Name: quantification of site-specific protein lysine acetylation and succinylation stoichiometry using data-independent acquisition mass spectrometry
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון NIH הלאומית של הסוכרת, העיכול, מחלות כליות NIH-NIDDK תמלא R24 DK085610 (PI: אי Verdin). JGM נתמך על ידי מלגת NIH T32 (T32 AG000266, PI: ג'יי Campisi). המחברים לאשר תמיכה של NIH משותפים גרנט אינסטרומנטציה עבור מערכת TripleTOF 6600 במכון באק (1S10 OD016281, PI: B.W. גיבסון).

<ol>
	<li>Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+landscape+of+lysine+acetylation+links+metabolism+and+cell+signalling.">The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Choudhary, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+acetylation+targets+protein+complexes+and+co-regulates+major+cellular+functions.">Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.</a> Science. 325 (5942), 834-840 (2009).</li><li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Lysine+Acetylation+and+Succinylation+Stoichiometry+in+Proteins+Using+Mass+Spectrometric+Data-Independent+Acquisitions+(SWATH).">Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH).</a> J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).</li><li>Hirschey, M. D., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Regulation+by+Lysine+Malonylation,+Succinylation,+and+Glutarylation.">Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).</li><li>Still, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mitochondrial+acetylation+dynamics+highlights+prominent+sites+of+metabolic+regulation.">Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation.</a> J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).</li><li>Wagner, G. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+enzyme-independent+N&#949;-acetylation+and+N&#949;-succinylation+of+proteins+in+the+chemical+conditions+of+the+mitochondrial+matrix.">Widespread and enzyme-independent N&#949;-acetylation and N&#949;-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix.</a> J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).</li><li>He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+sirtuins:+regulators+of+protein+acylation+and+metabolism.">Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism.</a> Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).</li><li>Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+acetate+metabolism+in+Escherichia+coli+BL21+by+protein+N(epsilon)-lysine+acetylation.">Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+Acetylation+is+a+Highly+Abundant+and+Evolutionarily+Conserved+Modification+in+Escherichia+coli.">Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).</li><li>Kuhn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kinetic+and+proteomic+characterization+of+acetyl+phosphate-dependent+bacterial+protein+acetylation.">kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation.</a> PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).</li><li>Baeza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+site-specific+lysine+acetylation+in+an+entire+proteome.">Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).</li><li>Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Identification+of+Lysine+Acetylation+Stoichiometries+in+Mammalian+Cells.">Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells.</a> J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).</li><li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+determine+lysine+acetylation+stoichiometries.">A method to determine lysine acetylation stoichiometries.</a> Int J Proteomics. 2014, 730725 (2014).</li><li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS1+Peptide+Ion+Intensity+Chromatograms+in+MS2+(SWATH)+Data+Independent+Acquisitions.+Improving+Post+Acquisition+Analysis+of+Proteomic+Experiments.">MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Svinkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep,+Quantitative+Coverage+of+the+Lysine+Acetylome+Using+Novel+Anti-acetyl-lysine+Antibodies+and+an+Optimized+Proteomic+Workflow.">Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10A+cells.">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li><li>Schilling, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acetylation+dynamics+in+response+to+carbon+overflow+in+Escherichia+coli.">Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers.</a> Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIQED:+automated+identification+and+quantification+of+protein+modifications+from+DIA-MS+data.">PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data.</a> Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).</li><li>Rost, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSWATH+enables+automated,+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data.">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).</li><li>Lambert, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+differential+interactomes+by+affinity+purification+coupled+with+data-independent+mass+spectrometry+acquisition.">Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.</a> Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).</li><li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+quantitative+proteome+profiling+with+data-independent+acquisition+and+application+to+acetaminophen-treated+three-dimensional+liver+microtissues.">Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).</li><li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Quantification+of+Site-specific+Acetylation+Stoichiometry+Reveals+the+Impact+of+Sirtuin+Deacetylase+CobB+on+the+E.+coli+Acetylome.">Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מספק של הרומן, שיטה מדויקת לכמת ליזין בייעודי לאתר acetylation ותפוסה succinylation כי ניתן להחיל על פרוטאום כולו. שיטה זו מבוססת על מדידה של פפטידים אור אנדוגני, פפטידים כבד אקסוגני, האחרונים שבהם הם שנוצר במבחנה באמצעות acylation כימית כמותית של חלבונים עם אנהידריד אצטית deuterated -d6 או סוקסינית אנהידרידד4 (איור 1). שיטות דומות יש בשימוש תיוג איזוטרופי יציב של ליזין יאומתו יליד שאריות וביצע כימות תפוסת אתר המבוסס על גם קודמן יון בלבד12 או שבר יונים מ DDA רכישות13,14. פרוטוקול זה חל על מספר שלבים במהלך הכנת הדוגמא כדי לשפר את יעילות acylation ומרחיב תיוג כימי כדי succinylation. איסוף נתונים באמצעות רכישות DIA משיג קודמן יון והן MS2 פרגמנט יון עוצמות מעל לזיהוי מסה הטווח כולו, ובכך להקטין את הפרעות יון פרגמנט. ניתוח כימות באמצעות קו הרקיע וקבצי script מותאמים אישית שפותחו מאפשרות חישוב התפוסה באתר עבור פפטידים המכילים שאריות ליזין אחד או יותר, acylation יותר מפעם אחת באתר אחד.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשלב הכנת המדגם של פרוטוקול זה שיש אחריו מקרוב. מאחר פרוטוקול כולו מסתמך על שינוי כימי יעיל של כל שאריות ליזין, שלב זה הוא בעל חשיבות עליונה. Anhydrides מגיבים עם אמינים חינם, כך אמין המכילים מולקולות מאגר או מזהם חלבון lysate יש להמנע ממנו. גם במהלך השלב כימיים acylation, ודא כי ה-pH של תערובת התגובה מותאם בחזרה pH 8 לאחר כל אחד incubations שלושה עם אנהידריד מגיב כפי כזאתי acidifies את התערובת, ריאקציות צדדיות של O-acylation עלולה להיווצר. יתר על כן, דילול תערובת שמונה מ' המכילות אוריאה התגובה כדי סביב אוריאה 0.8 מ' לפני לעיכול, בדיקת רמת ה-pH הוא בתוך הטווח האופטימלי חשוב לפעילות אופטימלית של endoproteinase Glu-סי עוד מרכיב המפתח של פרוטוקול שלנו הוא השלב אוסף נתונים המבוא של זרימת עבודה למישור הארץ מהמים, אשר מתגבר על כל חוסר עקביות נתונים דגימה DDA ומאפשר אשר על כימות ברמת יון פרגמנט MS2. אחד היתרונות העיקריים של המתודולוגיה DIA היא הירידה של הפרעות אשר הם בדרך כלל הרבה יותר נוטה ובעייתי כאשר לכימות האות יון קודמן MS1 (כמו חלק מן הפרסומים הקודם הראו).
ניתן לבצע מספר שינויים בזרימת עבודה בעת הכנת דוגמאות מורכבות מאוד. מספר שברים איחדו לאחר הניתנות להפחתה של basic-pH הפוך-פאזי HPLC fractionation מנותק כדי להפחית את המורכבות של הדגימות במאגר זה לרכוש על ידי LC/גב בנוסף, עוד כרומטוגרפי מעברי צבע יכול גם לשמש במהלך רכישת כדי לאפשר הפרדה פפטיד טוב יותר. לחלופין, ניתן להשתמש פרוטאזות מרובים לעכל את דגימות לייצר מגוון גדול יותר של פפטידים cleaved ולהגדיל את הסיקור של שאריות ליזין חלבון. . האקסאלסיור ואופטימיזציה יכול להתבצע באמצעות BSA מסחרי המכיל באחוזים מסוימים של acetylation או succinylation.
מגבלה אחת על פרוטוקול זה היא אתר פוטנציאלי קלה מופרזת תפוסת בשל נרשמה שינויים ליזין אחרים, כגון מתילציה או ubiquitination, וכדומה, באותו אתר4. מחושב מאזורי שיא של ליפיד קל וכבד שינויים, L/(L+H), והתפוסה באתר זה מבוסס על ההנחה כי הרמה הכוללת של השינוי באתר ליזין מורכב acylation 'אור' רק אנדוגני (L) ומתויגים כימית 'כבדים' acylation (H). עם זאת, והתפוסה acylation הכולל בפועל האתר ויוו עשויים לכלול שינויים אחרים מעבר acetylation ו/או succinylation. בנוסף, את טוהר איזוטרופי המדווחת של ריאגנטים שנרכשו אנהידריד אצטית -d6 (99%) ואת סוקסינית אנהידריד -d4 (> 98%) עשוי לתרום מופרזת קטן של עד 2% (succinyl) או 1% (אצטיל) acylation אנדוגני רמה4. יחד, אלה overestimations קלה להוסיף הקושי לכימות אתרים עם פחות מ 1% תפוסה. שפע גדול ההבדלים בין להשלים כימית acylated פפטידים של פפטידים acylated מקורי גם לתרום האתר תפוסת כימות שגיאות פוטנציאליות, במיוחד עבור acylated אנדוגני נמוך פפטידים27. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Weinert et al. 27 מצא כי ירידה שפע ההבדלים בין פפטידים מלאה לכל acetylated יכול להפחית את השגיאה של כימות27.
Quantifications סטויכיומטריה שנאספו באמצעות פרוטוקול זה יכול לאתר נקודות חמות acylation חשוב ב השערות חלבון ו טופס מסוים לניסויים להמשך טיפול ביולוגי, כגון מוטגנזה של אתרים מסוימים של עניין. פרוטוקול זה גם יכול לחשוף בשילוב השפעות acylation נמוך סטויכיומטריה אתרי יכול להפעיל השפעות עקיפות או עדין על יציבות מבנית חלבון מקומי סביבות הסלולר. בנוסף, יישום של פרוטוקול זה כדי למדוד את acetylation ואת succinylation ושינויים אחרים אפשריים ליזין acylation מעבר acetylation באופן ייחודי מציע תובנות ההשפעות acylation דינמי על חלבונים תחת שונות התנאים הביולוגיים.

NƐ- acylation של שאריות ליזין חלבון הוא הרגולטור חשוב של פונקציה של חלבונים. ליזין acetylation ו acylations אחרים, כגון succinylation, malonylation, glutarylation, נחשבים לווסת את חילוף החומרים, התא איתות ואחרים תהליכים תאיים1,2,3,4 , יש השלכות הפרעות מטבוליות5. מחקרים רבים מצאו כי שינויים ליפיד ליזין עוברות קיפול-שינויים גדולים בתנאים שונים ברקמות יונקים וסלולרי קווים5,6,7,8 וכן חיידקים9,10,11, עם זאת, שינויים אלה קיפול יחסית אינם מספקים תובנות שחלקן של החלבון הכולל שונה. מחקרים דיווח מדידות של תפוסת באתר acylation נדיר12,13,14, למרות הרלוונטיות וזקוקים ללימודים כאלה כפי שהם מספקים יותר פרטים מאשר קיפול יחסית לשנות. לדוגמה, שינוי 10-fold יכול להציג עלייה תפוסה של האתר מ 0.01 0.1%, 1 עד 10% או אפילו 10 ל- 100%. מדידות מדויקות סטויכיומטריה נדרשים כדי לפרש את המשמעות הביולוגית של acylation וכדי לחזות השפעה לגבי ההשלכות של חלבונים מבניים, וייתכן, לשינויים פונקציונליים.
שיטה קודמת אחת לכמת תפוסת האתר מנצל כבד איזוטופ יציב כימית תיוג של שאריות ליזין יאומתו ואחריו ספקטרומטר מסה כדי למדוד את היחס בין acetylation "אור" אנדוגני בהשוואה אקסוגני, מבחינה כימית שכותרתו "כבדה" אצטיל-ליזין באמצעות קודמן יון עוצמות12. עוד מחקר שנערך על ידי ג'ואו ואח. 13 תיאר בגישה דומה כדי להעריך ליזין acetylation סטויכיומטריה גם מועסק acetylation כימי מלא של כל שאריות ליזין יאומתו בחלבונים עם איזוטופ יציב תיוג, אך שימוש בעוצמות יון פרגמנט, כפי שהיא נמדדת DDA. Nakayasu et al. 14 להשתמש בגישה DDA דומה, אך במקום זה משמש את היחס שבין קל וכבד אצטיל-ליזין immonium יונים כמת. כימות בהתבסס על פרגמנט יונים, immonium או רצף יונים (MS2), בברוב המקרים תוצאות פחות הפרעות האות לעומת עיבוד פפטיד שלם קודמן יונים (MS1). עם זאת, כימות של יונים קטע מן הספקטרום שנוצר על-ידי DDA MS/MS יכול לסבול ליקויים דגימה סטוכסטי, איפה היונים גבוהה-שפע קודמן הם נוטים יותר להיות נבחרת עבור MS/MS, לפיכך, להוביל דגימה מוטה ולא שלמים של קודמן יונים.
הרומן של זרימת עבודה זו4 (איור 1) משתמש מושגית איזוטופ יציב כימית תיוג הגישה פותח במקור על ידי Baeza ואח. 12, אולם זרימת העבודה לאחר מכן זה משולב עם דיה כדי לאסוף שני קודמן ו מרובים abundances יון פרגמנט מעל המסה לזיהוי טווח15,16 מתן חישובים סטויכיומטריה מדויק.
שיא של אזורים קטע יונים המכילים האתר acylation של עניין, או "המבדילים פרגמנט יונים", משמשים כדי לכמת את תפוסת באתר acylation (איור 2). יונים פרגמנט שאינן מכילות את השינוי יש ערכים זהים קל וכבד מ/z, משמשים לזיהוי פפטיד, אבל לא על כימות. קו הרקיע של התוכנה17 משמש כדי לחלץ קודמן שבר שיא אזורי. הנוכחות של מספר יונים רסיס המכיל את אתר acylation נתון מספק גמישות אם הפרעות מזוהות בחלק מן היונים פרגמנט. ויזואליזציה של נתונים ב- Skyline מאפשר פיקוח קריטיות של אור עד מסיבי פרגמנט יון יחסי. בנוסף ניתוח נתונים ידנית, חבילת R פתוח נכתב באתר, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), פותחה, אשר משתמשת קודמן יון, פרגמנט יון הנתונים שנאספים באמצעות למישור הארץ מהמים, מכמת סטויכיומטריה acylation בייעודי לאתר של פפטידים המכילים שאריות ליזין מרובים, תכונה בלתי אפשרית עם מדידות יון בלבד בעוצמה קודמן4.
פרוטוקול זה גם מדגים את השימוש endoproteinase Glu-C, שהוא ספציפי למחשוף C-מסוף-שאריות גלוטמית וחומצה אספרטית, במקום להשתמש טריפסין או פרוטאז Arg-C, שהאחרון לעיתים קרובות ליצור גדולים מאוד, פוטנציאל להכפיל פפטידים הפרוטאוליטי acylated הנובע חסם טריפסין מחשוף-שאריות ליזין acylated. החומר הכימי תיוג הליך הורחב גם לכלול שימוש סוקסינית אנהידריד (איור 1), ובעקבותיו כימות של succinylation סטויכיומטריה succinylation. בנוסף שיפורים הכנת הדוגמא, המימוש של פפטיד fractionation על ידי חומציות בסיסיות מנותק, הפוך-פאזי (bRP) ההפרדה של פפטידים נוסף ירד הפרעות כמת, ומאפשר יותר דה-קונבולוציה של סטויכיומטריה acylation פרוטאום כל הדגימות. יחד, שיטה זו כולל, מדגיש מספר יתרונות: יעילות מוגברת (1) acylation כימי; (2) מדידה של חלבון סטויכיומטריה succinylation בנוסף acetylation; . ודיוק כימות משופרת (3) כימות משופרת היא בשל הפרעות ירד בפרגמנט יון אותות DIA לעומת אות מבשר DDA, כמו גם היישום של fractionation קדם פפטיד במצב לא מקוון על-ידי bRP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqueous acetic anhydride-d6</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>175641-1G</td>
			<td>1% isotopic purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>succinic anhydride-d4</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>293741</td>
			<td>2% isotopic purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing grade endoproteinase Glu-C</td>
			<td>Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma)</td>
			<td>10791156001</td>
			<td>1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT 094225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC acetonitrile</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJAH015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJAH365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUKA formic acid (FA) for mass spec</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>C988C27</td>
			<td>~98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Pierce, Rockford, IL, USA</td>
			<td>88341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylammonium bicarbonate (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td>
			<td>43998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>EMDMillipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SX0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% hydroxylamine solution in water</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>438227-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS acetonitrile</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Themomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 1525 binary HPLC pump system</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT022939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2487 Dual Wavelength UV detector</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT081110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 717plus Autosampler</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT022939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Fraction Collector III</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>186001878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Zorbax 300Extend C18 column</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>770995-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer</td>
			<td>Labconco, Kansas City MO, USA</td>
			<td>7751000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>model# 845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#956;m &#215; 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 &#956;m, 300 &#197;)</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download Sciex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of site-specific protein lysine acetylation and succinylation stoichiometry using data-independent acquisition mass spectrometry

שינוי post-translational (PTM) של שאריות ליזין חלבון מאתƐN - acylation גורם לשינויים מבניים באופן דינמי יכול לווסת פונקציות חלבון, לדוגמה, על-ידי שינוי פעילות אנזימטי או על-ידי מתווכים אינטראקציות. כימות מדויק של חלבון ספציפי לאתר acylation תפוסה, או סטויכיומטריה, חיוני להבנת ההשלכות פונקציונלי של הכללית סטויכיומטריה ברמה נמוכה והן סטויכיומטריה בודדים acylation ברמה גבוהה של ליזין ספציפי שאריות. קבוצות אחרות דיווחו על מדידה של ליזין acetylation סטויכיומטריה על-ידי השוואת היחס של פפטיד קודמן איזוטופים של שפע אנדוגני, טבעי acylation והציג אקסוגני, כבד התווית על-ידי איזוטופ acylation לאחר כמותיים acetylation כימית של חלבונים באמצעות יציבה התווית על-ידי איזוטופ אצטי. פרוטוקול זה מתאר גישה ממוטבת מציע מספר שיפורים, לרבות: (1) עלה acylation כימיות יעילות, (2) את היכולת למדוד חלבון succinylation בנוסף acetylation, (3) שיפור דיוק כמותיים תופיפצה הפרעות מופחתת באמצעות שבר כימות יון של הנתונים שאינו תלוי רכישות (DIA) במקום קודמן יון האיתות נתונים תלויי רכישה (DDA). השימוש של יונים שבר שיא שחולצו אזורים על כימות גם באופן ייחודי מאפשר בידול של acylation ברמת האתר סטויכיומטריה מ הפרוטאוליטי פפטידים המכילים אחד או יותר משקע ליזין, אשר אינה אפשרית באמצעות יון קודמן אותות על כימות. ויזואליזציה של נתונים בקו רקיע, סביבה פרוטאומיקס כמותיים קוד פתוח, מאפשר בדיקת הנתונים נוח וסקירה. יחד, זרימת עבודה זו מציעה כימות לא משוחדת, ומדויקת של ליזין בייעודי לאתר acetylation ו- succinylation אכלוסם של פרוטאום כולו, אשר עשויים לחשוף, לתעדף אתרי acylation רלוונטי מבחינה ביולוגית.

לאחר ייבוא נתונים, המבדילים MS2 פרגמנט יונים היו נחושים מ פפטידים הפרוטאוליטי acylated, שחולצו לאחר מכן יון chromatograms (XIC) עובדו הרקיע, ואת האור המתאימה, שיא כבד באזורים יוצאו שהיו סוף סוף משמש לחישוב התפוסה באתר. איור 2A מראה של רעיונית איור של איך ייתכן XIC קודמן-יון מופיעות שמציעות שתי אותות פפטיד קל וכבד, איור 2B מציג דוגמה של השבר המתאים יון XICs עם קודי הצבע (אדום = אור; כחול = כבד ) עבור המבדילים יונים רסיס המכיל את השינויים acylation ליזין.
איור 3 מראה נתונים הנובעים ניסוי תפוסה, כמו שתוארו לעיל בניתוח יחסי מוגדרים מראש של אור/האבי succinylated BSA שנוצר בארגון-1, 10, 50, או 100% והקביעה של תפוסת succinylation הימנו. ייבוא נתונים תפוסת למישור הארץ מהמים אל הרקיע מאפשר הדמיה קל של העץ היעד, הצגת רצפי פפטיד, יונים קטע שני עבור היונים קודמן קל וכבד (איור 3 א). נתונים מ למישור הארץ מהמים-MS של כל יחס מוגדר succinylated BSA חשף immanently היחסי הבדלי יחס של אור עד מסיבי y7 יון, בדירוג הגבוה ביותר המבדילים פרגמנט יונים מן ההתאמה פפטיד מזוהה-ספקטרה (המצוין באדום, איור 3B). איור 4 מציג סקירה של תוצאות מעובד מהחישוב MS2 תפוסת שאישרה והתפוסה אחוזי succinylation של חלבון קלט, כאן המורכב BSA טרום-succinylated. ליזין נמדד תפוסה succinylation עבור 20 פפטידים הפרוטאוליטי succinylated המתקבל BSA טרום מסחרי-succinylated, succinylated-אחוזים מוגדרת (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%) מוצגות בטבלה מס ' 2. עבור כל אחד של פפטידים BSA הפרוטאוליטי 20, הגבוה ביותר מדורגים, המבדילים MS2 פרגמנט יון שימש לחישוב התפוסה ליזין succinylation (Ksucc), כמו L/(L+H) %. בסך הכל, כימות מבוססי MS2 הראה דיוק טוב מאוד בקביעת acylation תפוסה בכלל stoichiometries נמוכה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg"> איור 1: זרימת העבודה סטויכיומטריה- (א) חלבונים מודגרת שלוש פעמים עם אנהידריד אצטית -d6 כדי acetylate שאריות ליזין שלא שונתה. הבא, acetylated חלבונים מתעכלים עם endoproteinase Glu-C, ואחריו HPLC fractionation של פפטידים הפרוטאוליטי באמצעות כרומטוגרפיה הפוך-פאזי basic-pH. לבסוף, פפטידים מנותחים על-ידי LC-MS באמצעות למישור הארץ מהמים עם רוחב חלון קודמן משתנה. (B) אותה זרימת עבודה משמש כדי לקבוע סטויכיומטריה succinylation כמתואר ב- (א), חוץ acylation כבד הכימית משתנה סוקסינית אנהידריד -ד4. איור מקורי מאייר ואח. 4 (ג'יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg"> איור 2: דוגמה אפשרית נתונים שהושגו וחישובים סטויכיומטריה- (א) אור (L), כבד יונים קודמן של MS1 (H), המכיל אחת ליזין acetylated נבדלים 3 יחידות מסה. XICs נוצרים עבור מעטפות איזוטרופי קל וכבד המצוין אדום וכחול, בהתאמה. (B) כימות של MS2 יון שבר XICs של רכישות למישור הארץ מהמים יכול להתבצע באמצעות 'להבדיל' שבר קל וכבד יונים המכילים את האתר acetylation שצוינו אדום וכחול. יונים קטע משותף מוצגים בשחור מנוקד, מכיל האתר של השינוי. איור מקורי מאייר ואח. 4 (ג'יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg"> איור 3: קו הרקיע ויזואליזציה של פפטיד BSA הפרוטאוליטי succinylated ברמות שונות תפוסה. (א) של קו הרקיע של היעד עץ מציג את פפטיד הפרוטאוליטי LCKsuccVASLRE וכתוצאה שלה קטע יונים. (B) הרקיע חילצה פרגמנט chromatograms יון ברמות משתנות של תפוסת succinylation. מדורגת הגבוהה ביותר המבדילים יון, y7, גדל באזור שיא 1, 10, 50 ו- 100% מתאם לאחוז קלט של BSA pre-succinylated (נוצר בחברה). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg"> איור 4: הערכת BSA סטויכיומטריה acylation של BSA טרום-succinylated. חמש דוגמאות BSA שונים-מוגדר אחוזי השינוי כבד (למשל., 0, 1, 10, 50 ו- 100%) היו נתונים MS2 תפוסה של נחישות. תפוסה של האתר עבור 20 פפטידים BSA succinylated היו נחושים מן הגבוה ביותר מדורגים המבדילים פרגמנט היונים עבור חמש דגימות BSA שונים-מוגדר אחוזי השינוי אור (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%). העלילה תיבת משערה מציג את ההתפלגות של פפטידים succinyl 20 ערכים מ- 50% של פפטידים נמצאים בתיבה' ' (אחוזון 25% על אחוזון 75%), משערה העליון מציינת את הערכים של אחוזון 75% לכל היותר (100%), מציין שפם התחתון הערכים של אחוזון 25% מינימום (אחוזון 0%). (ג'יי אני מספר הביטוח הלאומי מסה Spectrom., הפתוח בחירה). כימות של מדידות ניתן למצוא בטבלה מס ' 2. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הזמן (דקות)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7.27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>45.27</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>49.27</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>65.27</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>72.27</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>80.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>85.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>86.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>120.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">קצב הזרימה: 0.7 mL/min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">מאגר ת 10 מ מ אמוניום formate במים, pH 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">מאגר ב': 10 מ מ אמוניום formate ב- 90% מים לחצן מצוקה ו-10%, pH 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">הערה: ה-pH של שני שלבים נייד מותאם 10 עם אמוניה מסודר</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מעבר צבע עבור מנותק basic-pH הפוך-פאזי HPLC fractionation. אורך מעבר הצבע: 120 דקות מאגר ת 10 מ מ אמוניום formate במים, pH 10. מאגר ב': 10 מ מ formate אמוניום ב- 90% מים לחצן מצוקה ו-10%, pH 10.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>L / L + H ב- %</td>
			<td>L / L + H ב- %</td>
			<td>L / L + H ב- %</td>
			<td>L / L + H ב- %</td>
			<td>L / L + H ב- %</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ksucc 0%</td>
			<td>Ksucc 1%</td>
			<td>Ksucc 10%</td>
			<td>Ksucc 50%</td>
			<td>Ksucc 100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>50.9</td>
			<td>99.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>2.3</td>
			<td>12.3</td>
			<td>49.4</td>
			<td>97.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.9</td>
			<td>3.8</td>
			<td>14</td>
			<td>48.6</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>1.8</td>
			<td>11.7</td>
			<td>50.8</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>48.3</td>
			<td>98.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>11</td>
			<td>47.5</td>
			<td>96.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.6</td>
			<td>12.8</td>
			<td>51</td>
			<td>99.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.7</td>
			<td>5.2</td>
			<td>14.7</td>
			<td>51.9</td>
			<td>89.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.5</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.5</td>
			<td>47.2</td>
			<td>91.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8</td>
			<td>1.5</td>
			<td>11.3</td>
			<td>48.4</td>
			<td>96.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.6</td>
			<td>13.9</td>
			<td>49.7</td>
			<td>98.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>10.7</td>
			<td>48.2</td>
			<td>98.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>0.9</td>
			<td>10.3</td>
			<td>49.4</td>
			<td>99.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>17.2</td>
			<td>52.3</td>
			<td>97.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>3.5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>51</td>
			<td>99</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.9</td>
			<td>10.7</td>
			<td>49.6</td>
			<td>98.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>10.9</td>
			<td>47.7</td>
			<td>96.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>10</td>
			<td>53</td>
			<td>98</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.9</td>
			<td>57.9</td>
			<td>94.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.4</td>
			<td>11.6</td>
			<td>48.6</td>
			<td>98.8</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: כימות נמדד BSA ליזין succinylation תפוסה של פפטידים הפרוטאוליטי succinylated 20- פפטידים Succinylated המתקבל BSA טרום מסחרי-succinylated, succinylated-אחוזים מוגדרת (למשל, ב- 0, 1, 10, 50 ו- 100%). עבור כל אחד של פפטידים BSA הפרוטאוליטי 20, הגבוה ביותר מדורגים, המבדילים MS2 פרגמנט יון שימש לחישוב התפוסה ליזין succinylation (Ksucc), כמו L/(L+H) %.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Amines

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

עקרונות אתר ספציפיות recombinase (SSR) טכנולוגיה

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...