Name: generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00
Duration: 5 min 22 s
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यह काम कोच संस्थान सहायता (कोर) अनुदान P30-CA १४०५१ राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा (CA206157-22 और GM118066) और रूखा संगमरमर कैंसर अनुसंधान कोष द्वारा एंजलिका आमोन के हिस्से में समर्थित किया गया था । एंजलिका आमोन भी हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान के एक अंवेषक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए ग्लेन फाउंडेशन है । एस. एस. अमेरिकी इतालवी कैंसर फाउंडेशन (एआईसीएफ) द्वारा, मैरी क्यूरी क्रियाएं और कैंसर रिसर्च के लिए इतालवी एसोसिएशन (AIRC) से कैंसर अनुसंधान में एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और एक KI Quinquennial कैंसर रिसर्च फैलोशिप द्वारा । E.M. हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था ।

कल्चरल कंडीशन
RPE-1 hTERT सेल लाइन Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (सामग्री की मेज) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 मिमी एल-glutamine, और १०० यू/एमएल पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक में संस्कृति थी । कोशिकाओं ३७ ° c में 5% सह एक humidified वातावरण में2 के साथ मशीन थे । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल 10-cm व्यंजन का उपयोग करके विकसित किया गया है और सभी तकनीकी जानकारी उन व्यंजनों का उल्लेख रिपोर्ट । यदि विभिंन व्यंजन का उपयोग कर, पैमाने ऊपर या तदनुसार नीचे ।
1. RPE-1 कोशिकाओं का तुल्यकालन
<ol><li>नए सिरे से गल चुके कक्षों का उपयोग करें, जो सभी प्रयोगों के लिए 15 से अधिक अंश नहीं आए हैं । 1 दिन पर, गल और वितरण ~ २.५-५.० x 105 RPE-1 hTERT कोशिकाओं में एक 10 सेमी टिशू कल्चर डिश । मानक विकास के 8 मिलीलीटर जोड़ें मध्यम और रात भर गर्मी । किसी मानक कक्ष काउंटर (जैसे कोई hemocytometer) का उपयोग करके कक्ष संख्या निर्धारित करें । नोट: सेल घनत्व RPE-1 कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति को दर्शाता है । विभिंन कक्ष रेखाओं के बीच वृद्धि की स्थिति भिंन हो सकती है; उन्हें तदनुसार समायोजित करने पर विचार करें ।</li>
	<li>2 दिन पर, नियमित विकास माध्यम aspirating द्वारा G1/S सीमा पर कोशिकाओं को सिंक्रनाइज़ और 5 मिमी thymidine युक्त 8 मिलीलीटर मध्यम जोड़ने । नोट: Thymidine एकाग्रता और उपचार की लंबाई विभिन्न सेल लाइनों के पार भिन्न हो सकता है । यह परीक्षण किया जा करने के लिए सेल लाइन (ओं) के लिए सबसे अच्छी स्थिति का निर्धारण करने के लिए पायलट प्रयोगों करने के लिए सलाह दी जाती है.</li>
	<li>3 दिन, thymidine मध्यम (चरण १.२) को जोड़ने के बाद 24 ज, thymidine ब्लॉक से aspirating मध्यम और वाशिंग कोशिकाओं द्वारा रिलीज 1x पंजाबियों के साथ तीन बार । नियमित विकास मध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें और मशीन के लिए प्लेटें वापस ।</li>
</ol>2. Mitotic कळेनासे Mps1 की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप करके Aneuploid कोशिकाओं की जनरेशन
<ol><li>3 दिन, 6 thymidine ब्लॉक से रिलीज के बाद ज (१.३ कदम; इस बारे में है 3-6 कक्ष बँटवारा दर्ज करने से पहले एच), महाप्राण माध्यम, 1x पंजाबियों के साथ एक बार धोने, और ५०० एनएम reversine (Mps1 अवरोधक) युक्त माध्यम के साथ बदलें । नोट: RPE-1 कक्ष thymidine वॉश आउट के बाद बँटवारा 9-12h में दर्जकरें10, 11. हालांकि, कक्ष चक्र कैनेटीक्स भिंन कक्ष रेखाओं के बीच भिंन होते हैं । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए पायलट प्रयोगों में उन कैनेटीक्स स्थापित तरीकों द्वारा सेल चक्र विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा निर्धारित (जैसे, FACS विश्लेषण के माध्यम से डीएनए सामग्री को मापने के द्वारा) । साथ ही, Mps1 अवरोधक के इष्टतम कार्यशील एकाग्रता कक्ष रेखाओं के बीच भिन्न हो सकते हैं । RPE1 कोशिकाओं का उपयोग कर पिछले प्रयोगों ५०० एनएम10,11,12की एक काम एकाग्रता में reversine का उपयोग सफल रहा है । यह परीक्षण किया जा करने के लिए सेल लाइन के लिए इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सलाह दी जाती है ।</li>
	<li>4 दिन पर, 12 reversine उपचार के बाद ज (के बारे में 6 कोशिकाओं का बँटवारा में थे के बाद), महाप्राण reversine मध्यम और धो कोशिकाओं 1x पंजाबियों के साथ तीन बार । थाली के लिए 8 मिलीलीटर नियमित विकास मध्यम जोड़ें और मशीन के लिए कोशिकाओं को वापस ।</li>
</ol>3. Aneuploid सायक्लिंग कोशिकाओं को हटाने और ArCK जनसंख्या के संवर्धन
<ol><li>6 दिन, के बारे में ७२ के बारे में एच कोशिकाओं के बाद पहले बँटवारा (कदम २.२; इस बारे में ६६ reversine धोने के बाद एच बाहर है, जो के बारे में 2-3 सेल चक्र के लिए मेल खाती है), महाप्राण माध्यम, 1x पंजाबियों के साथ एक बार धोने और माध्यम से की जगह ३०० एनएम nocodazole युक्त । नोट: हाल के काम से पता चला है कि RPE-1 aneuploid karyotypes बंदरगाह कोशिकाओं अस्थिर genomically है और पहले दोषपूर्ण बँटवारा के बाद 2-3 सेल चक्र के बारे में उनके प्रसार कोगिरफ्तार10 । हालांकि, यह कैनेटीक्स भिंन कक्ष पंक्तियों के बीच भिंन हो सकता है । इसलिए, यह aneuploid सायक्लिंग कोशिकाओं को हटाने के लिए उचित समय निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।</li>
	<li>7 दिन, nocodazole उपचार के बाद 12 ज, महाप्राण मध्यम और प्लेट के लिए 1x पंजाबियों के 3 मिलीलीटर जोड़ें । थाली की ओर दोहन से mitotic कोशिकाओं को हिला । mitotic कोशिकाओं को भी हटाने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक नल के बीच प्लेट घुमाएँ.</li>
	<li>mitotic कोशिकाओं को पूरा हटाने को सुनिश्चित करने के लिए, कई दौर (3-5 बार अनुशंसित), aspirating और प्रत्येक दौर के बीच 1x पंजाबियों के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए शेक बंद प्रक्रिया को दोहराने ।</li>
	<li>शेक के बाद, धीरे से किसी भी तरल कि ढक्कन या प्लेट के किनारे का पालन महाप्राण । संक्षेप में, 10x आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे प्लेट की जांच करें । सुनिश्चित करें कि कुछ mitotic कोशिकाओं मनाया जाता है । यदि पांच से अधिक mitotic कोशिकाओं को 10x उद्देश्य के तहत देखा जाता है, शेक का एक और दौर बंद दोहराएं । नोट: Mitotic कोशिकाओं गोल दिखाई और आंशिक रूप से हिला-बंद के बाद अलग किया जा सकता है । यह nocodazole उपचार के अगले दौर के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से पहले mitotic कोशिकाओं को पूरा हटाने सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । ऐसा करने में विफलता mitotic कोशिका मृत्यु और/या tetraploid कोशिकाओं की पीढ़ी में परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।</li>
	<li>अंतिम शेक के बाद, 1x पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें । 8 मिलीलीटर ३३० समुद्री मील की nocodazole युक्त मध्यम प्लेट में जोड़ें और 12 एच के लिए मशीन ।</li>
	<li>दोहराएं nocodazole उपचार/शेक-बंद (कदम ३.१-३.५) हर 12 h जब तक कोई mitotic कोशिकाओं को मशीन के बाद मनाया जाता है । आमतौर पर, उपचार के 4-5 दौर/ नोट: यहां दी गई जानकारी RPE-1 कक्षों को संदर्भित करते हैं । उपचार/शेक-ऑफ़ के राउंड की संख्या भिंन कक्ष रेखाओं के बीच भिंन हो सकती है । nocodazole करने के लिए लंबे समय तक और अनावश्यक जोखिम से बचने के लिए यह ध्यान से निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक पायलट प्रयोग में, aneuploid सायक्लिंग कोशिकाओं के कुशल और पूर्ण हटाने के लिए आवश्यक दौर की संख्या ।</li>
	<li>nocodazole उपचार के 4-5 दौर के बाद/शेक बंद (चरण ३.१-३.६), नियमित विकास मध्यम और मशीन के 10 मिलीलीटर जोड़ें । भविष्य में हेरफेर या परख उपयोग करने से पहले कोशिकाओं 12-24 ज के लिए आराम करने की अनुमति दें । नोट: अंतिम हिलाने के बाद, प्लेट पर शेष कोशिकाओं को गिरफ्तार कर लिया सेल चक्र कर रहे हैं और, के रूप में हाल ही में दिखाया गया है10, बंदरगाह परिसर karyotypes. इन कक्षों को ArCK (जटिल कैरयोटाइप के साथ पकडे गए) कक्षों के रूप में संदर्भित किया जाता है. यह अलगाव के एक सप्ताह के भीतर ArCK आबादी पर परख प्रदर्शन की सलाह दी जाती है ।</li>
	<li>वैकल्पिक रूप से, जटिल karyotypes के साथ गिरफ्तार किए गए कक्षों के प्रतिशत का आकलन करने के लिए, मानक कक्ष काउंटर का उपयोग करके प्रत्येक शेक-ऑफ़ से कक्षों को एकत्रित और गणना करें.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> चित्र 1: जटिल कैरयोटाइप (ArCK) और प्रतिनिधि छवियों के साथ aneuploid कोशिकाओं को उत्पन्न और अलग करने के लिए प्रयुक्त विधि का समग्र योजनाबद्ध. (क) ArCK कोशिकाओं के उत्पादन और अलगाव प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । (ख) उपचार के प्रत्येक चरण में RPE-1 hTERT कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों । अंतिम पैनल (लाल रंग में उल्लिखित) अलग ArCK कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार १०० µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
4. ArCK जनसंख्या का लक्षण वर्णन
<ol><li>निंनलिखित परख प्रदर्शन से ArCK जनसंख्या के सफल अलगाव की पुष्टि करें ।<ol>
<li>गधों बीटा-galactosidase धुंधला (वार्धक्य के मार्कर) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग (सामग्री की तालिका देखें).</li>
		<li>CCL2 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के स्राव को मापने, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट को रोजगार के द्वारा (सामग्री की तालिका देखें).</li>
		<li>सेल चक्र अवरोधकों p53, p21, पश्चिमी दाग से p16 के स्तर में वृद्धि की पुष्टि करें । नोट: इन परख को ठीक से नियंत्रित करने के लिए, ArCK आबादी दोनों euploid और aneuploid सायक्लिंग कोशिकाओं की तुलना में होना चाहिए । पूर्व कम मार्ग है, जंगली प्रकार RPE-1 hTERT कोशिकाओं तेजी से बढ़ रही है । बाद गुणसूत्र एमआईएस-अलगाव RPE-1 hTERT और संचयन कोशिकाओं ७२ ज में पहली ंयायपालिका बँटवारा के बाद उत्प्रेरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । ऐसा करने के लिए, चरण १.१ से ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें और ठीक पहले nocodazole उपचार (चरण ३.१) से पहले फसल कोशिकाओं ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>गिरफ्तार किए गए कक्षों की कैरयोटाइप का आकलन करने के लिए एकल-कक्ष sequencing निष्पादित करें । नोट: एकल-कक्ष अनुक्रमण एकल कक्ष स्तर13पर किसी कक्ष की जनसंख्या में गुणसूत्र और sub-गुणसूत्र परिवर्तन निर्धारित करने के लिए एक सुस्थापित पद्धति है । एकल-कक्ष अनुक्रमण करने के लिए विस्तृत कार्यविधियां कहीं10पाया जा सकता है ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस उपंयास विधि को उत्पंन करने और जटिल karyotypes (ArCK) के साथ गिरफ्तार कोशिकाओं के लिए समृद्ध कोशिकाओं है कि कई गुणसूत्र लाभ या हानि और विभाजन के लिए संघर्ष किया है के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । विधि सेटअप एक त्वरित और विश्वसनीय तरीके से ArCK कोशिकाओं के अलगाव की सुविधा के लिए डिजाइन किया गया है ।
इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम कड़ाई से नशीली दवाओं के उपचार की समयरेखा को नियंत्रित करने और सबसे महत्वपूर्ण बात, aneuploid सायक्लिंग कोशिकाओं को हटाने । इष्टतम परिणामों के लिए, nocodazole उपचार के समय और शेक बंद विशेष महत्व का है सुनिश्चित करने के लिए कि साइकिल चालन कोशिकाओं थाली से हटा रहे हैं, जबकि वे अभी भी गोल और mitotic हैं, G1 में mitotic कोशिका मृत्यु या फिसलन की संभावना को रोकने, संभावित रूप से एक tetraploid जनसंख्या बना रहा है । यह अनुशंसित नहीं है कि शेक के समय की सिफारिश की 12-एच nocodazole की मशीन से दो घंटे से अधिक विचलित ।
ArCK कोशिकाओं पर भविष्य के अध्ययन के लिए कैसे जटिल karyotypes कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित की गहरी समझ को सुविधाजनक बनाने की क्षमता है । विशेष रूप से, एक ताजा अध्ययन में दिखाया गया है कि प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं के साथ बातचीत और ArCK कोशिकाओं के प्रतिरक्षा मंजूरी ट्रिगर करने में सक्षम हैं10. विधि यहां वर्णित ArCK कोशिकाओं के आगे लक्षण वर्णन के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है, आणविक unट्रांस्फ़ॉर्म कोशिकाओं और कैसे oncogenic परिवर्तन के अध्ययन में निहित प्रतिरक्षा मंजूरी तंत्र के स्पष्टीकरण सहित इस निगरानी तंत्र,14,15क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण सवाल बाईपास कर सकते हैं ।

गुणसूत्र अलगाव की प्रक्रिया में त्रुटियों aneuploidy करने के लिए नेतृत्व, एक हालत एक गुणसूत्र संख्या है कि अगुणित के एक से अधिक नहीं है की विशेषता1,2,3,4। Aneuploid karyotypes ट्रिगर प्रतिकृति तनाव है कि आगे जीनोमिक अस्थिरता उत्पन्न करता है5,6,7,8,9,10, बढ़ाता है कैरयोटाइप जटिलता, और अंत में कोशिकाओं की एक उपआबादी के सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए सुराग10. यहाँ प्रस्तुत विधि का उद्देश्य ऐसी उपआबादी को साइकल कोशिकाओं से उत्पन्ना और पृथक करना है. सस्ती ऊतक संस्कृति तकनीक को रोजगार से, इस प्रोटोकॉल अलगाव और सेल चक्र के लक्षण वर्णन की सुविधा-जटिल karyotypes के साथ aneuploid कोशिकाओं को गिरफ्तार किया । इन कोशिकाओं को ArCK के रूप में संदर्भित किया जाता है (जटिल कैरयोटाइप के साथ गिरफ्तार) कोशिकाओं और नियंत्रण के रूप में उनके euploid सायक्लिंग समकक्षों ।
इस प्रोटोकॉल पहले एक इस प्रयोजन के लिए स्थापित किया जा रहा है और अलगाव और सहित ArCK लाइनों के आगे के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, लेकिन सीमित नहीं है, उनके प्रेरित वार्धक्य और वार्धक्य-एसोसिएटेड स्रावी phenotype (SASP), उनके समर्थक भड़काऊ सुविधाओं, और उनके प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संलग्न करने की क्षमता । यहाँ प्रस्तुत पद्धति को विपरिवर्तित, नश्वर मानव कोशिकाओं में विकसित किया गया है लेकिन अभी तक कैंसर लाइनों में परीक्षण नहीं किया गया है. कुछ रूपांतरित कोशिकाओं को सेल चक्र एक या कई रास्ते के दमन के कारण गिरफ्तारी के प्रति असंवेदनशील हो सकता है; इसलिए, आगे की मांयता अंय कक्ष पंक्तियों में किया जाना चाहिए ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="953">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium)&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:319px;">11995-073</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reversine</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>10004412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nocodazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p53 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p21 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:319px;">sc-6246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Anti-p16 antibody</td>
			<td style="width:311px;">BD</td>
			<td style="width:319px;">554079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td style="width:311px;">Cell Signaling Technology&#160;</td>
			<td style="width:319px;">9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&#160;</td>
			<td style="width:311px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:319px;">ARY005B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

गुणसूत्र एमआईएस-अलगाव aneuploidy, एक शर्त है जो कोशिकाओं में एक असंतुलित गुणसूत्र संख्या बंदरगाह की ओर जाता है । सबूत के कई लाइनें दृढ़ता से संकेत मिलता है कि aneuploidy जीनोम अस्थिरता से चलाता है, अंततः जटिल karyotypes है कि उनके प्रसार को गिरफ्तार करने के साथ कोशिकाओं पैदा । अलगाव और जटिल karyotypes बंदरगाह कोशिकाओं के लक्षण वर्णन कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान पर एक असंतुलित गुणसूत्र संख्या के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । तिथि करने के लिए, कोई विधियां मज़बूती से ऐसे aneuploid कोशिकाओं को अलग करने के लिए स्थापित किया गया है । इस पेपर संवर्धन और जटिल मानक, सस्ती ऊतक संस्कृति तकनीक का उपयोग karyotypes के साथ aneuploid कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल उनके प्रेरित वार्धक्य-जुड़े स्रावी phenotype, समर्थक भड़काऊ गुणों, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता सहित जटिल karyotypes के साथ aneuploid कोशिकाओं की कई सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । क्योंकि कैंसर की कोशिकाओं अक्सर गुणसूत्र संख्या में असंतुलन बंदरगाह, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कैसे aneuploidy प्रभावों कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान सामांय कोशिकाओं में, दोनों अपने समर्थक और विरोधी tumorigenic प्रभाव को उजागर करने के अंतिम लक्ष्य के साथ ।

इस विधि में एक इन विट्रो ऊतक संस्कृति प्रणाली जटिल karyotypes कि उनके प्रसार को गिरफ्तार करने के साथ aneuploid कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल करता है । इस जनसंख्या ArCK (जटिल Karyotypes के साथ गिरफ्तार) कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है । चित्र 1a प्रयोग की योजना दिखाता है । जंगली प्रकार सायक्लिंग RPE-1 hTERT कोशिकाओं thymidine के साथ G1/एस सीमा पर सिंक्रनाइज़ कर रहे है और एक Mps1 अवरोधक के साथ इलाज गुणसूत्र एमआईएस अलगाव प्रेरित । धुरी जहर nocodazole गुणसूत्र एमआईएस-अलगाव की प्रेरण के बाद कोशिकाओं ७२ ज में जोड़ा जाता है । 12 ज nocodazole उपचार के बाद, aneuploid कोशिकाओं है कि अभी भी पैदा करना का बँटवारा दर्ज करने में सक्षम हैं और microtubule बहुलकीकरण के साथ हस्तक्षेप के कारण इस कोशिका चक्र अवस्था में फंस रहे हैं. ये फँसे कोशिकाएँ तो कोमल हिला-बंद करके आसानी से निकल जाती हैं. साइकिलिंग सेल को पूरी तरह से हटाने के लिए शेक-ऑफ प्रोसेस 3-5 बार दोहराया जाता है । चित्रा 1b उपचार के प्रत्येक चरण में RPE-1 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है ।
ArCK कक्ष कक्ष चक्र अवरोधकों, जैसे p53, p21, और p16 euploid और aneuploid साइकलिंग कक्षों की तुलना में, चित्र 2aमें दर्शाए गए के स्तर को प्रदर्शित करते हैं । इसके अतिरिक्त, चित्रा b ' euploid नियंत्रण कोशिकाओं, सेलुलर वार्धक्य के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर की तुलना में ArCK कोशिकाओं में सकारात्मक β-galactosidase धुंधला दिखाता है ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> चित्रा 2: प्रतिनिधि परिणाम ArCK कोशिकाओं का उपयोग. (क) पश्चिमी दाग euploid, aneuploid सायक्लिंग, और ArCK कोशिकाओं में सेल चक्र अवरोधक स्तरों का आकलन । p53, p21, और p16 के स्तर पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किए गए थे । Actin एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य किया । (ख) β-galactosidase धुंधला ArCK कोशिकाओं में वार्धक्य के स्तर का आकलन । वार्धक्य-संबद्ध β-galactosidase (β-Gal) गतिविधि euploid कक्षों और ArCK कक्षों में निर्धारित किया गया था । स्केल बार १०० µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
इस सेल चक्र गिरफ्तारी जटिल karyotypes के साथ aneuploid कोशिकाओं की एक प्रमुख विशेषता है, के रूप में चित्रा 3में एकल सेल अनुक्रमण से प्रतिनिधि कैरयोटाइप विश्लेषण द्वारा दिखाया गया है, जिसमें ArCK कोशिकाओं एकाधिक, यादृच्छिक गुणसूत्र लाभ और नुकसान प्रदर्शित करते हैं । यह खोज पिछले रिपोर्ट्स10के साथ पूर्ण अनुबंध में है ।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> चित्र 3: ArCK कक्षों के प्रतिनिधि एकल-कक्ष अनुक्रमण. फॉल्ट दर्शाने वाले भूखंड छह प्रतिनिधि ArCK कक्षों की कैरयोटाइप दिखा रहे हैं । फॉल्ट भूखंडों एक लॉग पर एक euploid संदर्भ के सापेक्ष 1 से एक्स के सभी गुणसूत्रों की प्रतिलिपि संख्या दिखाने के लिए2 स्केल (वाइल्ड टाइप RPE-1 महिला मूल की एक द्विगुणित कोशिका रेखा है) । गुणसूत्र लाभ लाल में प्रकाश डाला जाता है, हरे रंग में गुणसूत्र नुकसान । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Aneuploidy जीनोम अस्थिरता है, जो अंततः कोशिका चक्र-गिरफ्तार जटिल karyotypes के साथ कोशिकाओं का उत्पादन होता है । यह पेपर जटिल karyotypes के साथ aneuploid कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है जो विभाजित करने के लिए संघर्ष ।

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