Name: variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems
Uploaded: 2018-02-06T14:45:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems at JoVE.com

. אנחנו מאוד אסירי תודה. אל פיטר פרש על דיונים מועילים, סקירה ביקורתית של כתב היד. ברצוננו להודות לכל חברי צוות המעבדה Biostructure אסטבורי לדיונים מועיל ולמעבדות של ניל Ranson, של סטיבן Muench. עבודה זו מומן על ידי המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/2007-2013) / ERC להעניק הסכם 322408. C-חלבון הופק באמצעות המשאבים המסופקים על ידי מענק קרן לב (BHF פ ג/13/83/30485). אנו מודים גם טרסט עבור ציוד מימון לתמוך מיקרוסקופ אלקטרונים בלידס (090932/Z/09/Z ו- 094232/Z/10/Z). CS ממומן על ידי מענק Wellcome אמון ISSF.

<ol>
	<li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Cryo-EM+Resolution+Barriers+to+Facilitate+Drug+Discovery.">Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li><li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM.">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Ha, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+complete+COG+tethering+complex.">Molecular architecture of the complete COG tethering complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).</li><li>Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+negative+stain+and+single-particle+image+processing+to+explore+dynamic+properties+of+flexible+macromolecules.">Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules.</a> J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).</li><li>Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative-stain+single+particle+EM+of+the+maltose+transporter+in+nanodiscs+reveals+asymmetric+closure+of+MalK2+and+catalytic+roles+of+ATP,+MalE+and+maltose.">Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy+for+apoE4+POPC+lipoprotein.">An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein.</a> J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).</li><li>Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy. 2, 101-147 (1972).</li><li>Massover, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+staining+of+protein+molecules+for+electron+microscopy:+polyiodination+of+the+apoferritin+shell+in+ferritin.">Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin.</a> Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).</li><li>Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Developments+in+Negative+Staining+for+Transmission+Electron+Microscopy.">Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy.</a> Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).</li><li>Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+lanthanide+salts+as+alternative+stains+to+uranyl+acetate.">Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate.</a> Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).</li><li>Zhao, F., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).</li><li>Cao, B., Xu, H., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+to+image+bioinorganic+nanohybrids:+the+case+of+phage-gold+nanocomposites.">Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites.</a> Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).</li><li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+shows+superposition+and+large+scale+flexibility+within+cytoplasmic+dynein+motors+moving+along+microtubules.">Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules.</a> Nat Commun. 6, 8179 (2015).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+from+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li><li>Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+determination+of+the+helical+repeat+of+tobacco+mosaic+virus.">Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus.</a> Virology. 369 (1), 226-227 (2007).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination.">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).</li><li>Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Has+negative+staining+still+a+place+in+biomacromolecular+electron+microscopy?.">Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy?.</a> Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).</li><li>Garewal, M., Zhang, L., Ren, G., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols). 974, 111-118 (2012).</li><li>Walker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-headed+binding+of+a+processive+myosin+to+F-actin.">Two-headed binding of a processive myosin to F-actin.</a> Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).</li><li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Analysis+of+Macromolecular+Assemblies+by+Electron+Microscopy.">Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy.</a> Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כתב יד זה מתאר שיטות מרובות עבור צביעת שלילי של דגימות של מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מגוון של צביעת ריאגנטים, כולל שני ריאגנטים לנתניד הרומן (TmAc ו- ErAc). רבים מן השלבים של תהליך צביעת שלילי חייב להיות אופטימיזציה עבור דוגמאות בודדות כולל הבחירה של הכתם, כמות כביסה הנדרשים, אם בכלל, הטכניקה blotting. כתב יד זה ובכך מספק בסיס microscopists לפתח זרימות עבודה משלהם להתמודדות עם השלילי-צביעה של מערכות מאתגר.
הבחירה של כתם היא מאוד לטעום התלויים. דגימות צמחים רגישים במיוחד pH נמוך עשוי להיות מושפל UA ו/או UF, למרות המאפיינים לשבועיים של אלה כתמי19. במקרים אלה, לנתניד מבוסס כתמים כגון TmAc או ErAc עשוי להיות מתאים יותר, למרות רמת ה-pH הכללי של התכשיר חייב להישמר מתחת נקודה איזואלקטרית של החלבון לדוגמה כדי לסייע במניעת מכתים חיובי. זה יכול להתבצע על ידי acidifying את הכתם עם חומצה אצטית במידת הצורך. לקבלת דוגמאות רגיש pH נמוך במיוחד, כתמים tungstate או molybdate anionic עשוי להיות יעיל יותר. למרות הכתמים האלה נמצאו כדי לגרום להיווצרות חפצים במקרים מסוימים, כגון היווצרות של rouleaux ב ליפופרוטאין דוגם20. שוב, אולי ה-pH של הכתם צריכים להיות מותאמים, הפעם כדי מעל נקודה איזואלקטרית של המדגם, כדי למנוע כתמים חיובי.
כביסה של המדגם לפני צביעת עשוי להיות נחוץ אם המאגר שבו נשמר את הדגימה יש רכיב גבוה של מלח או פוספט. במקרים רבים, כביסה יכול להתבצע עם הנדסה גנטית מים אך עבור דגימות יותר רגישים, אשר עשוי לפגוע או עוברים שינויים מבניים כאשר הם נחשפים מים לבד, כביסה יתכן שיהיה צורך לבצע עם מאגר הנפיצה של עוצמת יוניים נמוכה8. אפילו בתנאים מבוקרים בקפידה, כביסה יכול לגרום כמה מבניים סידורם מחדש על פני השטח פחמן21.
השיטה שבאמצעותה רשת מוכן מבחינת מדגם ספיחה, סופג, צביעת יכול גם להשפיע באופן משמעותי על תצפית. השיטה המתאימה ביותר היא לכן, שוב, מאוד לטעום התלויים. C-חלבון, לדוגמה, הוא ציין כאל מבנה טבעתי הכדוריים בעקבות צד-כתם מכתים, אבל נראה לי חפץ של תהליך צביעת, כפי גילה כאשר רשתות מוכנות בשיטת יתנגש (או בשיטת שטיפה מהירה) (איור 3 ). בשיטות יתנגש ומהירה שטיפה, הזמן שהדגימה יש לקיים אינטראקציה עם הפחמן תמיכה השטח לפני קיבוע הוא ממוזער15. המדגם גם חוויות פחות כוחות מ מניסקוס נסוגים על סופג לפני קיבוע. משמעות הדבר היא כי ביצוע שינויים מבניים הדגימה שעלולות להתרחש בעת הקליטה ממושך זמן על הסרט פחמן או דרך פעולה נימי הן מזעריות. השיטה שטיפה מהירה יכולה לשמש גם לניתוח זמן לפתור של דגימות. המדגם ניתן לערבב עם ליגנד או כתוסף בתוך טיפ פיפטה ערכה תקופה של זמן לפני יישום רשת או רק באופן זמני על פני הרשת לפני קיבוע בתוך אלפיות השנייה.
העומק של כתם הנדרשים לאספקת תמונות אופטימלית של הדגימה מסוים הוא שוב תלוי מדגם2. אם הכתם הוא רדוד מדי, מולקולות עלולים להיפגע על ידי כשקרן האלקטרונים אבל אם הכתם סמיך מדי תכונות מבניות יכול ללכת לאיבוד. עומק הכתם מושפע על ידי גורמים רבים כגון hydrophilicity של פני השטח רשת, שויון של השכבה פחמן, הסכום של כתם חלה על הרשת, משך הזמן הכתם נמצא בקשר עם הרשת לפני סופג, היקף סופג והפעם זה טא kes עבור הרשת כדי יבש לחלוטין. רשת שלעולם לא יהיה ריפודי כתופיים של כתם על פני כולו, לכן אזורים של הרשת המתאים עבור הדמיה צריך לבחור בקפידה. אכן, רשתות להשתנות לעיתים קרובות איכות גם כאשר מוכן באותו יום תחת באותם התנאים. דוגמא טובה איך בו וריאציה לעומק הכתם משפיע על המראה של מולקולות ואת עומק הכתם המתאים עבור הדמיה ניתנת על ידי ברג'ס ואח5.
למרות שלילי מכתימים שיטה מאוד תכליתי מהירה, פשוטה, לא כל דגימות ביולוגיות נתונות ויזואליזציה בשיטה זו. הרכבות שביר יכול לכווץ או לפרק על ספיחה, מכתים או ייבוש על רשת EM22. צביעת שלילי יכול גם להוביל שיטוח של מולקולות, זירוז אוריינטציות המועדפת של מולקולות על הסרט תמיכה7פחמן.
כתם שלילי הוא כלי רב ערך עבור הערכה של דגימות בזכות עצמו, וגם לפני ניתוח הקפאה-EM אבל רבים של כוחות פיזיים שהמדגם מפגשים במהלך התהליך הם הבינו. לכן, הגישה הטובה ביותר לשימוש היא מאוד לטעום התלויים, צריכה להיקבע על ידי משפט--שגיאה ולא לימדתי בעקבות פרוטוקול קבוע.

למרות תשומת לב לאחרונה הרזולוציה המהפכה הנובע התקדמות משמעותית הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ1 (הקפאה-EM), שלילית כתם EM שרידים טכניקה חזקה והוא מרכיב חיוני של ארגז הכלים של אלקטרון microscopists. צביעת שלילי נותרה השיטה הטובה ביותר עבור הערכה מהירה של מדגם לפני מיטוב תנאי הקפאה-רשת2. חדות גבוהה ואת המהירות של רשת הכנת דוגמאות מוכתם שלילי הופך אותו לאידיאלי עבור הערכת מדגם טוהר, ריכוז, הטרוגניות, גמישות הסתגלותי3. מבנים רבים ביולוגית אינפורמטיבי נבעה שחזורים כתם שלילי, למרות הרזולוציה של הטכניקה מצטמצם ~ 18 Å רזולוציה4,5,6, ו כמה דגימות להניב תוצאות טובות יותר בכתם הקפאה-EM עבור מגוון רחב של סיבות7.
בכתם שלילי EM, החלקיק עניין הספוחה על פני רשת EM, עטוף בקליפה מטריקס אמורפי של אלקטרון כתם צפופה המורכבת. ניגוד היחסית גבוהה המיוצר בין הרקע לבין החלקיק מעניינים, עם החלקיק להיות אלקטרונים פחות צפוף מאשר הכתם שמסביב8. החלקיקים מופיעים אזורים בהירים בגלל כוחם פיזור האלקטרונים נמוכה יחסית הכתם שמסביב צפופה, אשר מחליקי האלקטרונים יותר נראית כהה. תכונות substructural של חלקיקים יכול להסיק מכל בחינה מפורטת של תמונות תוצאות כמו כתם לחדור לתוך הבקיע בכל ולייצר את הניגודיות לא סדירה פרט9.
מתחיל תהליך צביעת שלילי עם הכנת מצע תמיכה בו החלקיקים מדגם נלכדים, השכבה של הכתם מיובשים נתמך. המצע התמיכה הנפוצות ביותר היא שכבה של פחמן אמורפי, לפעמים נתמך על ידי שכבה דקה של פוליוויניל (למשל Formvar) או פולימר ניטרוצלולוזה (למשל Collodion). מצעים אלה ניתן לרכוש מסחרית או מוכן ללא צורך במיקור חוץ באמצעות פרוטוקולים המתוארים להלן.
לאחר המצע תמיכה מוכן, ניתן להחיל את הדגימה, הפתרון עודף מחק את. דוגמאות המחבוש במאגר מתאים עבור מכתים שלילי. עדיף למנוע השימוש של מאגר פוספט, ריכוז המלח גבוה, אשר יכולים להצמיח פוחת משקעים גבישיים זה ניתן להסתיר את הדגימה. צמצום סוכנים, דטרגנטים, סוכרוז, גליצרול, ריכוזים גבוהים של נוקלאוטיד יש גם להימנע ככל הם גם משפיעים על איכות הכתם4. כאשר הרכב המאגר לא ניתן לשנות, שטיפת המשטח של הרשת EM עם מים או מאגר מתאים יותר לאחר ספיחה, לפני צביעת עשוי להפחית את היווצרות של מאגר הקשורים חפצים ולשפר באופן כללי על רקע הכתם. אם מאגר חפצים חשודים, זה יכול להיות אינפורמטיבי כתם רשת מאגר בלבד כדי לקבוע אם הרכיבים מאגר הם המקור של הממצאים שנצפו.
לאחר המדגם הספוחה, מחק ואני שטפתי במידת הצורך, ריאגנט מכתימים מוחל. מגוון רחב של ריאגנטים נמצאו להיות כתמים שליליים יעיל (טבלה 1), אבל הכתם להיבחר כדי להתאים את הדגימה. 'הילה' של הכתם צורות סביב החלקיק בשל שני העקירה של מולקולות כתם על ידי האזורים הידרופוביות של חלבונים ודחיה מאת טעונה קבוצות. לכן, הכתם להיבחר כך המדינה פרוטונציה של כל קבוצות טעונות פוטנציאליים על החלבון היא זהה לזו של הכתם על ה-pH עבודה. מול האשמות על פני השטח של החלבון יכול לתרום מכתים חיובית השפעה, אשר למרות טכניקה שימושית משלו נכון10 אינו בתוך הטווח של מאמר זה. ריאגנטים מכתימים שליליות הנפוצות ביותר הן uranyl אצטט uranyl formate. הכתמים האלה יש גודל גרעין קטן יחסית (4-5 Å)9 לספק תמונות ברזולוציה גבוהה מעל כתמים אחרים כגון פוספו-טונגסטטים (8-9 גודל גרגר Å)9,11, אמוניום molybdate11, וחלק מבוסס לנתניד כתמי12. Uranyl אצטט, formate משמשים גם מקבע, שמירה על אינטראקציות חלבון-חלבון רבים ב מילי-שניות זמן בקנה מידה13, למרות ה-pH נמוך של הכתם, הנטייה שלו, כדי לזרז ב- pH פיזיולוגיים. עלולים לפגום דגימות14 . למרות השירות שלהם, המלחים uranyl מציגים גם אתגרים לוגיסטיים כפי שהם הם רעילים והן רדיואקטיבי במתינות, אשר עשויים לדרוש טיפול מיוחד, אחסון, ודרישות לרשות, אשר מוביל חלק מהמשתמשים לחפש חלופות לא רדיואקטיבי.
יש מגוון גדול של שיטות המתואר לשם הכנת הרקע, דוגמת יישום, ו מכתים של רשתות EM. השיטה המתאימה ביותר לשימוש מדגם תלויות, יכולים להיות קשה לאמת כאשר בהתמודדות עם מערכת חדשה. כתב יד זה מתאר שתי שיטות של הכנת הרקע ואת שלוש שיטות סופג; בצד סופג, יתנגש5ורפיד שטיפה15. סופג צד הוא הפשוט ביותר של שיטות המתוארות. השיטה יתנגש והן בשיטת שטיפה מהירה קשים יותר ליישם אבל להגביל את משך הזמן קשר המדגם עם הסרט תמיכה לפני קיבוע, הוכחו להפחיתם להיווצרות כתם, פריטים כמה דוגמאות5. המטרה של כתב יד זה היא לפיכך לספק זרימת עבודה ראשונית עבור בהתמודדות עם הפריט החזותי של מערכות מאתגר על ידי EM שלילית-כתם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>200 mesh copper EM grids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4776-1VL</td>
			<td>Other materials and/or mesh sizes can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Molybdate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon evaporator</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>9620</td>
			<td>Cressington 208 or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collodion solution 2% in amyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 negative pressure tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501202</td>
			<td>Or other tweezers as preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erbium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadolinium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica Sheets. 75x25x0.15mm.</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG250-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, white frosted</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12607976</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10018130</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (glass)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10343663</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11904325</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandpaper</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td>Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samarium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>325872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.06462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphotungstate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size).</td>
			<td>AGAR Scientific</td>
			<td>AGG252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>367702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4&#34; rods</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>57-10</td>
			<td>Or equivalent for carbon evaporator used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Formate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12719406</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 Filter paper.</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #40 filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10674122</td>
			<td>Or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

variations on negative stain electron microscopy methods: tools for tackling challenging systems

מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי (EM) מאפשר התבוננות פשוטה ומהירה יחסית של מקרומולקולות, מתחמי macromolecular באמצעות הניגוד שיפור ריאגנט הכתם. ולמרות שהוא מוגבל מבחינה ברזולוציה מקסימלית של ~ 18-20, כתם שלילי EM שימושי למגוון רחב של בעיות ביולוגיות ומספק גם אמצעי מהיר של הערכת דגימות של הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM). כתם שלילי זרימת העבודה היא שיטה פשוטה; הספוחה היא הדגימה על גבי מצע, ואז כתם הוא מוחל, מחק, מיובשים כדי לייצר שכבה דקה של אלקטרון כתם צפוף שבו מוטמעים החלקיקים. דוגמאות בודדות יכול, לעומת זאת, להתנהג בדרכים שונות במידה ניכרת תחת משתנים התנאים מוכתמים. זה הוביל לפיתוח מגוון רחב של טכניקות להכנת מצע, שלילי מכתים ריאגנטים, ורשת כביסה החיוורים ומכתים טכניקות. קביעת השיטה המתאימה ביותר עבור כל דגימה בודדת צריך להיעשות על בסיס מקרה לגופו, microscopist חייבת להיות לך גישה למגוון רחב של טכניקות שונות כדי להשיג את התוצאות כתם שלילי האיכותי. פרוטוקולים מפורט עבור שתי שיטות הכנה של סובסטרט שונים, שלוש טכניקות שונות סופג הינם מסופקים, ושיחות דוגמה מדגם המציג תוצאות שונה במידה ניכרת בהתאם שיטת מוצג. בנוסף, הכנת כמה נפוץ ריאגנטים מכתימים שלילי, שני חדשניים מבוססי לנתניד כתמים, מתואר עם דיון בנוגע לשימוש של כל אחד.

כל ריאגנטים מכתימים נבדק הפיק מכתים שלילי במידה מסוימת, עם UF מניב את הדגימות עם הניגוד הגדול בין חלקיקים החדה, מפורט ביותר. עבור דוגמאות מוטבעות עמוק (איור 1) לנתניד מבוסס כתמים ErAc ו- TmAc המיוצר מכתים שלילי של איכות שוות ערך ל UA כפי שפטו את חדות לעין וחדות של החלקיקים מוכתם, עם TmAc בהפקת ברורה, תמונות חדות יותר יותר ErAc. למרות גודל גרגרים גדולים יותר TmAc הופך לכאורה בהגדלה גדולה, כאשר חלקיקי נגיף פסיפס הטבק (TMV) היו מוכתמים 1% TmAc ~ 23 Å חוזר של החלקיק TMV17 , עדיין היה נראה בבירור בעין וכן שכבת meridional שורה ב- התמרת פורייה של תמונת raw. אף אחד השני לנתניד הכתמים נבדק, ErAc, SmAc, או GdAc, הצליחו לפתור תכונה זו. מחלקה ממוצעים נוצרו על-ידי חילוץ מקטעים חופפים חלקיקים TMV איפה חזור לוליינית היה גלוי. הקטעים שחולצו היו ואז מיושר, מסווג באמצעות RELION18 משופרת בתכונת תקופתי (איור 2).
כמה דוגמאות הן רגיש במיוחד לשיטת מכתים, כגון השריר נגזר C-חלבון. C-חלבון, אשר מורכב של מחרוזת גמיש Ig ותחומים כמו Fn, מייצרת תמונות שונות באופן משמעותי על ידי EM שלילית-כתם תלויה בשיטה של צביעת בשימוש (איור 3). באמצעות השיטה צד-סופג, התמוטט מבנים דמויי טבעת שנצפו, ואילו כשהוא מוכתם על ידי שטיפה מהירה או מצליף שיטות, חלבון C נצפית כסדרה של תחומים הדומות חרוזים על חוט.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>ה-pH</td>
			<td>סוג</td>
		</tr>
<tr>
<td>אמוניום Molybdate</td>
			<td>1 - 2%</td>
			<td>5 – 7</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>ארביום אצטט (ErAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>אצטט גדוליניום (GdAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tungstate מתילאמין</td>
			<td>2%</td>
			<td>6 – 7</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>סמריום אצטט (SmAC)</td>
			<td>1%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן silicotungstate</td>
			<td>1 – 5%</td>
			<td>5-8</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן phosphotungstate</td>
			<td>1-3%</td>
			<td>5-8</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>תוליום אצטט (TmAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uranyl אצטט (UA)</td>
			<td>1 – 3%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uranyl Formate (UF)</td>
			<td>0.75-1%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: כמה נפוץ שלילי מכתימים ריאגנטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig1.jpg"> איור 1: דוגמה micrographs של נגיף פסיפס הטבק צבעונית עם ריאגנטים כתם שלילי שונים (א) 1% UF (B) TmAc 2.5% (ג) 2.5% ErAc. (ד) 1% UA (E) 2.5% GdAc, (נ) 2.5% SmAc. גודל ברים הם 100 ננומטר. נציג תמונות ושכפול מרובים עם אזורים מרובים עם תמונה לכל שכפול. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig2.jpg"> איור 2: צביעת מוזאיקת הטבק עם אצטט תוליום (א) , בהגדלה של אזור של מיקרוסקופ של TMV, מוכתם של 1% TmAc. סולם בר הוא 20 ננומטר. (B) שיעור ממוצע של מקטעי TMV שחולצו. (ג) התמרת פורייה של התמונה בפאנל A מראה שכבה קו השתקפויות ~ 23 Å. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig3.jpg"> איור 3: השפעות סופג שיטה על קונפורמציה של חלבון C. (א) C-חלבון מוכתם UA באמצעות שיטת חשופה בצד שיטת יתנגש (B) . הפאנל העליון קנה מידה בר הוא 50 ננומטר, המייצג התחתון של סולם לוח ה-20 ננומטר. נציג תמונות ושכפול מרובים עם אזורים מרובים עם תמונה לכל שכפול. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems at JoVE.com

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

כתם שלילי EM היא טכניקה חזקה להמחשת המבנה macromolecular, אבל טכניקות צביעת שונים יכול לייצר תוצאות שונות באופן תלוי מדגם. הנה מספר גישות מכתימים שלילי מתוארים בפירוט כדי לספק זרימת עבודה ראשונית בהתמודדות עם הפריט החזותי של מערכות מאתגר.

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...

Preparation of Electron Microscopy Grids for In Situ Cellular Cryotomography

Sample Preparation for In Situ Cryotomography of Mammalian Cells

Optimizing Grid Preparation for Enhanced Cryoelectron Tomography (Video) | JoVE

הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

In situ cellular cryotomography is a powerful technique for studying complex objects in their native frozen-hydrated cellular context, making it highly ...

Fabrication of Streptavidin Affinity Grids for Cryo-EM Structural Studies

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Author Spotlight: Enhancing Cryo-EM Sample Preparation with Streptavidin-Biotin Approach

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...