Name: in vivo fiber-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pcle) of hippocampal capillaries in awake mice
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice at JoVE.com

이 프로젝트는 미국 간질 학회(American Epilepsy Society)의 연구 이니셔티브 상(Research Initiative Award)과 애리조나 생물의학 연구 위원회(Arizona Biomedical Research Commission)의 S.L.M. 상, SUNY 다운스테이트 보건 과학 대학(SUNY Downstate Health Sciences University)의 안과에 대한 실명 예방 연구(Research to Prevent Blindness Inc.)의 챌린지 보조금, 뉴욕주 엠파이어 혁신 프로그램(New York State Empire Innovation Program)의 자금 지원을 받았습니다. 미국 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614), 배로우 신경학 재단(Barrow Neurological Foundation), 마리안 로셸(Marian Rochelle), 그레이스 웰튼(Grace Welton), 디그니티 헬스 시드(Dignity Health SEED) 상, 국립과학재단(National Science Foundation, 0726113, 0852636, & 1523614) 및 국립보건원(National Institute of Health, R01EY031971 및 R01CA258021)의 연방 보조금, S.L.M 및 S.M.C<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">.이 작업은 또한 국방부 보건 담당 차관보실의 지원을 받았습니다. W81XWH-15-1-0138, S.L.M.<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: red; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;"> 에<span lang="EN-US" style="font-size: 12pt; line-height: 107%; font-family: Calibri, sans-serif; color: rgb(34, 34, 34); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">L.-C.는 스페인 교육부의 José Castillejo 펠로우십의 지원을 받았습니다. 기술적 조언과 도움을 주신 O. Caballero와 M. Ledo에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 NIH Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals를 따릅니다. 모든 절차는 Barrow Neurological Institute의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 개두술을 위한 입체 위치 지정
<ol><li>무게를 잰 다음 케타민-자일라진(100mg/kg–10mg/kg i.p.) 칵테일로 마우스를 마취합니다. 꼬리 및/또는 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 관찰하여 동물이 완전히 마취되었는...

<ol>
	<li>Denk, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+functional+imaging+of+neurons+using+2-photon+laser+scanning+microscopy.">Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 54 (2), 151-162 (1994).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+High-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals.">A miniature head-mounted two-photon microscope. High-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903 (2001).</li><li>Chaigneau, E., Oheim, M., Audinat, E., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+capillary+blood+flow+in+olfactory+bulb+glomeruli.">Two-photon imaging of capillary blood flow in olfactory bulb glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13081-13086 (2003).</li><li>Larson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+quantum+dots+for+multiphoton+fluorescence+imaging+in+vivo.">Water-soluble quantum dots for multiphoton fluorescence imaging in vivo.</a> Science. 300, 1434-1436 (2003).</li><li>Hirase, H., Creso, J., Singleton, M., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+brain+pericytes+in+vivo+using+dextran-conjugated+dyes.">Two-photon imaging of brain pericytes in vivo using dextran-conjugated dyes.</a> Glia. 46, 95-100 (2004).</li><li>Hirase, H., Creso, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+level+imaging+of+local+cerebral+blood+flow+in+bicuculline-induced+epileptic+foci.">Capillary level imaging of local cerebral blood flow in bicuculline-induced epileptic foci.</a> Neuroscience. 128, 209-216 (2004).</li><li>Schaffer, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cortical+surface+microvessels+reveals+a+robust+redistribution+in+blood+flow+after+vascular+occlusion.">Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion.</a> PLoS Biology. 4, 22 (2006).</li><li>Leal-Campanario, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Capillary+Vasodynamics+Contribute+to+Ictal+Neurodegeneration+in+Epilepsy.">Abnormal Capillary Vasodynamics Contribute to Ictal Neurodegeneration in Epilepsy.</a> Scientific Reports. 7, 43276 (2017).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443, 700-704 (2006).</li><li>Yemisci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15, 1031-1037 (2009).</li><li>Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+capillaries+are+contractile+in+vivo,+but+arterioles+mediate+functional+hyperemia+in+the+mouse+brain.">Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22290-22295 (2010).</li><li>Leal-Campanario, R., Alarcon-Martinez, L., Martinez-Conde, S., Calhoun, M., Macknik, S., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+Flow+Analysis+in+Epilepsy+Using+a+Novel+Stereological+Approach.">Blood Flow Analysis in Epilepsy Using a Novel Stereological Approach.</a> Neurostereology: Unbiased Stereology of Neural Systems. , (2013).</li><li>Smart, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+K(V)1.1+potassium+channel+causes+epilepsy+in+mice.">Deletion of the K(V)1.1 potassium channel causes epilepsy in mice.</a> Neuron. 20, 809-819 (1998).</li><li>Zuberi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+human+voltage-gated+potassium+channel+gene+(Kv1.1)+associates+with+episodic+ataxia+type+1+and+sometimes+with+partial+epilepsy.">A novel mutation in the human voltage-gated potassium channel gene (Kv1.1) associates with episodic ataxia type 1 and sometimes with partial epilepsy.</a> Brain. 122, 817-825 (1999).</li></ol>

우리는 깨어 있는 쥐에서 전기생리학 및 광섬유 pCLE 실험을 동시에 수행할 수 있는 헤드 캡 구속 시스템을 개발하여 마취제로 인한 잠재적인 반응 오염을 줄였습니다. 헤드 캡과 장착 장치는 구성이 간단하며 만성 각성 행동 이미징 실험에 재사용할 수 있습니다. 생체 내 현미경 혈류 영상(TPLSM)의 황금 표준과 비교하여 기록의 품질을 확인했습니다.
여기에 설명된 프로토콜을 ...

다른 현미경 이미징 방법(1,2,3,4,5,6,7,8)과 달리, 생체 내 광섬유 기반 컨포칼 현미경은 모든 뇌 영역, 모든 깊이에서 고속(시야 크기에 따라 최대 240Hz)으로 혈류 역학을 측정할 수 있습니다9). 광섬유 프로브는 프로브의 팁(5000-6000개의 3μm 직경의 개별 섬유 번들로 구성된 렌즈 없는 대물렌즈)이 관심 형광 대상의 15μm 이내에서 미세 전극의 정확도로 배치될 수 있기 때문에 3μm 해상도에서 생체 내 컨포칼 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 합니다. in vivo two-photon imaging과 마찬가지로, 형광단은 이미징 타겟에 미리 도입되어야 합니다. 예를 들어, 플루오레세인 덱스트란(또는 퀀텀닷)을 혈관 조직에 주입하거나, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질을 세포에 transfection하거나, Oregon Green BAPTA-1과 같은 형광 염료를 이미징 전에 세포에 벌크 로딩할 수 있습니다.
이러한 기법을 이용한 최근 연구에서는 발작 중 벽화 세포의 위치에서 발생하는 갑작스러운 수축인 외측 모세혈관 경련(ictal capillary vasospasm)9을 유발하는 벽체 세포 운동 활동이 전골 해마(ictal hippocampus)9의 신경 퇴화에 기여할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 이전의 이미징 연구는 약물 적용과 관련된 in vitro 및 in vivo pericyte constrictings를 보여주었지만 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al.은 쥐 뇌에서 생체 내 자발적 모세혈관 수축의 첫 번째 증거를 발견했습니다. 인간 측두엽 간질과의 관련성을 확립하기 위해, 그들은 인간 일시적 운동 실조증 유형 1 15의 유전 모델인 수컷(P30-40세) 녹아웃(KO) Kv1.1(kcna1-null) 마우스14,15(JAX stock #003532)를 연구했다. pericyte는 자발적 간질을 하는 동물과 야생형(WT) 새끼에서 병리학적 및 생리학적 해마 벽화 혈관 수축(vasopcontractions)9을 유도했다. 이러한 관찰은 카이닌산으로 간질에 걸린 WT 동물에서 복제되었으며, 따라서 다른 형태의 간질에 대한 일반화를 나타냅니다. Leal-Campanario 등은 또한 새로운 입체학적 현미경 접근 방식을 사용하여 간질 동물의 세포사멸(건강하지는 않음) 뉴런이 해마 미세혈관에 공간적으로 결합되어 있음을 확인했습니다. 흥분독성은 혈관구조와 공간적 연관성이 알려져 있지 않기 때문에, 이 결과는 비정상적인 모세혈관 혈관 경련성 허혈 유발 저산소증이 간질의 신경 퇴행에 기여한다는 것을 나타냈다. 그림 1은 일반 설정의 개략도를 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.7 mm diameter burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td>For Screws No. 19010-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9 mm diameter burr</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19007-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS</td>
			<td>from Handpiece solution</td>
			<td>AEU12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bull dog serrifine clump</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVizio dual band</td>
			<td>Mauna Kea Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVizio single band</td>
			<td>Mauna Kea Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microprobe 300 microns (Serie S)</td>
			<td>Mauna Kea Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made alignment piece</td>
			<td>L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made mounting bar</td>
			<td>The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 - 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive-Super Glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuraLay Inlay Resin &#8211; Standard Package</td>
			<td>Reliance Dental Mfg Co.</td>
			<td>602-7395 (from patterson dental)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fillister Head, Slotted Drive, M1.6x0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw</td>
			<td>MSC industrial direct co.</td>
			<td>2834117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD)</td>
			<td>Invitrogen, USA</td>
			<td>D7137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey smooth needle holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalt suture needle 3/8 curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12050-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab standard stereotaxic, rat and mouse</td>
			<td>Stoelting Co. 51704</td>
			<td>51670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methocel 2%</td>
			<td>Omnivision GmbH</td>
			<td>PZN: 04682367</td>
			<td>Eye ointment to prevent dryness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse</td>
			<td>CWE Inc.</td>
			<td>08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhysioTel F20-EET transmitters</td>
			<td>DSI</td>
			<td>270-0124-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT</td>
			<td>Stoelting Co.C13</td>
			<td>51704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sel-Tapping bone screws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic</td>
			<td>Stoelting Co</td>
			<td>51648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread - Braided Silk/Size 4/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue separating microspatula</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10091-121</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo fiber-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pcle) of hippocampal capillaries in awake mice

이 프로토콜의 목표는 벽화 세포에 의해 구동되는 발작 중 모세관 혈류 효과를 설명하기 위한 특정 응용 분야에서 광섬유 번들 결합 전임상 컨포칼 레이저 스캐닝 내현미경(pCLE)을 설명하는 것입니다. 시험관 내 및 생체 내 피질 영상은 pericyte에 의해 유발되는 모세혈관 수축이 건강한 동물의 기능적 국소 신경 활동뿐만 아니라 약물 적용으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서는 pCLE를 사용하여 모든 조직 깊이(특히 해마)에서 간질의 신경 퇴행에서 미세혈관 역학의 역할을 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 신경 활동에 대한 마취제의 잠재적인 부작용을 해결하기 위해 깨어 있는 동물의 pCLE를 기록하도록 조정된 머리 구속 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법을 사용하여 뇌의 심부 신경 구조에서 몇 시간에 걸쳐 전기 생리학 및 영상 기록을 수행할 수 있습니다.

우리는 발작의 결과로 발생하는 해마의 비정상적인 세포 주위 모세혈관 혈관 경련이 ictal 초점 9,13에서 세포 사멸에 기여하는 솔직한 저산소증을 유발할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 이러한 방법을 개발했습니다.
헤드 캡의 개발과 적절한 설치는 기록에 높은 안정성을 제공하여 ictal 및 interictal 기간 동안 야생형 및 간질성 각성...

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In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy pCLE of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

다광자 이미징은 조직 표면의 제한된 깊이에서만 효과적이지만 pCLE를 통해 모든 깊이에서 3μm 해상도의 이미징을 달성할 수 있습니다. 여기에서는 ictal 및 야생형 마우스의 해마에서 미세혈관 역학을 측정하기 위해 pCLE 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

깨어 있는 마우스의 해마 모세혈관의 In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE)

The goal of this protocol is to describe fiber-optic-bundle-coupled pre-clinical confocal laser-scanning endomicroscopy (pCLE) in its specific application ...

이 프로토콜을 통해 컨포칼 레이저 스캐닝 광섬유 내시경을 사용하여 깨어 있거나 상대적으로 마취된 동물의 뇌 깊이에 있는 신경 구조에서 몇 시간 동안 생체 내에서 동시 이미징 및 전기 생리학적 기록을 수행할 수 있었습니다. 우리는 이전에 전기 생리학적 기록에 사용되었던 것과 같은 방법을 사용하여 깨어 있는 동물의 뇌 심부 영상을 가능하게 하는 통증 없는 구속 방법을 개발했습니다. 이 방법은 간질 및 연령 관련 황반 변성의 설치류 모델에서 기능적 혈관 이상을 연구하는 데 사용되었습니다.질병의 대부분의 장기는 아니더라도 많은 곳에서 혈류 병리학의 기여도를 평가하는 실행 가능한 기술입니다. 이 기술은 뇌의 혈류 역학을 실시간으로 연구하기 위해 개발되었지만 생체 내 망막의 혈류를 연구하는 데 사용했습니다. 신경 조직의 혈관 연구에만 국한되지 않습니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 우수한 기술자인 Jose Maria Gonzalez Martin입니다. 꽃잎 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후 치아를 물린 막대의 구멍 안에 넣고 쥐의 머리를 설치류 입체 프레임에 고정시킵니다. 코 cl을 조입니다.amp 꼭 맞을 때까지.몸의 위치는 가능한 한 직선이어야 합니다. 턱 홀더 커프가 있는 이어 바를 사용하여 두개골의 접합 과정이 cl 내에 있도록 머리를 고정합니다.amp. 두피를 세척 및 소독한 후 두개골 기저부에서 두개골 정중선을 따라 눈 사이까지 정중선을 따라 12-15mm를 절개하고 28mm 불독 세레파인 클램프 4개를 사용하여 두피의 경계를 수축시켜 두개골을 노출시키고 작업 영역을 최대화합니다.골막을 절개 부위 가장자리까지 긁어내고 두개골 윗부분을 말립니다. 브레그마 뒤쪽의 모든 거리에서 두개골의 높이를 측정하고 두개골 양쪽의 정중선에서 측면으로 두 개의 동일한 거리를 측정합니다. 표적 지점인 오른쪽 해마를 입체 지도책의 도움으로 식별합니다.두개골에서 스테레오택스를 사용하여 브레그마를 기준으로 한 표적점 좌표를 찾고 수술용 마커를 사용하여 해마 바로 위의 표적점을 중심으로 1.4 x 2mm 이미징 창의 네 모서리를 표시합니다. 수술 마커를 사용하여 왼쪽 상단 두정골 위에 추가 표시를 하고 뼈 나사에 대해 오른쪽 전두골 위에 또 다른 표시를 그립니다. 마커를 사용하여 정중선의 양쪽에 1mm씩 그리고 람다 뒤 1mm의 정중선에 점 하나를 그려 경막외 EEG 기록 전극 삽입 지점을 나타냅니다.헤드 캡을 설치하려면 치과용 드릴에 직경 0.7mm의 버를 장착하고 뼈 나사 배치 지점에서 두개골에 두 개의 작은 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 다음으로 70-80% 에탄올 멸균 4mm 0.85 직경의 스테인리스 스틸 홈이 있는 뼈 나사를 각 구멍에 넣고 나사 끝이 뼈 바닥을 넘어 두개골강으로 튀어나오지 않도록 주의합니다. 그런 다음 입체 장치에 장착된 마이크로 드라이브에 고정된 L자형 맞춤형 정렬 조각을 사용하여 정중선을 따라 헤드 캡을 브레그마 위에 놓인 전방 융기와 정렬하고 나사가 두개골에 평평하게 놓일 때까지 브레그마 위에 두 개의 필리스터 헤드 슬롯 드라이브 나사를 삽입하여 두개골에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의합니다.이미징 창을 설정하려면 드릴을 사용하여 반복적으로 더 깊은 절단으로 1.4 x 2mm 개두술 창의 주변을 부드럽게 묘사하기 전에 이미징 창의 모서리에 대한 개두술 참조 표시의 각 위치에 0.7mm 직경의 버 구멍을 뚫습니다. 열린 창을 뼈 왁스로 덮고 0.9mm 직경의 버를 사용하여 경막외 EEG 전극 구멍을 뚫고 경막외박기를 절단하지 않도록 주의합니다. 세 개의 구멍을 뼈 왁스로 덮고 이미징 창과 EEG 구멍을 둘러싸는 치과용 시멘트 벽을 만들어 벽을 헤드 캡에 묶습니다.시멘트가 마르면 4.0 또는 5.0 검은색 꼰 실크와 간단한 단속 봉합사를 사용하여 느슨한 상처 가장자리를 닫고 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부에 리도카인과 항균 연고를 바릅니다. 그런 다음 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 따뜻한 케이지에 넣습니다. 헤드 캡 이식 조사 후 하루 동안 헤드 캡을 입체 프레임에 부착된 맞춤형 장착 바에 고정하여 이미징 세션 내내 깨어 있는 마우스를 프레임에 단단히 고정합니다.접지된 경막외 뇌파 기록 전극을 후방 중앙 구멍에 삽입하고 기록 전극을 전방 좌우 구멍에 삽입합니다. 와이어의 끝은 L 자형이며 두개골과 듀라마터 사이에 위치합니다. 해마 내의 혈류를 시각화하기 위해 두 손가락으로 꼬리를 고정하여 중심 정맥을 찾고 꼬리와 평행한 통합 30게이지 바늘이 장착된 초미세 인슐린 주사기를 잡고 바늘 경사면을 꼬리 기저부에서 약 절반에서 2/3 지점의 정맥에 삽입하여 200마이크로리터의 5% 녹색 플루오레세인 라이신 고정 가능한 덱스트란을 전달합니다.그런 다음 주사기 바늘의 구부러진 끝을 사용하여 경막을 제거하고 컨포칼 레이저 스캐닝 기록을 시작합니다. 꼬리 정맥 주입 직후 300미크론 비스듬한 광섬유 번들을 로봇 입체 드라이브의 모바일 암에 아래쪽 방향으로 고정합니다. 구속 시스템은 모세혈관과 근위 벽화 세포를 포함한 뇌심부 미세혈관의 혈류를 장시간 동안 안정적으로 기록할 수 있습니다.전체 미세혈관에 대한 이 대표적인 분석에서, 혈류 정지는 표지된 벽화 세포에서 발생했다. 광섬유 기록의 양은 혈류의 고해상도 2개의 광자 이미징 기록을 피질 조직 내의 동등한 혈관 경련과 비교하여 결정할 수 있습니다. 기록 부위의 면역조직화학적 분석은 해마 벽화 세포가 이 방법을 사용하여 치료에 반응하여 수축할 뿐만 아니라 동맥에서 멀리 떨어진 미세혈관의 협착과 공간적으로 연관되어 올바르게 표적화된다는 것을 보여줍니다.입체 수술 및 측면 꼬리 정맥 주사에 대한 숙련도는 이 프로토콜을 수행하는 데 매우 중요합니다. 오류를 줄이고 정확도를 높이려면 철저한 연습이 필수적입니다. 이 기술은 뇌 심부 구조의 혈류 역학을 실시간으로 이미징할 수 있으므로 혈관계 병리를 연구하고 이를 표적으로 하는 치료의 효능을 평가하는 데 적합합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Fiber-Coupled Pre-Clinical Confocal Laser-scanning Endomicroscopy (pCLE) of Hippocampal Capillaries in Awake Mice

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

레이저 스캐닝 Photostimulation에 의해 억제 Neuronal 회로를 매핑

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...