Name: quantification of site-specific protein lysine acetylation and succinylation stoichiometry using data-independent acquisition mass spectrometry
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry at JoVE.com

यह काम मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के NIH राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था NIH-NIDDK ग्रांट R24 DK085610 (पीआई: ई. Verdin) । JGM एक NIH T32 फैलोशिप (T32 AG000266, PI: जे Campisi) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक बक संस्थान (1S10 OD016281, PI: बीवीएससी गिब्सन) में TripleTOF 6600 प्रणाली के लिए NIH साझा इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

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	<li>Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+landscape+of+lysine+acetylation+links+metabolism+and+cell+signalling.">The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).</li><li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=50+years+of+protein+acetylation:+from+gene+regulation+to+epigenetics,+metabolism+and+beyond.">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li><li>Choudhary, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysine+acetylation+targets+protein+complexes+and+co-regulates+major+cellular+functions.">Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.</a> Science. 325 (5942), 834-840 (2009).</li><li>Meyer, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mitochondrial+acetylation+dynamics+highlights+prominent+sites+of+metabolic+regulation.">Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation.</a> J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).</li><li>Wagner, G. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+and+enzyme-independent+N&#949;-acetylation+and+N&#949;-succinylation+of+proteins+in+the+chemical+conditions+of+the+mitochondrial+matrix.">Widespread and enzyme-independent N&#949;-acetylation and N&#949;-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix.</a> J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).</li><li>He, W., Newman, J. C., Wang, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=kinetic+and+proteomic+characterization+of+acetyl+phosphate-dependent+bacterial+protein+acetylation.">kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation.</a> PLoS One. 9 (4), e94816 (2014).</li><li>Baeza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+site-specific+lysine+acetylation+in+an+entire+proteome.">Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).</li><li>Zhou, T., Chung, Y. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS1+Peptide+Ion+Intensity+Chromatograms+in+MS2+(SWATH)+Data+Independent+Acquisitions.+Improving+Post+Acquisition+Analysis+of+Proteomic+Experiments.">MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).</li><li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+data+extraction+of+the+MS/MS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition:+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis.">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma.">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).</li><li>Svinkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep,+Quantitative+Coverage+of+the+Lysine+Acetylome+Using+Novel+Anti-acetyl-lysine+Antibodies+and+an+Optimized+Proteomic+Workflow.">Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10A+cells.">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li><li>Schilling, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+acetylation+dynamics+in+response+to+carbon+overflow+in+Escherichia+coli.">Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).</li><li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+High-Quality+SWATH+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF+Mass+Spectrometers.">Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers.</a> Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).</li><li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIQED:+automated+identification+and+quantification+of+protein+modifications+from+DIA-MS+data.">PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data.</a> Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).</li><li>Rost, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSWATH+enables+automated,+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data.">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).</li><li>Lambert, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+differential+interactomes+by+affinity+purification+coupled+with+data-independent+mass+spectrometry+acquisition.">Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.</a> Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).</li><li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+quantitative+proteome+profiling+with+data-independent+acquisition+and+application+to+acetaminophen-treated+three-dimensional+liver+microtissues.">Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).</li><li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Quantification+of+Site-specific+Acetylation+Stoichiometry+Reveals+the+Impact+of+Sirtuin+Deacetylase+CobB+on+the+E.+coli+Acetylome.">Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल एक उपंयास और सटीक विधि के लिए साइट-विशिष्ट lysine acetylation और succinylation अधिभोग है कि एक पूरे proteome के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान करता है । इस विधि अंतर्जात प्रकाश पेप्टाइड्स और exogenous भारी पेप्टाइड्स की माप पर निर्भर करता है, जो बाद के इन विट्रो में उत्पन्न कर रहे हैं मात्रात्मक रासायनिक acylation के साथ प्रोटीन का उपयोग deuterated एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 या succinic एनहाइड्राइड-d4 (चित्र 1) । इसी तरह के तरीके स्थिर isotopic लेबलिंग का इस्तेमाल किया है देशी unlysine अवशेषों और प्रदर्शन साइट अधिभोग के आधार पर ठहराव या तो अग्रदूत आयन केवल12 या टुकड़ा आयनों से डीडीए अधिग्रहण13,14. इस प्रोटोकॉल acylation दक्षता में सुधार करने के लिए नमूना तैयारी के दौरान कई चरणों पर लागू होता है और succinylation करने के लिए रासायनिक लेबल का विस्तार । डेटा संग्रह का उपयोग कर दीया अधिग्रहणों दोनों के प्रणेता आयन और MS2 टुकड़ा आयन तीव्रता पूरे पता लगाने वाला जन सीमा से अधिक, इस प्रकार टुकड़ा आयन हस्तक्षेप को कम करने प्राप्त करता है । विश्लेषण और ठहराव के माध्यम से क्षितिज और कस्टम लिपियों में विकसित घर साइट अधिभोग गणना एक से अधिक lysine अवशेषों और एक साइट पर एक से अधिक acylation युक्त पेप्टाइड्स के लिए अनुमति देते हैं ।
इस प्रोटोकॉल है कि बारीकी से पालन किया जाना चाहिए के नमूना तैयारी चरण के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । के बाद से पूरे प्रोटोकॉल सभी lysine अवशेषों के कुशल रासायनिक संशोधन पर निर्भर करता है, यह कदम अत्यंत महत्व का है । Anhydrides मुक्त अमीन के साथ प्रतिक्रिया, तो अमीन-बफर युक्त या प्रोटीन lysate में contaminant अणुओं से बचा जाना चाहिए. इसके अलावा रासायनिक प्रति acylation कदम के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया मिश्रण के पीएच वापस पीएच 8 के लिए इस मिश्रण acidifies प्रतिक्रिया के रूप में एनहाइड्राइड रिएजेंट के साथ तीन मशीन के प्रत्येक के बाद समायोजित है, और ओ-acylation पक्ष प्रतिक्रियाओं फार्म का हो सकता है । इसके अलावा, 8 मीटर यूरिया युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के आसपास के लिए लगभग 0.8 मीटर यूरिया पाचन से पहले और जांच है कि पीएच इष्टतम रेंज के भीतर है endoproteinase Glu की इष्टतम गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है-सी । हमारे प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण घटक डेटा संग्रह कदम और एक दीया कार्यप्रवाह है, जो किसी भी डीडीए डेटा नमूने विसंगतियों पर काबू पाता है और जो MS2 टुकड़ा आयन स्तर पर ठहराव के लिए अनुमति देता है की शुरूआत है । व्यास पद्धति का एक मुख्य लाभ हस्तक्षेप की कमी है जो आम तौर पर कर रहे है और अधिक प्रवण और समस्याग्रस्त जब MS1 अग्रदूत आयन संकेत बढ़ाता है (पिछले प्रकाशनों में से कुछ के रूप में सुझाव दिया है) ।
अत्यधिक जटिल नमूनों की तैयारी करते समय कार्यप्रवाह में कई संशोधन किए जा सकते हैं. आंशिक रूप से ऑफ़लाइन मूल-पीएच उलट-चरण HPLC भिन्नीकरण के बाद परित किए गए अंशों की संख्या कम करने के लिए pooled नमूनों कि नियंत्रण रेखा से प्राप्त किया जाएगा की जटिलता/MS. इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक क्रोमेटोग्राफिक ग्रैडिएंट भी उपयोग किया जा सकता है अधिग्रहण बेहतर पेप्टाइड जुदाई के लिए अनुमति देने के लिए । वैकल्पिक रूप से, एकाधिक टीज़र के लिए नमूनों को पचाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक बड़ी विविधता के लिए सट पेप्टाइड और प्रोटीन lysine अवशेषों की कवरेज में वृद्धि । परीक्षण चलाता है और अनुकूलन वाणिज्यिक acetylation या succinylation के विशिष्ट प्रतिशत युक्त BSA का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा के संभावित मामूली साइट अधिभोग इस तरह के मिथाइल या ubiquitination के रूप में बेहिसाब अंय lysine संशोधनों, के कारण अधिक है, आदि, एक ही साइट पर4। प्रकाश और भारी acyl संशोधनों के शिखर क्षेत्रों से गणना, एल/(एल + एच), साइट अधिभोग धारणा है कि एक lysine साइट पर संशोधन के कुल स्तर पर ही अंतर्जात ' प्रकाश ' acylation (एल) और रासायनिक लेबल के होते है पर आधारित है ' भारी ' acylation (ज). हालांकि, वास्तविक कुल acylation अधिभोग vivo में एक साइट पर acetylation और/या succinylation से परे अन्य संशोधनों शामिल हो सकते हैं । साथ ही, खरीदे गए रिएजेंट की सूचना isotopic शुद्धता एसिटिक एनहाइड्राइड-d6 (99%) और succinic एनहाइड्राइड-d4 (> 98%) 2% तक (succinyl) या 1% (एसिटाइल) के एक छोटे से अधिक अनुमान लगाने के लिए योगदान कर सकते है अंतर्जात acylation तर४. एक साथ, इन मामूली अनुमान से कम 1% अधिभोग के साथ साइटों को बढ़ाता में कठिनाई के लिए जोड़ें । पूर्ण रासायनिक acylated पेप्टाइड्स और देशी acylated पेप्टाइड्स के बीच बड़े बहुतायत अंतर भी संभावित साइट अधिभोग ठहराव त्रुटियों के लिए योगदान, विशेष रूप से कम अंतर्जात acylated पेप्टाइड्स के लिए27. Weinert एट अलद्वारा हाल ही में एक अध्ययन । 27 पाया कि पूर्ण प्रति-acetylated पेप्टाइड्स के बीच कम बहुतायत अंतर ठहराव त्रुटि27को कम कर सकते हैं ।
Stoichiometry quantifications इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर इकट्ठे हुए एक विशेष प्रोटीन और जैविक अनुवर्ती प्रयोगों के लिए फार्म का परिकल्पना में महत्वपूर्ण acylation के आकर्षण के उपसाधन, इस तरह साइट के रूप में तुच्छ कर सकते है ब्याज की कुछ साइटों के निर्देश mutagenesis । यह प्रोटोकॉल भी कम acylation stoichiometry साइटों के संयुक्त प्रभाव है कि प्रोटीन संरचनात्मक स्थिरता और स्थानीयकृत सेलुलर वातावरण पर अप्रत्यक्ष या सूक्ष्म प्रभाव डालती सकता प्रकट सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के लिए acetylation और succinylation और अंय संभव lysine acylation संशोधनों को मापने के लिए acetylation से परे विशिष्ट के तहत प्रोटीन पर गतिशील acylation प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा अलग जैविक स्थितियों ।

NƐ-प्रोटीन lysine अवशेषों का acylation प्रोटीन फंक्शन का एक महत्वपूर्ण नियामक है । Lysine acetylation और अंय acylations, जैसे succinylation, malonylation, और glutarylation, के लिए चयापचय, सेल संकेतन, और अंय सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए लगा रहे है1,2,3,4 , और चयापचय विकारों में निहितार्थ5है । कई अध्ययनों से पाया है कि lysine acyl संशोधनों स्तनधारी ऊतकों और सेल लाइनों में विभिन्न स्थितियों के तहत बड़े गुना परिवर्तन से गुजरना5,6,7,8 के रूप में अच्छी तरह के रूप में बैक्टीरिया9,10,11, तथापि, इन सापेक्ष गुना परिवर्तन अंतर्दृष्टि कुल प्रोटीन संशोधित के अनुपात में प्रदान नहीं करते । अध्ययन acylation साइट अधिभोग के माप रिपोर्टिंग दुर्लभ है12,13,14, प्रासंगिकता और ऐसे अध्ययनों के लिए जरूरत के रूप में वे रिश्तेदार गुना परिवर्तन से अधिक विस्तार प्रदान करने के बावजूद । उदाहरण के लिए, 10-गुना परिवर्तन 0.01 से 0.1%, 1 से 10%, या 10 से 100% तक साइट अधिभोग वृद्धि का प्रतिनिधित्व कर सकता है । सटीक stoichiometry मापन acylation के जैविक महत्व की व्याख्या करने के लिए और प्रोटीन संरचनात्मक की भयावहता के बारे में प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए आवश्यक हैं, और संभवतः, कार्यात्मक परिवर्तन.
एक पिछले विधि के लिए साइट अधिभोग का उपयोग करता है भारी स्थिर-unlysine अवशेषों की लेबलिंग-आइसोटोप रासायनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा करने के लिए अंतर्जात "प्रकाश" acetylation की तुलना में exogenous के बीच अनुपात को मापने के लिए, रासायनिक-लेबल "भारी" एसिटाइल-lysine का उपयोग कर प्रणेता आयन तीव्रता12. झोउ एट अलद्वारा हाल ही में एक अध्ययन । 13 lysine acetylation stoichiometry का आकलन करने के लिए एक समान दृष्टिकोण वर्णित है कि यह भी स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के साथ प्रोटीन में सभी अनसंशोधित lysine अवशेषों का एक पूरा रासायनिक acetylation कार्यरत है, लेकिन द्वारा मापा के रूप में टुकड़ा आयन तीव्रता इस्तेमाल किया डीडीए. Nakayasu एट अल. 14 एक समान डीडीए दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, लेकिन इसके बजाय ठहराव के लिए प्रकाश और भारी एसिटाइल-lysine immonium आयनों के अनुपात का इस्तेमाल किया । ठहराव टुकड़े आयनों, immonium या अनुक्रम आयनों (MS2) पर आधारित है, ज्यादातर मामलों में कम संकेत हस्तक्षेप में बरकरार पेप्टाइड अग्रदूत आयनों (MS1) प्रसंस्करण की तुलना में परिणाम. हालांकि, डीडीए से टुकड़ा आयनों के ठहराव-ms/एमएस स्पेक्ट्रा stochastic नमूना की कमी है, जहां उच्च बहुतायत अग्रदूत आयनों और एमएस के लिए चयनित होने की संभावना है से पीड़ित कर सकते हैं/ms और इस प्रकार, एक पक्षपाती और अपूर्ण नमूने के लिए नेतृत्व अग्रदूत आयनों ।
यह उपंयास कार्यप्रवाह4 (चित्रा 1) मूल रूप से Baeza एट अलद्वारा विकसित एक स्थिर आइसोटोप रासायनिक लेबलिंग दृष्टिकोण का उपयोग करता है. 12, लेकिन कार्यप्रवाह बाद में व्यास के साथ युग्मित करने के लिए detectable जन सीमा15,16 सटीक stoichiometry गणना प्रदान करने पर दोनों के अग्रदूत और कई टुकड़े आयन बहुतायत इकट्ठा ।
टुकड़ा आयनों से पीक क्षेत्रों है कि ब्याज की acylation साइट होते हैं, या ' अंतर टुकड़ा आयनों ', acylation साइट अधिभोग (चित्रा 2) यों तो इस्तेमाल कर रहे हैं । टुकड़ा आयनों कि संशोधन शामिल नहीं है समान प्रकाश और भारी m/z मान, और पेप्टाइड पहचान के लिए लेकिन ठहराव के लिए नहीं किया जाता है । क्षितिज सॉफ्टवेयर17 के अग्रदूत और टुकड़ा चोटी क्षेत्रों को निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है । एक दिया acylation साइट युक्त एकाधिक टुकड़ा आयनों की उपस्थिति लचीलापन प्रदान करता है यदि टुकड़ा आयनों के कुछ में हस्तक्षेप का पता चला रहे हैं । क्षितिज में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन प्रकाश से भारी टुकड़ा आयन अनुपात के महत्वपूर्ण निरीक्षण के लिए अनुमति देता है । मैनुअल डेटा विश्लेषण, एक मुक्त स्रोत आर में लिखा पैकेज के अलावा घर, StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), विकसित किया गया था, जो अग्रदूत आयन और टुकड़ा आयन व्यास और quantifies के माध्यम से एकत्र डेटा का उपयोग करता है साइट विशेष acylation एकाधिक lysine अवशेषों से युक्त पेप्टाइड से stoichiometry, एक सुविधा के अग्रदूत आयन केवल तीव्रता माप4के साथ संभव नहीं है ।
इस प्रोटोकॉल भी endoproteinase Glu-सी है, जो सी के लिए विशिष्ट है glutamic और एसपारटिक एसिड अवशेषों पर टर्मिनल दरार, बजाय trypsin या Arg-सी को छेड़ने का उपयोग कर के उपयोग को दर्शाता है, के रूप में बाद अक्सर बहुत बड़ी उत्पंन और संभावित गुणा acylated proteolytic acylated lysine अवशेषों पर अवरुद्ध trypsin दरार से उत्पंन पेप्टाइड्स । succinic एनहाइड्राइड (चित्र 1) के उपयोग को शामिल करने के लिए रासायनिक लेबलिंग प्रक्रिया को भी बढ़ाया गया था, जिससे succinylation stoichiometry succinylation के ठहराव को सक्षम किया जा सके । नमूना तैयार करने के लिए सुधार के अलावा, ऑफ़लाइन द्वारा पेप्टाइड भिन्नीकरण के कार्यांवयन, बुनियादी पीएच, उलट-चरण (bRP) पेप्टाइड्स की जुदाई आगे ठहराव हस्तक्षेप की कमी हुई, बेहतर de-कनवल्शनफ़िल्टर्स की अनुमति पूरे proteome नमूनों में acylation stoichiometry । एक साथ, इस विधि सुविधाओं और कई लाभ पर प्रकाश डाला गया: (1) रासायनिक acylation की क्षमता में वृद्धि; (२) acetylation के अतिरिक्त प्रोटीन succinylation stoichiometry का मापन; और (3) बेहतर ठहराव सटीकता । बेहतर ठहराव के कारण है व्यास से टुकड़ा आयन संकेतों में हस्तक्षेप की तुलना में डीडीए के प्रणेता संकेत है, साथ ही साथ बंद के कार्यांवयन लाइन पेप्टाइड पूर्व bRP द्वारा भिंन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>aqueous acetic anhydride-d6</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>175641-1G</td>
			<td>1% isotopic purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>succinic anhydride-d4</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>293741</td>
			<td>2% isotopic purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sequencing grade endoproteinase Glu-C</td>
			<td>Roche, Indianapolis, IN, USA (through Sigma)</td>
			<td>10791156001</td>
			<td>1:50 protease to substrate protein ratio (wt:wt)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oasis HLB Solid-Phase Extraction (SPE) cartridges</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT 094225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC acetonitrile</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJAH015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJAH365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>I1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUKA formic acid (FA) for mass spec</td>
			<td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td>
			<td>C988C27</td>
			<td>~98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>PI29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Pierce, Rockford, IL, USA</td>
			<td>88341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylammonium bicarbonate (TEAB)</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T7408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anhydrous dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td>
			<td>43998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>EMDMillipore, Burlington, MA, USA</td>
			<td>SX0590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% hydroxylamine solution in water</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>438227-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC365-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS acetonitrile</td>
			<td>Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>BJLC015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Themomixer Compact</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>T1317-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 1525 binary HPLC pump system</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT022939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 2487 Dual Wavelength UV detector</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT081110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters 717plus Autosampler</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>WAT022939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Fraction Collector III</td>
			<td>Waters Corp., Milford, MA, USA</td>
			<td>186001878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Zorbax 300Extend C18 column</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>770995-902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Freeze Dry System Freezone 4.5 Lyophilizer</td>
			<td>Labconco, Kansas City MO, USA</td>
			<td>7751000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indexed retention time (iRT) normalization peptide standard</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Ki-3002-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system</td>
			<td>Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, USA</td>
			<td>model# 845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 5600 mass spectrometer</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orthogonal quadrupole time-of-flight (QqTOF) TripleTOF 6600 mass spectrometer</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 pre-column chip (200 &#956;m &#215; 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 &#956;m, 300 &#197;)</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SWATH 2.0 plugin into PeakView 2.2</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>software download Sciex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronaut</td>
			<td>Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland</td>
			<td>Sw-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18-CL chip (75 &#181;m x 15 cm ChromXP, 3 &#181;m, 300 &#197;)</td>
			<td>Sciex LLC, Framingham, MA, USA</td>
			<td>804-00001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of site-specific protein lysine acetylation and succinylation stoichiometry using data-independent acquisition mass spectrometry

NƐ-acylation द्वारा प्रोटीन lysine अवशेषों की पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (PTM), उदाहरण के लिए, एंजाइमी गतिविधि को परिवर्तित करके या मध्यस्थता करने वाली सहभागिता से संरचनात्मक परिवर्तन लाती है जो प्रोटीन फ़ंक्शंस को विनियमित कर सकता है । साइट-विशिष्ट प्रोटीन acylation अधिभोग, या stoichiometry की सटीक ठहराव, दोनों वैश्विक कम स्तर stoichiometry और विशिष्ट acylation के व्यक्तिगत उच्च स्तरीय stoichiometry lysine के कार्यात्मक परिणामों को समझने के लिए आवश्यक है अवशेषों. अन्य समूहों के माप की रिपोर्ट है lysine acetylation stoichiometry के अनुपात की तुलना करके पेप्टाइड का प्रणेता आइसोटोप अंतर्जात से, प्राकृतिक बहुतायत acylation और exogenous, भारी आइसोटोप-लेबल acylation के बाद पेश मात्रात्मक स्थिर आइसोटोप का उपयोग प्रोटीन का रासायनिक acetylation-त्यसपछि एसिटिक एनहाइड्राइड. इस प्रोटोकॉल सहित कई सुधार की विशेषता एक अनुकूलित दृष्टिकोण का वर्णन: (1) रासायनिक acylation क्षमता में वृद्धि हुई, (2) acetylation के अलावा प्रोटीन succinylation को मापने की क्षमता, और (3) बेहतर मात्रात्मक सटीकता के कारण डेटा-निर्भर अर्जन (डीडीए) से पूर्ववर्ती आयन संकेत के बजाय डेटा-स्वतंत्र अर्जन (व्यास) से अंश आयन ठहराव का उपयोग करके कम हस्तक्षेप । ठहराव के लिए टुकड़ा आयनों से निकाले चोटी के क्षेत्रों का उपयोग भी विशिष्ट साइट स्तर के भेदभाव सक्षम बनाता है proteolytic पेप्टाइड्स से एक से अधिक lysine अवशेषों, जो अग्रदूत आयन का उपयोग संभव नहीं है से युक्त acylation stoichiometry ठहराव के लिए संकेत । क्षितिज में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन, एक खुला स्रोत मात्रात्मक प्रोटियोमिक् वातावरण, सुविधाजनक डेटा निरीक्षण और समीक्षा के लिए अनुमति देता है. साथ में, यह कार्यप्रवाह किसी संपूर्ण proteome के साइट-विशिष्ट lysine acetylation और succinylation अधिभोग के निष्पक्ष, सटीक और सटीक ठहराव प्रदान करता है, जो जैविक रूप से प्रासंगिक acylation साइटों को प्रकट और प्राथमिकता दे सकता है ।

डेटा अधिग्रहण के बाद, MS2 टुकड़ा आयनों अंतर proteolytic acylated पेप्टाइड्स से निर्धारित किया गया था, बाद में निकाले आयन chromatograms (XIC) क्षितिज में संसाधित किया गया, और इसी प्रकाश और भारी पीक क्षेत्रों जो थे निर्यात किया गया अंत में साइट अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । चित्रा 2a कैसे अग्रदूत आयन XIC दोनों प्रकाश और भारी पेप्टाइड संकेतों की विशेषता प्रकट हो सकता है की एक वैचारिक चित्रण से पता चलता है, और चित्रा बी सी रंग कोडिंग के साथ इसी टुकड़ा आयन XICs का एक उदाहरण प्रस्तुत करता है (लाल = प्रकाश; नीला = भारी ) lysine acylation संशोधनों युक्त टुकड़ा आयनों अंतर के लिए ।
चित्रा 3 एक अधिभोग प्रयोग से उत्पंन डेटा से पता चलता है, जैसे प्रकाश/भारी succinylated BSA के पूर्व निर्धारित अनुपात का विश्लेषण ऊपर वर्णित के रूप में-घर में 1, 10, 50, या 100% पर उत्पंन, और succinylation अधिभोग का निर्धारण । क्षितिज में दीया अधिभोग डेटा आयात लक्ष्य पेड़ की आसान दृश्य सक्षम बनाता है, पेप्टाइड दृश्यों को प्रदर्शित करने, और दोनों प्रकाश और भारी अग्रदूत आयनों (चित्रा 3) के लिए टुकड़ा आयनों. प्रत्येक परिभाषित succinylated BSA अनुपात के दीया-MS से डेटा प्रकाश से भारी y7 आयन के अनुपात में सापेक्ष मतभेद immanently से पता चला, सबसे अधिक पहचान पेप्टाइड-स्पेक्ट्रा मैच से अंतर-अंश आयन (लाल रंग में संकेत दिया, चित्र बी) । चित्रा 4 MS2 अधिभोग गणना है कि इनपुट प्रोटीन के succinylation प्रतिशत अधिभोग की पुष्टि से संसाधित परिणामों के एक सिंहावलोकन दिखाता है, यहां पूर्व succinylated BSA से मिलकर । 20 proteolytic succinylated पेप्टाइड्स वाणिज्यिक पूर्व succinylated BSA से प्राप्त करने के लिए मापा lysine succinylation अधिभोग, निर्धारित प्रतिशत पर succinylated (उदा., 0, 1, 10, 50, और 100%) में तालिका 2में दिखाया गया है । 20 proteolytic BSA पेप्टाइड्स में से प्रत्येक के लिए, उच्चतम क्रमित, MS2 टुकड़ा आयन अंतर lysine succinylation (Ksucc) अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में एल/(एल + एच)% में. कुल मिलाकर, MS2 आधारित ठहराव कम stoichiometries पर भी acylation अधिभोग के निर्धारण में बहुत अच्छा सटीकता दिखाया ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg"> चित्र 1: Stoichiometry कार्यप्रवाह. (क) प्रोटीन तीन बार एसिटिक एनहाइड्राइड-डी6 के साथ acetylate को संशोधित lysine अवशेषों की मशीन हैं । अगला, acetylated प्रोटीन endoproteinase Glu-सी के साथ पचा रहे हैं, proteolytic पेप्टाइड्स के HPLC अंश के बाद बुनियादी-पीएच उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर । अंत में, पेप्टाइड्स द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं LC-MS चर प्रणेता खिड़की की चौड़ाई के साथ दीया का उपयोग कर. (B) समान कार्यप्रवाह का उपयोग (A) में बताए गए अनुसार succinylation stoichiometry को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, सिवाय हेवी acylation रिएजेंट को succinic एनहाइड्राइड-d4में बदल दिया जाता है । चित्रा मेयेर एट अलसे अनुकूलित । 4 (जे. के. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg"> चित्र 2: संभावित डेटा के उदाहरण प्राप्त किए गए और stoichiometry परिकलन. (A) प्रकाश (L) और भारी (H) MS1 अग्रदूत आयनों वाले एक acetylated lysine 3 जन इकाइयों द्वारा अलग. XICs दोनों प्रकाश और भारी isotopic लिफाफे क्रमशः लाल और नीले रंग में संकेत के लिए उत्पंन कर रहे हैं । (ख) व्यास अधिग्रहण से MS2 टुकड़ा आयन XICs से ठहराव ' अंतर ' प्रकाश और भारी टुकड़ा आयनों है कि acetylation लाल और नीले रंग में संकेत साइट होते है का उपयोग किया जा सकता है । आम टुकड़ा आयनों बिंदीदार काले में प्रदर्शित कर रहे हैं और संशोधन की साइट शामिल नहीं है । चित्रा मेयेर एट अलसे अनुकूलित । 4 (जे. के. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg"> चित्रा 3: अलग अधिभोग के स्तर पर succinylated proteolytic BSA पेप्टाइड के क्षितिज दृश्य. (A) क्षितिज लक्ष्य पेड़ proteolytic पेप्टाइड LCKsuccVASLRE और उसके परिणामस्वरूप टुकड़ा आयनों दिखा । (ख) क्षितिज succinylation अधिभोग के स्तर पर अलग से टुकड़ा आयन chromatograms निकाले । उच्चतम क्रमित आयन, y7, पीक क्षेत्र में बढ़ जाती है 1, 10, 50, और 100% correlating पूर्व के इनपुट प्रतिशत को succinylated BSA (में उत्पंन घर) । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg"> चित्रा 4: प्री-succinylated BSA के BSA acylation stoichiometry का आकलन. पांच भारी संशोधन के निर्धारित प्रतिशत पर अलग BSA नमूने (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) MS2 अधिभोग निर्धारण के अधीन थे । 20 succinylated BSA पेप्टाइड्स के लिए साइट अधिभोग उच्चतम स्थान प्रकाश संशोधन के परिभाषित प्रतिशत पर पांच अलग BSA नमूनों के लिए टुकड़ा आयनों अंतर से निर्धारित किया गया (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) । बॉक्स मूंछ भूखंड 20 succinyl पेप्टाइड्स का वितरण प्रदर्शित करता है, 50% पेप्टाइड्स से मान ' बॉक्स ' (75% शतमक के लिए 25% शतमक) में हैं, ऊपरी मूंछ 75% शतमक से अधिकतम (100%), और निचली मूंछ इंगित करता है मानों को इंगित करता है से मान 25% शतमक न्यूनतम करने के लिए (0% शतमक) । (जे. एएम. समाज. जन Spectrom., खुला विकल्प) । माप का ठहराव तालिका 2में पाया जा सकता है । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>समय (मिनट)</td>
			<td>% क</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>७.२७</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>४५.२७</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>४९.२७</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>६५.२७</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>७२.२७</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>८०.००</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>८५.००</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>८६.००</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>१२०.००</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">प्रवाह दर: 0.7 मिलीलीटर/</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">एक बफर: 10 मिमी अमोनियम पानी में formate, 10 पीएच</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">बफ़र B: 10 mM अमोनियम formation में 90% ACN और 10% पानी, पीएच 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">नोट: दोनों मोबाइल स्वच्छ अमोनिया के साथ 10 को समायोजित चरणों का पीएच</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: ऑफ़लाइन basic-pH के लिए ग्रैडिएंट औंधा-चरण HPLC भिन्नीकरण. ढाल लंबाई: 120 min. Buffer A: 10 मिमी अमोनियम पानी में स्वरूपित, 10 पीएच । बफ़र B: 10 mM अमोनियम formation में 90% ACN और 10% पानी, पीएच 10 ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>l/l + H% म</td>
			<td>l/l + H% म</td>
			<td>l/l + H% म</td>
			<td>l/l + H% म</td>
			<td>l/l + H% म</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ksucc 0%</td>
			<td>Ksucc 1%</td>
			<td>Ksucc १० टक्के</td>
			<td>Ksucc ५० टक्के</td>
			<td>Ksucc 100%</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>५०.९</td>
			<td>९९.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>2.3</td>
			<td>12.3</td>
			<td>४९.४</td>
			<td>९७.६</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.9</td>
			<td>3.8</td>
			<td>14</td>
			<td>४८.६</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>1.8</td>
			<td>11.7</td>
			<td>५०.८</td>
			<td>99.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>11.1</td>
			<td>४८.३</td>
			<td>९८.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.2</td>
			<td>11</td>
			<td>४७.५</td>
			<td>९६.१</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.6</td>
			<td>12.8</td>
			<td>51</td>
			<td>९९.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.7</td>
			<td>5.2</td>
			<td>14.7</td>
			<td>५१.९</td>
			<td>८९.५</td>
		</tr>
<tr>
<td>१.५</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.5</td>
			<td>४७.२</td>
			<td>९१.१</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8</td>
			<td>१.५</td>
			<td>11.3</td>
			<td>४८.४</td>
			<td>९६.८</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.6</td>
			<td>१३.९</td>
			<td>४९.७</td>
			<td>९८.९</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>1.1</td>
			<td>10.7</td>
			<td>४८.२</td>
			<td>९८.६</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>0.9</td>
			<td>10.3</td>
			<td>४९.४</td>
			<td>९९.४</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>17.2</td>
			<td>५२.३</td>
			<td>९७.५</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1</td>
			<td>3.5</td>
			<td>२०.८</td>
			<td>51</td>
			<td>९९</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.9</td>
			<td>10.7</td>
			<td>४९.६</td>
			<td>९८.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1.7</td>
			<td>10.9</td>
			<td>४७.७</td>
			<td>९६.३</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>10</td>
			<td>53</td>
			<td>९८</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>1.8</td>
			<td>12.9</td>
			<td>५७.९</td>
			<td>९४.१</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2</td>
			<td>1.4</td>
			<td>11.6</td>
			<td>४८.६</td>
			<td>९८.८</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: ठहराव की मापी BSA lysine succinylation अधिभोग के लिए 20 proteolytic succinylated पेप्टाइड्स. Succinylated से प्राप्त पेप्टाइड्स वाणिज्यिक पूर्व Succinylated BSA, निर्धारित प्रतिशत पर Succinylated (उदा, 0, 1, 10, 50, और 100%) । 20 proteolytic BSA पेप्टाइड्स में से प्रत्येक के लिए, उच्चतम क्रमित, MS2 टुकड़ा आयन अंतर lysine succinylation (Ksucc) अधिभोग की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में एल/(एल + एच)% में.

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Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

यहां, हम साइट के निष्पक्ष ठहराव-विशिष्ट प्रोटीन acetylation और/या succinylation अधिभोग (stoichiometry) एक पूरे proteome के ratiometric संशोधनों के एक अंतर्जात विश्लेषण के माध्यम से मात्रात्मक के बाद शुरू संशोधनों के लिए उपस्थित रासायनिक acylation प्रयोग गर्ने स्थिर आइसोटोप-त्यसपछि anhydrides. संवेदनशील डेटा के साथ संयोजन में स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री, सटीक साइट अधिभोग माप प्राप्त कर रहे हैं ।

ठहराव of Site-विशिष्ट प्रोटीन Lysine Acetylation और Succinylation Stoichiometry का उपयोग डाटा-स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री

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