Name: identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies
Uploaded: 2018-04-19T13:00:00
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Ringraziamo la sezione Imaging luce NIAMS per fornire i microscopi e aiuto tecnico. Gli anticorpi MF20 e Pax7 sono stati ottenuti da Developmental Studies Hybridoma Bank sviluppato sotto l'egida del NICHD e mantenuto dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale di NIAMS del National Institutes of Health.

In questo protocollo, i muscoli dell'arto anteriore di topi adulti (2-6 mesi), tibiale anteriore (TA) e longus di digitorum dell'estensore (EDL), sono stati impiegati ad esempio per eseguire l'immunofluorescenza che macchia il loro SCs. Tutte le fasi di movimentazione topi e muscolo dissezioni di tessuto sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di NIAMS/NIH.
1. sezionare il muscolo TA/EDL dal Mouse dell'arto
<ol><li>Eutanasia il mouse in una camera di eutanasia rie...

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

Il protocollo di cui sopra è stato basato su un metodo di macchiatura Pax7/MF20 su zebrafish muscolo scheletrico12. Le soluzioni utilizzate e bloccando i passaggi sono identici o simili. Gli anticorpi utilizzati sono identici. I passaggi regolati erano basati sulle caratteristiche del tessuto muscolare del mouse e SCs. In primo luogo, laminina anticorpo è stato aggiunto nel mix per aiutare a visualizzare e confermare la posizione di SCs. E ' stato particolarmente utile contare il numero di SCs a...

Muscolo scheletrico è composto di cellule multinucleate muscolo, chiamato miotubi, organizzato nelle miofibre, che generano la forza e i movimenti attraverso la contrazione. Più i muscoli scheletrici, ad eccezione di alcuni muscoli cranio-facciali, sono derivati da una struttura embrionale temporanea denominata un somite1. Le cellule del precursore miogenico delaminare dal somite epiteliali diventare mioblasti. Mioblasti ulteriormente differenziano in miociti che si fondono per diventare miotubi per formare multi-nucleate miofibre. Il processo di cui sopra è chiamato miogenesi ed è caratterizzato da temporaneamente-ha regolato il controllo dell'espressione genica. Precursori myogenic esprimono Pax3 e Pax7, mentre mioblasti esprimono MyoD e/o Myf5 e miociti express miogenina e miosine2,3. Crescita muscolare è un processo in cui myofibers diventano più grandi, incorporando più mionuclei in fibre esistenti (iperplasia) e da un aumento della fibra di muscolo dimensioni (ipertrofia)4. Durante la crescita muscolare, c'è una fonte sostenibile di cellule miogeniche che hanno proprietà di cellule staminali che possono differenziare e auto-rinnovarsi. Queste cellule sono chiamate cellule satelliti in base alla loro posizione fisica tra il sarcolemma (membrana cellulare delle miofibre) e la lamina basale5. SCs, vigorosamente, contribuire alla crescita muscolare nella fase giovanile (i prime 2-3 settimane di topi postnatali), ma diventano quiescenti nel muscolo adulto6di riposo. Notevolmente, possono essere ri-attivati in risposta al muscolo ferisce e differenziarsi in nuove cellule muscolari per la riparazione del muscolo danneggiato7.
Le proprietà delle cellule staminali rendono lo studio della SCs pertinenti per terapie di muscolo malattie8e biologia di base muscolare. Di conseguenza, è stato un'area di intensa ricerca negli ultimi decenni. Un tremendo progressi nella dissezione genetica e l'epigenetica di SCs9,10. Tecniche di isolamento e identificazione di SCs in situ sono stati sviluppati e ottimizzati lungo la strada11. Macchiatura immunofluorescente permette l'identificazione di SCs attraverso l'uso di anticorpi specifici, compreso quello per Pax7. Tuttavia, la scarsità e la piccola dimensione di SCs combinato con una forte auto-fluorescenza del tessuto muscolo scheletrico adulto rendering la visualizzazione impegnativo. Qui, descriviamo un protocollo di macchiatura immunofluorescente ottimizzato per il tessuto muscolare del mouse per Pax7 e basato su un metodo esistente per zebrafish muscolo12. Inoltre, un Laminin anticorpo marcato con un fluoroforo distinto è impiegato per identificare la lamina basale in cui si trovano la SCs. Questo protocollo permette costantemente la visualizzazione di SCs Pax7-positivo e precursori myogenic sotto condizioni fisiologiche tutti testate e stadi di sviluppo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62550-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco, Themo Fisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>0 1-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Citrate Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1860 cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart electronic pressure cooker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

L'immunofluorescenza è un metodo efficace che aiuta a identificare i diversi tipi di cellule su sezioni di tessuto. Al fine di studiare la popolazione di cella desiderata, anticorpi per gli indicatori delle cellule specifiche vengono applicati su sezioni di tessuto. Nel muscolo scheletrico adulto, le cellule satellite (SC) sono cellule staminali che contribuiscono alla rigenerazione e riparazione del muscolo. Pertanto, è importante visualizzare e tracciare la popolazione delle cellule satelliti in diverse condizioni fisiologiche. Nel muscolo scheletrico di riposo, SCs risiedono tra la lamina basale e la membrana plasmatica miofibre. Un indicatore comunemente usato per l'identificazione SCs i myofibers o nella coltura delle cellule è la proteina accoppiati casella Pax7. In questo articolo, è presentato un protocollo ottimizzato di Pax7 immunofluorescenza su sezioni del muscolo scheletrico che minimizza la colorazione aspecifica e sfondo. Un altro anticorpo che riconosce una proteina (laminina) della lamina basale è stato anche aggiunto per identificare i protocolli SCs. simile può essere utilizzato anche per eseguire doppio o triplo etichettatura con Pax7 e anticorpi per ulteriori proteine di interesse.

Seguendo i passi sopra, SCs possono essere visualizzati correttamente in adulto sezioni muscolari che riposa sotto un microscopio a fluorescenza (Figura 1). Anche se il tessuto di muscolo adulto ha una forte auto-fluorescenza in certo tipo di fibre, i coloranti di serie di Alexa luminosi in grado di superare il rumore di fondo e il segnale si distingue (Figura 1A, B; teste di freccia). La microscopia confocale de...

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Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

La precisa identificazione delle cellule satelliti è essenziale per lo studio delle loro funzioni in varie condizioni fisiologiche e patologiche. Questo articolo presenta un protocollo per identificare cellule satelliti su sezioni del muscolo scheletrico adulto tramite basati su immunofluorescenza colorazione.

Identificazione delle cellule satelliti del muscolo scheletrico dall'immunofluorescenza con Pax7 e Laminin anticorpi

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