Name: generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

بتأييد هذا العمل جزئيا بدعم معهد كوخ (الأساسية) 14051 P30-CA منحة من المعهد الوطني للسرطان، "الوطنية للمعاهد منحة الصحة" (CA206157-22 و GM118066) و "صندوق أبحاث السرطان الرخام كيرت" لآمون انجيليكا. آمون انجيليكا أيضا محقق من معهد هوارد هيوز الطبي ومؤسسة جلين "البحوث الطبية الحيوية". وكان تأييد س. س. الأمريكية الإيطالية السرطان مؤسسة (ع)، بزمالة في "أبحاث السرطان" من ماري كوري الإجراءات والرابطة الإيطالية لأبحاث السرطان (التحكيمية)، و "زمالة أبحاث السرطان كل خمس سنوات كي". وأيد م زمالة من معهد هوارد هيوز الطبي.

حالة الثقافة
كان مثقف هتيرت RPE-1 خط الخلية في تعديل النسر المتوسطة دولبيكو (جدول المواد) وتستكمل مع 10% "مصل بقرى الجنين" ومم 2 لتر-الجلوتامين 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين. كانت الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في بيئة هوميديفيد. وضعت البروتوكول هو موضح أدناه باستخدام أطباق 10 سم وجميع التفاصيل التقنية التي ذكرت تشير إلى تلك الأطباق. في حالة استخدام أطباق مختلفة، مقياس صعودا أو هبوطاً تبعاً لذلك.
1-التزامن بين الخلايا RPE-1
<ol><li>تستخدم الخلايا المذابة الطازجة التي لم تخضع لأكثر من 15 مقاطع لجميع التجارب. في يوم 1، ذوبان الجليد والاستغناء عن ~2.5-5.0 × 105 RPE 1 هتيرت الخلايا إلى طبق استنبات الأنسجة 10 سم. إضافة 8 مل متوسط النمو القياسية واحتضان بين عشية وضحاها. تحديد عدد الخلايا باستخدام عداد خلايا قياسية (مثل هيموسيتوميتير). ملاحظة: كثافة الخلية يشير إلى ظروف نمو الخلايا RPE-1. قد تختلف شروط النمو بين خطوط الخلايا المختلفة؛ النظر في تعديلها تبعاً لذلك.</li>
	<li>في اليوم 2، مزامنة الخلايا عند الحدود G1/S يسفط المتوسطة النمو المنتظم وإضافة متوسطة 8 مل تحتوي على thymidine 5 ملم. ملاحظة: قد تختلف تركيز التريتيوم وطول مدة العلاج عبر خطوط الخلايا المختلفة. فمن المستحسن لإجراء تجارب رائدة لتحديد أفضل الظروف للخلية خط (خطوط) لفحصها.</li>
	<li>في يوم 3، 24 ساعة بعد إضافة thymidine المتوسطة (الخطوة 1، 2)، الإفراج عن كتلة thymidine يسفط المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 8 مل متوسط النمو المنتظم وإرجاع لوحات للحاضنة.</li>
</ol>2-جيل أنيوبلويد الخلايا التي تدخل في نشاط Mps1 كيناز الانقسامية
<ol><li>في يوم 3، 6 ح بعد الإفراج عنهم من كتلة thymidine (الخطوة 1، 3؛ هذا حوالي 3-6 ح قبل دخول الخلايا الانقسام)، نضح متوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x واستبدال مع المتوسطة التي تحتوي على 500 نانومتر ريفيرسيني (مثبط Mps1). ملاحظة: الخلايا RPE-1 أدخل الانقسام ح 9-12 بعد thymidine،بالغسيل1011. ومع ذلك، تختلف حركية دورة الخلية بين خطوط الخلايا المختلفة. ولذلك، من الأهمية بمكان لتحديد تلك الحركية في تجارب رائدة بإجراء تحليل دورة الخلية بأساليب محددة (مثلاً، عن طريق قياس المحتوى عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية تحليل الحمض النووي). بالإضافة إلى ذلك، قد تختلف تركيز مثبط Mps1 العامل الأمثل بين خطوط الخلايا. قد نجحت تجارب سابقة باستخدام خلايا RPE1 باستخدام ريفيرسيني بتركيز عامل 500 نانومتر10،،من1112. فمن المستحسن لإجراء تجارب رائدة لتحديد تركيز الأمثل لخط الخلية لفحصها.</li>
	<li>في يوم 4، ح 12 بعد العلاج ريفيرسيني (حوالي 6 ح بعد أن كانت الخلايا في الانقسام)، نضح المتوسطة ريفيرسيني وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 8 مل المتوسطة النمو العادية إلى اللوحة وإرجاع الخلايا للحاضنة.</li>
</ol>3-إزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد والإثراء للسكان أركك
<ol><li>في يوم 6، حوالي 72 ساعة بعد إدخال الخلايا في الانقسام الأول (الخطوة 2، 2؛ هذا هو حوالي 66 ح وبعد ريفيرسيني المياه والصرف الصحي، الذي يتوافق مع حوالي الخلية 2-3 دورات) ونضح متوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x واستبدال مع المتوسطة التي تحتوي على 300 نانومتر نوكودازولي. ملاحظة: العمل الأخيرة قد أظهرت أن الخلايا RPE-1 إيواء كاريوتيبيس أنيوبلويد جينوميكالي غير مستقرة ووقف انتشارها حول دورة الخلية 2-3 بعد الانقسام الخاطئ الأول10. ومع ذلك، قد تختلف هذه الحركية بين خطوط الخلايا المختلفة. ولذلك، من الأهمية بمكان القيام بتجارب رائدة لتحديد التوقيت المناسب لإزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد.</li>
	<li>في يوم 7، ح 12 وبعد العلاج نوكودازولي، نضح المتوسطة وأضف 3 مل من 1 x برنامج تلفزيوني اللوحة. التخلص من الخلايا الانقسامية بالتنصت على الجانب من اللوحة. قم بتدوير اللوحة بين كل برنامج المشورة التقنية السماح بإزالة حتى الخلايا الانقسامية.</li>
	<li>لضمان الإزالة الكاملة للخلايا الانقسامية، كرر عملية اهتزاز قبالة لجولات متعددة (مستحسن) من 3-5 مرات، يسفط وإضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني س 1 بين كل جولة.</li>
	<li>بعد إيقاف اهتزاز، نضح بلطف أي سائل أن تلتزم بالغطاء أو حافة اللوحة. باختصار، تحقق من لوحة تحت مجهر بتكبير X 10. ضمان الالتزام بعدد قليل من الخلايا الانقسامية. إذا كان أكثر من خمس خلايا الانقسامية تعتبر تحت 10 X الهدف، كرر جولة أخرى من اهتزاز قبالة. ملاحظة: سوف تظهر مستدير الزوايا الخلايا الانقسامية وقد تكون منفصلة جزئيا بعد هزة قبالة. من الأهمية بمكان لضمان الإزالة الكاملة للخلايا الانقسامية قبل تعريض الخلايا للجولة التالية من العلاج نوكودازولي. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى موت الخلية الانقسامية و/أو يؤدي إلى توليد خلايا تيترابلويد.</li>
	<li>بعد اهتزاز النهائي، يغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. إضافة متوسطة 8 مل يحتوي على 330 نانومتر نوكودازولي في اللوحة واحتضانها ح 12.</li>
	<li>كرر نوكودازولي المعاملة/هزة-إيقاف (الخطوات 3.1 3.5) كل ح 12 حتى يتم ملاحظة لا الخلايا الانقسامية بعد الحضانة. وينصح عادة، 4-5 جولات من العلاج/هزة-إيقاف. ملاحظة: المعلومات المقدمة هنا الإشارة إلى خلايا RPE-1. قد يختلف عدد جولات من العلاج/هزة-إيقاف بين خطوط الخلايا المختلفة. لتجنب التعرض المطول وغير الضرورية إلى نوكودازولي من الأهمية بمكان لتحديد بدقة، في تجربة رائدة، عدد جولات المطلوبة لإزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد فعالة وكاملة.</li>
	<li>بعد 4-5 جولات من نوكودازولي العلاج/هزة-إيقاف (الخطوات 3.1-3.6)، أضف 10 مل متوسط النمو المنتظم واحتضان. السماح للخلايا للراحة ح 12-24 قبل استخدام التلاعب أو الفحص في المستقبل. ملاحظة: بعد اهتزاز النهائي، الخلايا المتبقية على اللوحة دورة الخلية اعتقال، وكما أظهرت مؤخرا10، ميناء كاريوتيبيس المعقدة. هذه الخلايا يشار إلى خلايا أركك (توقيف مع تناذر المعقدة). فمن المستحسن لإجراء فحوصات على السكان أركك خلال أسبوع عزلة.</li>
	<li>اختيارياً، لتقييم النسبة المئوية للخلايا المقبوض عليه مع كاريوتيبيس المعقدة، جمع وحساب عدد الخلايا من كل هزة-إيقاف استخدام عداد خلايا قياسية.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> رقم 1: التخطيطي العام للطريقة المستخدمة لتوليد وعزل الخلايا أنيوبلويد مع تناذر معقدة (أركك) وصور الممثل. (أ) الخلايا "أركك التخطيطي ل" بروتوكول الجيل والعزلة. (ب) صور الممثل RPE-1 هتيرت الخلايا في كل مرحلة من العلاج. ويمثل الفريق الأخير (المشار إليها باللون الأحمر) أركك الخلايا المعزولة. مقياس بار 100 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
4-وصف للسكان أركك
<ol><li>تأكيد نجاح عزل السكان أركك بإجراء الاختبارات التالية.<ol>
<li>تقويم بيتا-جالاكتوسيداسي تلطيخ (العلامة للشيخوخة) استخدام المتاحة تجارياً كيت (انظر الجدول للمواد).</li>
		<li>قياس إفراز السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل CCL2، باستخدام أدوات متوفرة تجارياً (انظر الجدول للمواد).</li>
		<li>وتؤكد زيادة مستويات دورة الخلية مثبطات p53، p21، p16 "الغربية لطخة". ملاحظة: للتحكم في هذه الاختبارات بشكل صحيح، يجب مقارنة السكان أركك إلى خلايا ركوب يوبلويد وأنيوبلويد على حد سواء. السابقة ومرور منخفضة، هتيرت RPE-1 البرية من نوع الخلايا المتزايدة أضعافاً مضاعفة. هذا الأخير يمكن الحصول على حمل كروموسوم سوء العزل في هتيرت RPE-1 وحصد الخلايا ح 72 بعد الانقسام الشاذة الأولى. للقيام بذلك، اتبع البروتوكول المذكورة أعلاه من الخطوة 1، 1 وحصاد الخلايا حق قبل المعالجة نوكودازولي الأولى (الخطوة 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>إجراء تسلسل خلية واحدة لتقييم تناذر الزنزانات المقبوض عليهم. ملاحظة: يسلسل خلية واحدة بطريقة راسخة لتحديد التغيرات الصبغية وشبه الصبغية عبر جمهرة خلايا في خلية مفردة مستوى13. يمكن الاطلاع على إجراءات تفصيلية لكيفية إجراء تسلسل خلية واحدة في أماكن أخرى10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح هذا الأسلوب رواية لتوليد وإثراء للخلايا المقبوض عليهم مع مجمع كاريوتيبيس (أركك) لدراسة الخلايا التي لديها كروموسوم المكاسب أو الخسائر متعددة، والكف عن تقسيم. قد تم تصميم إعداد أسلوب لتسهيل عزل خلايا أركك بطريقة سريعة وموثوق بها.
أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا التحليل هو السيطرة صرامة الجدول الزمني للعلاج من تعاطي المخدرات، والأهم من ذلك، إزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد. لتحقيق أفضل النتائج، توقيت العلاج نوكودازولي ويهز قبالة أهمية خاصة لضمان إزالة الخلايا الدراجات من اللوحة في حين أنها لا تزال مقربة والانقسامية، منع احتمال موت الخلية الانقسامية أو انزلاق إلى G1، يحتمل أن تكون تهيئة عدد سكان تيترابلويد. من غير المستحسن أن توقيت هزة قبالة ينحرف أكثر من ساعتين من حضانة الموصى به 12-ح نوكودازولي.
الدراسات المستقبلية في أركك الخلايا لديها القدرة على تيسير فهم أعمق لكيفية كاريوتيبيس معقدة تؤثر على فيزيولوجيا الخلية. على وجه الخصوص، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا أن خلايا الجهاز المناعي قادراً على التفاعل مع وإزالة المشغل محصنة من أركك الخلايا10. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر نقطة انطلاق ممتازة لتوصيف المزيد من الخلايا أركك، بما في ذلك توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إزالة المناعي في الخلايا تناظري ودراسة كيفية النمطان التحول وقد تجاوز هذا إليه المراقبة، مسألة جوهرية في الحقل14،15.

أخطاء عملية العزل الصبغي يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط تتميز بعدد الكروموسومات التي ليست متعددة لتكملة فرداني1،2،،من34. أنيوبلويد كاريوتيبيس مشغل النسخ المتماثل للتأكيد على أن يولد مزيدا من عدم الاستقرار المجيني5،6،،من78،،من910، يزيد تناذر التعقيد، وفي نهاية المطاف يؤدي إلى دورة الخلية اعتقال يتدنى من الخلايا10. وغرض الطريقة المعروضة هنا هو توليد وفصل هذه يتدنى من ركوب الدراجات الخلايا. عن طريق استخدام تقنيات زراعة الأنسجة غير مكلفة، يسهل هذا البروتوكول إلى العزلة وتوصيف للقبض على دورة الخلية خلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة. هذه الخلايا هي المشار إليها كخلايا أركك (توقيف مع تناذر معقدة) ونظرائهم ركوب يوبلويد كعناصر تحكم.
هذا البروتوكول هو الأول الذي سينشأ لهذا الغرض ويسمح بالعزل ودراسة المزيد من خطوط أركك بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على، فعل الشيخوخة والمرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري (ساسب)، على برو-التهابات ميزات، وقدرتها على التعامل مع الخلايا المناعية. الطريقة المعروضة هنا قد وضعت في الخلايا البشرية تناظري، مخلدة ولكن لم يتم اختباره في خطوط السرطان بعد. قد تكون بعض الخلايا المحولة غير مبال بدوره الخلية اعتقال بسبب قمع مسارات واحدة أو متعددة؛ ولذلك، ينبغي إجراء التحقق من الصحة كذلك في خطوط الخلايا الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="953">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:319px;">11995-073</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p53 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p21 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-6246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p16 antibody</td>
			<td style="width:311px;">BD</td>
			<td style="width:319px;">554079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:311px;">Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td style="width:319px;">9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&#160;</td>
			<td style="width:311px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:319px;">ARY005B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

كروموسوم سوء العزل يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط فيها خلايا إيواء عدد الكروموسومات غير متوازن. خطوط العديد من الأدلة تشير بقوة إلى أن انيوبلويدي مشغلات الجينوم عدم الاستقرار، وتوليد الخلايا مع كاريوتيبيس المعقدة التي وقف انتشار هذه الأسلحة في نهاية المطاف. عزل وتوصيف الخلايا التي تأوي كاريوتيبيس معقدة ذات أهمية حاسمة لدراسة أثر عدد الكروموسومات غير متوازن في فيزيولوجيا الخلية. وحتى الآن، تم إنشاء أية أساليب موثوق بها عزل هذه الخلايا أنيوبلويد. تقدم هذه الورقة وضع بروتوكول لتخصيب اليورانيوم وتحليل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة القياسية، وغير مكلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل العديد من الميزات من الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة، بما في ذلك النمط الظاهري المستحث الافرازية المرتبطة بالشيخوخة، وممتلكاتهم برو التحريضية، والقدرة على التفاعل مع الخلايا المناعية. لأن الخلايا السرطانية غالباً ما تأوي الاختلالات في عدد الكروموسوم، من الأهمية بمكان فك كيفية تأثير انيوبلويدي فسيولوجيا الخلية في الخلايا الطبيعية، مع الهدف النهائي المتمثل في الكشف عن كلا توموريجينيك برو ومكافحة إثارة.

هذا الأسلوب يستخدم نظام زراعة الأنسجة في المختبر لعزل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي وقف انتشارها. هذه الفئة من السكان يشار إلى خلايا أركك (توقيف مع كاريوتيبيس المعقدة). ويبين الشكل 1A مخطط التجربة. يتم مزامنتها عند الحدود G1/S مع thymidine RPE-1 الدراجات البرية من نوع هتيرت الخلايا وتعامل مع مثبط Mps1 للحث على كروموسوم سوء العزل. نوكودازولي السم المغزل يضاف إلى الخلايا ح 72 بعد تحريض كروموسوم سوء العزل. أدخل الانقسام ح 12 بعد العلاج نوكودازولي، أنيوبلويد الخلايا التي لا تزال قادرة على الانتشار ومحاصرون في هذه المرحلة دورة الخلية نتيجة للتدخل مع البلمرة microtubule. هذه المحاصرين ثم تتم إزالة الخلايا بسهولة بواسطة يهز قبالة لطيف. هو عملية اهتزاز قبالة المتكررة من 3-5 مرات ضمان الإزالة الكاملة لركوب الدراجات الخلايا. ويبين الشكل 1B الصور التمثيلية للخلايا RPE-1 في كل مرحلة من العلاج.
تعرض الخلايا أركك زيادة مستويات مثبطات دورة الخلية، مثل p53، p21، و p16 مقارنة يوبلويد وأنيوبلويد ركوب الدراجات الخلايا، كما هو موضح في الشكل 2 ألف. بالإضافة إلى ذلك، يظهر الشكل 2B β-جالاكتوسيداسي إيجابية تلطيخ في خلايا أركك بالمقارنة مع الخلايا التحكم يوبلويد، علامة راسخة للشيخوخة الخلوية.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> رقم 2: الممثل نتائج استخدام الخلايا أركك- ((أ)) وصمة عار الغربية تقييم مستويات المانع دورة الخلية في يوبلويد، أنيوبلويد ركوب الدراجات، والخلايا أركك. حددت مستويات p53، p21، و p16 بتحليل لطخة غربية. أكتين كعنصر تحكم تحميل. (ب) β-جالاكتوسيداسي تلطيخ تقييم مستوى الشيخوخة في الخلايا أركك. تم تحديد النشاط المرتبط بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (β-غال) في يوبلويد الخلايا والخلايا أركك. مقياس بار 100 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
هذا الاعتقال دورة الخلية سمة بارزة للخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة، كما يتضح من تحليل تناذر الممثل من خلية واحدة تسلسلها في الشكل 3، التي تعرض الخلايا أركك متعددة وعشوائية كروموسوم المكاسب والخسائر. وهذا الاستنتاج في اتفاق تام مع التقارير السابقة10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> الشكل 3: الممثل تسلسل خلية واحدة من الخلايا أركك- تقسيم قطع الأراضي تبين تناذر من ست خلايا أركك الممثل. إظهار تجزئة قطع عدد نسخ الكروموسومات جميع من 1 إلى س بالنسبة إلى مرجع يوبلويد في نطاق2 سجل (نوع البرية RPE-1 خط خلية مثنوية المنشأ الإناث). ويبرز الخسائر كروموسوم الأحمر والأخضر في المكاسب كروموسوم. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes at JoVE.com

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

انيوبلويدي يؤدي إلى عدم الاستقرار الجينوم، التي تنتج في النهاية القبض على دورة الخلية خلايا مع كاريوتيبيس المعقدة. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة وملائمة لعزل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تتوقف على تقسيم.

جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها الخلايا السامة للخلايا السامة لعلاج السرطان

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Generation of an Orthotopic Xenograft of Pancreatic Cancer Cells by Ultrasound-Guided Injection

Pancreatic cancer (PCa) represents one of the deadliest cancer types worldwide. The reasons for PCa malignancy mainly rely on its intrinsic malignant ...