجسيمات ذات الاهتمام ويلفها بمصفوفة غير متبلور من مجمع إلكترون وصمة عار كثيفة. ويتم إنتاج عالي تباين نسبي بين الخلفية والجسيمات ذات الاهتمام، مع الجسيمات يجري الإلكترون أقل كثافة من وصمة عار المحيطة بها8. تظهر الجسيمات كالمناطق الخفيفة بسبب قوتها ونثر إلكترون منخفضة مقارنة بوصمة عار المحيطة الكثيفة، التي تنتشر الإلكترونات أكثر، ويبدو أكثر قتامة. ميزات سوبستروكتورال من الجسيمات يمكن استخلاصه من دراسة مفصلة للصور الناتجة كوصمة عار سوف تخترق أي شق وتنتج التباين غير النظامية من التفصيل9.
تبدأ عملية المصبوغة السلبية مع إعداد الدعم الركيزة التي يتم التقاطها بالجسيمات العينة، والطبقة من وصمة عار المجففة أيد. الركيزة الدعم الأكثر استخداماً طبقة من الكربون غير متبلور، تدعمها أحياناً طبقة رقيقة من البولي فينيل (مثل فورمفار) أو النيتروسليلوز (مثلاً الكولوديون) البوليمر. ركائز هذه يمكن شراؤها تجارياً أو إعداد داخلية باستخدام البروتوكولات المبينة أدناه.
بعد إعداد الركيزة الدعم، يمكن تطبيقها العينة، ومسح الحل الزائدة قبالة. ينبغي وقف عينات في المخزن مؤقت مناسبة لتلطيخ السلبية. فمن الأفضل تجنب استخدام المخزن المؤقت للفوسفات وارتفاع تركيزات الملح، التي يمكن أن تؤدي إلى رواسب البلورية التي يمكن أن تحجب العينة. ينبغي أيضا تجنب عوامل تخفيض المنظفات، السكروز، والغليسيرول وتركيزات عالية من النوكليوتيدات كما أنها تؤثر أيضا على وصمة عار الجودة4. عندما لا يمكن تغيير تكوين المخزن المؤقت، الغسيل على سطح الشبكة م مع الماء أو قد يقلل من المخزن مؤقت أكثر ملاءمة بعد الامتزاز وقبل تلوين التشكيل من المخزن المؤقت المتعلقة بالتحف وعموما تحسين الخلفية وصمة عار. إذا كان يشتبه في المخزن المؤقت للأعمال الفنية، يمكن أن تكون مفيدة وصمة عار شبكة المخزن المؤقت فقط تحديد ما إذا كانت مكونات المخزن المؤقت المصدر من القطع الأثرية الملحوظة.
بعد العينة تمتز، ومسح وغسلها إذا لزم الأمر، يتم تطبيق كاشف المصبوغة. تم العثور على مجموعة متنوعة من المواد الكاشفة لتكون فعالة البقع السلبية (الجدول 1)، ولكن يجب اختيار وصمة عار لتناسب العينة. واتهم 'هالة' أشكال وصمة عار حول الجسيمات بسبب تشريد الجزيئات وصمة عار بمنطقتي مسعور للبروتين والنفور من المجموعات. ولذلك، يجب اختيار وصمة عار حتى أن الدولة بروتونيشن لأي مجموعات مشحونة المحتملة على البروتين هو نفسه كوصمة عار على درجة الحموضة العامل. مقابل رسوم على سطح البروتين يمكن أن تسهم تلطيخ إيجابية التأثير، الذي على الرغم من أن تقنية مفيدة في جانبها الأيسر10 ليست في نطاق هذه الورقة. الكواشف المصبوغة السلبية الأكثر استخداماً هي خلات اليورانيل وفورمات اليورانيل. هذه البقع لها حجم الحبوب جيد نسبيا (4-5)9 وتقديم الصور دقة أعلى على البقع الأخرى مثل موليبدات أمونيوم11,9،والرمات-تونجستاتيس (8-9 حجم الحبوب)11وبعض على أساس لانثانيدات البقع12. خلات اليورانيل وفورمات بمثابة كما مثبت، الحفاظ على العديد من تفاعلات البروتين البروتين على مقياس ميلي ثانية الساعة13، على الرغم من أن درجة الحموضة منخفضة من وصمة عار وميلها التعجيل في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي قد تكون ضارة لبعض العينات14 . وعلى الرغم من فائدتها، أملاح اليورانيل أيضا تحديات لوجستية كما أنها هي السامة والمشعة أقل ما يقال، سواء التي يمكن أن تتطلب معالجة خاصة، تخزين، ومتطلبات التخلص منها، الأمر الذي يؤدي بعض المستخدمين للبحث عن بدائل غير المشعة.
وهناك مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأساليب الموصوفة لإعداد الركازة، نموذج التطبيق، وتلطيخ شبكات م. الأسلوب الأكثر ملاءمة لاستخدام العينة يتوقف ويكون من الصعب التأكد من عند التصدي لنظام جديد. ويصف هذه المخطوطة طريقتين لإعداد سفلية وثلاثة أساليب النشاف؛ الجانب النشاف و عبها5والسريع بيغ15. النشاف الجانب هو أبسط الأساليب المذكورة. الأسلوب عبها وأسلوب التفريغ السريع أكثر صعوبة لتنفيذ ولكن الحد من وقت الاتصال العينة مع الفيلم الدعم قبل التثبيت وقد ثبت أن تحسين تشكيل التحف وصمة عار لبعض العينات5. والهدف من هذه المخطوطة وبالتالي توفير سير عمل أولية للتصدي للتصور من تحديا لنظم م وصمة سلبية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 mesh copper EM grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776-1VL</td>
			<td>Other materials and/or mesh sizes can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon evaporator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>9620</td>
			<td>Cressington 208 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collodion solution 2% in amyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 negative pressure tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501202</td>
			<td>Or other tweezers as preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erbium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadolinium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Sheets. 75x25x0.15mm.</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, white frosted</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12607976</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10018130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10343663</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11904325</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td>Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samarium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphotungstate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size).</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4&#34; rods</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>57-10</td>
			<td>Or equivalent for carbon evaporator used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12719406</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 Filter paper.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #40 filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10674122</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems

يسمح الميكروسكوب الإلكتروني وصمة سلبية (م) مراقبة بسيطة وسريعة نسبيا للجزيئات الكبيرة والجزيئات المجمعات من خلال استخدام التباين تعزيز كاشف وصمة عار. أن كانت محدودة في القرار بحد أقصى 20 ~ 18، وصمة سلبية م مفيدة لمجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية ويوفر أيضا وسيلة سريعة لتقييم العينات للمجهر الإلكتروني cryo (cryo-م). سير العمل وصمة سلبية أسلوب مباشر؛ العينة هي تمتز فوق ركيزة، ثم تطبيق وصمة عار ومسح والمجففة لإنتاج طبقة رقيقة من إلكترون الكثيفة التي يتضمنها الجسيمات وصمة عار. ومع ذلك، يمكن، تتصرف العينات الفردية بطرق تختلف اختلافاً كبيرا باختلاف ظروف المصبوغة. وادي ذلك إلى وضع مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات إعداد الركازة، سلبية يلطخ الكواشف، وشبكة للغسيل والتقنيات النشاف. تحديد الأسلوب الأنسب لكل عينة الفردية يجب أن يتم على أساس حالة بحالة وميكروسكوبيست يجب أن يكون لديك إمكانية الوصول إلى مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة لتحقيق النتائج وصمة سلبية أعلى مستوى من الجودة. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لأساليب إعداد سفلية مختلفة اثنين وثلاثة أساليب مختلفة النشاف، ويظهر مثال لنموذج الذي يظهر نتائج تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للطريقة المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف إعداد بعض الكواشف المصبوغة السلبية الشائعة، وهما رواية البقع لانثانيدات القائم، مع المناقشة المتعلقة بالاستخدام كل.

جميع الكواشف المصبوغة اختبار إنتاجها تلطيخ سلبيا إلى حد ما، مع الجبهة المتحدة تسفر عن العينات مع تباين أكبر وجسيمات أكبر، وأكثرها تفصيلاً. للبقع لانثانيدات على أساس عينات متأصلة (الشكل 1) ErAc و TmAc أنتجت تلطيخ السلبية ذات جودة مكافئة لتعميم الوصول إلى الخدمات، كما يحكم بالتباين الواضح والحدة من الجسيمات الملون، مع TmAc تنتج أكثر وضوحاً، صوراً واضحة أكثر من ErAc. على الرغم من أن حجم الحبوب أكبر من TmAc يصبح واضحا في عالية التكبير، عندما كانت ملطخة جسيمات "فيروس تبرقش التبغ" (TMV) مع % 1 كرر TmAc ~ 23 Å الجسيمات تمف17 لا تزال واضحة للعيان بالعين، وكذلك خط طبقة ميريديونال في تحويل فورييه من الصورة الخام. أيا من غيرها لانثانيدات البقع اختبارها، ErAc أو الألغام أو GdAc، كانت قادرة على حل هذه الميزة. المتوسطات فئة تم إنشاؤها بواسطة استخراج شرائح متداخلة من جسيمات تمف حيث كان تكرار حلزونية مرئية. القطع المستخرجة ثم تتمشى وتصنيف استخدام ريليون18 لتصور أفضل ميزة الدوري (الشكل 2).
بعض العينات حساسة بشكل خاص إلى أسلوب التلوين، مثل العضلات المستمدة من البروتين ج. ج-البروتين، الذي يتكون من سلسلة مرنة للمفتش العام ومجالات مثل الجبهة الوطنية، تنتج صوراً مختلفة اختلافاً كبيرا حسب م وصمة سلبية تعتمد على الطريقة المستخدمة المصبوغة (الشكل 3). عند استخدام الأسلوب النشاف الجانب، انهارت الهياكل الشبيهة بخاتم لوحظت، بينما عندما ملطخة بالتنظيف السريع أو التحريك أساليب، ج-البروتين يلاحظ كسلسلة من المجالات التي تشبه الخرز في سلسلة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>تركيز</td>
			<td>الأس الهيدروجيني</td>
			<td>نوع</td>
		</tr>
<tr>
<td>موليبدات أمونيوم</td>
			<td>1-2%</td>
			<td>5 – 7</td>
			<td>أنيونى</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلات الاربيوم (ErAc)</td>
			<td>1-2%</td>
			<td>6</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلات الجادولينيوم (GdAc)</td>
			<td>1-2%</td>
			<td>6</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
<tr>
<td>تنغستات ميثيلاميني</td>
			<td>2%</td>
			<td>6 – 7</td>
			<td>أنيونى</td>
		</tr>
<tr>
<td>ساماريوم ثلاثي اسيتات (الألغام)</td>
			<td>1%</td>
			<td>6</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
<tr>
<td>سيليكوتونجستاتي الصوديوم</td>
			<td>1-5%</td>
			<td>5 – 8</td>
			<td>أنيونى</td>
		</tr>
<tr>
<td>فوسفوتونجستاتي الصوديوم</td>
			<td>1-3%</td>
			<td>5 – 8</td>
			<td>أنيونى</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلات ثوليوم (TmAc)</td>
			<td>1-2%</td>
			<td>6</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
<tr>
<td>خلات اليورانيل (UA)</td>
			<td>1 – 3%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
<tr>
<td>فورمات اليورانيل (الجبهة المتحدة)</td>
			<td>0.75 – 1%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>الأيوني</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: بعض المشتركة السلبية المصبوغة الكواشف.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig1.jpg"> رقم 1: ميكروجرافس مثال لفيروس تبرقش التبغ ملطخة بمختلف وصمة سلبية الكواشف 1% (أ) الجبهة المتحدة TmAc 2.5% (ب) (ج) ErAc 2.5%. (د) 1% تعميم الوصول إلى الخدمات (ه) 2.5% GdAc ( و) و) 2.5% الألغام. أشرطة مقياس من 100 نانومتر. صور الممثل من replicates متعددة مع مناطق متعددة تصويرها كل تكرار. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig2.jpg"> رقم 2: تلطيخ فيروس تبرقش التبغ مع خلات ثوليوم (أ) الملون التكبير عالية للمنطقة من صورة مجهرية تمف مع 1% TmAc. هو مقياس بار 20 نانومتر. (ب) فئة المتوسط المستخرجة تمف شرائح. (ج) تحويل فورييه للصورة في لوحة بإظهار طبقة خط تأملات في ~ 23. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig3.jpg"> الشكل 3: آثار النشاف الأسلوب في المطابقة للبروتين ج. (أ) ج-البروتين ملطخة بتعميم الوصول إلى الخدمات باستخدام الأسلوب وصمة عار من جانب وأسلوب عبها (ب) . شريط مقياس اللوحة العلوية هو 50 نانومتر، شريط مقياس لوحة أقل من 20 نانومتر. صور الممثل من replicates متعددة مع مناطق متعددة تصويرها كل تكرار. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems at JoVE.com

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

السلبية وصمة عار م تقنية قوية لتصور هيكل الجزيئات، ولكن يمكن أن تنتج تقنيات المصبوغة مختلفة نتائج متفاوتة بطريقة تعتمد عينة. هنا عدة نهج المصبوغة السلبية موصوفة بالتفصيل لتوفير سير عمل أولية للتصدي لتصور أنظمة صعبة.

تنويعات على سلبية وصمة عار أساليب الميكروسكوب الإلكتروني: أدوات للتصدي لتحدي الأنظمة

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

الكهروكيميائية "الكشف من الديوتريوم الحركية النظائر تأثير النقل الإلكترون خارج الخلية" في أونيدينسيس شيوانيلا السيد-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

تحضير العينة للتصوير بالتبريد في الموقع لخلايا الثدييات

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...