Name: isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

लेखक जूलिया Geminn को मास्ट सेल की तैयारी और संवर्धन में तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । यह काम Transregional सहयोगी अनुसंधान केंद्र (TR-SFB) 152 द्वारा समर्थित किया गया था ।

सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए जर्मन कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया (आधिकारिक रूप से कार्ल्सृहे क्षेत्रीय परिषद द्वारा अनुमोदित) ।
1. ?...

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells.">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li><li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice.">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li><li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity.">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li><li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

mc मॉडल को सफलतापूर्वक mc दानेदार, chemotaxis, आसंजन, साथ ही साथ स्पष्ट intracellular संकेतन transduction mc सक्रियण में शामिल रास्ते का अध्ययन किया जा सकता है । कुछ शोधकर्ता मानव MCs मॉडलों का उपयोग करते हैं, जैसे कि अमर रेखाओं (LAD2 and HMC1)...

MCs जन्मजात और प्राप्त प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं । विशेष रूप से, MCs बैक्टीरिया और परजीवी के रूप में रोगजनकों की हत्या में भाग लेते हैं, और भी संभावित विषाक्त अंतर्जात पेप्टाइड्स या विष के घटकों को नीचा (समीक्षा के लिए Galli एट अल. २००८1) देखें । जन्मजात और अनुकूल उन्मुक्त में MCs की शारीरिक भूमिका गरम बहस का विषय है. इसलिए, विभिंन एम सी की कमी माउस मॉडल के साथ प्रदर्शन के अध्ययन में कई डेटा विसंगतियों एलर्जी2से परे MCs के प्रतिरक्षा कार्यों का एक व्यवस्थित पुनः मूल्यांकन की आवश्यकता है । परिपक्व MCs ज्यादातर ऊतकों और ऐसे त्वचा, फेफड़े, और पेट के रूप में अंगों में स्थानीयकृत रहे हैं, और आमतौर पर रक्त में छोटी संख्या में ही पाए जाते हैं । MCs ऐसे MC progenitors के रूप में टेम पुरोगामी, से प्राप्त है, और लगभग सभी संवहनी ऊतकों के microenvironments में उनके भेदभाव और परिपक्वता को पूरा1। टी सेल व्युत्पंन फैक्टर interleukin (IL)-3 चुनिंदा व्यवहार्यता, प्रसार को बढ़ावा देता है, और अपने टेम progenitors3से माउस MCs के एक pluripotent जनसंख्या के भेदभाव । स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) ऊतकों में संरचनात्मक कोशिकाओं द्वारा उत्पादित और एम सी विकास, अस्तित्व, प्रवास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और4समारोह । व्यक्तिगत MCs के गुण विभिन्न टीज़र या proteoglycans को संश्लेषित और संग्रहीत करने की क्षमता के आधार पर अलग हो सकते हैं. चूहों में, तथाकथित संयोजी ऊतक-प्रकार MCs श्लैष्मिक MCs से उनके शारीरिक स्थानीयकरण, आकृति विज्ञान, और हेपरिन की सामग्री के अनुसार प्रतिष्ठित हैं और5.
MCs में, नि: शुल्क cytosolic Ca की वृद्धि+ 2 + ([ca2 +]मैं) और eicosanoids के उत्पादन के लिए अपरिहार्य है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में साइटोकिंस के संश्लेषण और प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण के लिए antigen के जवाब में और विभिन्न secretagogues6. इन उत्तेजनाओं का एक प्रमुख अनुप्रवाह लक्ष्य phospholipase सी है, जो hydrolyzes phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate को diacylglycerol (तमंचा) और inositol 1, 4, 5-trisphosphate है । तमंचा सक्रिय करता है प्रोटीन कळेनासे सी और IP3 की विज्ञप्ति आयनों Ca2 + endoplasmic जालिका से । इन दुकानों की कमी प्लाज्मा झिल्ली सीए2 + चैनलों के माध्यम से सीए2 + आमद सक्रिय, कैल्शियम प्रविष्टि संचालित स्टोर करने के लिए अग्रणी (SOCE). इस प्रक्रिया को सीए2 +-सेंसर, stromal इंटरेक्शन अणु-1 (Stim1) के संपर्क के माध्यम से पैदा होता है, endoplasmic जालिका में Orai17 के साथ-साथ परिवर्तनीय रिसेप्टर संभावित विहित (TRPC) चैनल के सक्रियकरण के माध्यम से प्रोटीन (समीक्षा के लिए देखें Freichel एट अल । २०१४8) प्लाज्मा झिल्ली में ।
इन चैनलों की शारीरिक भूमिका का अध्ययन करने के लिए, कई औषधीय (चैनल ब्लॉकर्स के आवेदन) या आनुवंशिक दृष्टिकोण आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं । उत्तरार्द्ध मामले में, प्रोटीन अभिव्यक्ति का दमन लक्ष्यीकरण mRNA (पछाड़ना) या जीनोमिक डीएनए संपादन के साथ वैश्विक या ऊतक एक एक्सॉन कोडिंग एक एक चैनल की उपइकाई के गठन (नॉकआउट) के विशिष्ट9 विलोपन के साथ हासिल की है । इन चैनलों के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एक अवरोधक की उपलब्धता सीमित है । इसके अलावा, पछाड़ना दृष्टिकोण का उपयोग कर अपने effectivity के सावधान नियंत्रण की आवश्यकता है, जैसे, पश्चिमी दाग विश्लेषण, और कई मामलों में लक्षित चैनल प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की अनुपलब्धता से प्रभावित है । इस प्रकार, नॉकआउट माउस मॉडलों का उपयोग अभी भी इस तरह के विश्लेषण के लिए सोने के मानक के रूप में माना जाता है । एक पसंदीदा इन विट्रो में एम सी कार्यों की जांच के लिए मॉडल PMCs की खेती है कि एक पूरी तरह से परिपक्व आबादी के रूप में अलग हो सकता है vivo पूर्व (के रूप में से इन विट्रो में MCs अंतर करने के लिए विरोध किया, जैसे, अस्थि मज्जा कोशिकाओं)10 . के रूप में अस्थि मज्जा व्युत्पंन MCs (BMMCs) है, जो भी सामांयतः इन विट्रो मेंMC समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है की तुलना में, FcεRI और बीटा hexosaminidase रिलीज की उत्तेजना बढ़ जाती है 8 गुना और १००-PMCs में गुना, क्रमशः । इस अनुच्छेद में, हम अलगाव और murine PMCs है, जो संवर्धन के 2 सप्ताह के बाद प्राप्त करने की अनुमति देता है की एक विधि का वर्णन शुद्ध संयोजी ऊतक प्रकार MCs की एक उच्च संख्या, आगे विश्लेषण के लिए पर्याप्त है ।
विकास और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक के आवेदन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, उनके उपयोग अभी भी जीन के वितरण में कठिनाइयों के द्वारा सीमित है कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए, विशेष रूप से, उच्च विशेष कोशिकाओं में ऐसे प्राथमिक संस्कृति MCs के रूप में । इसके अलावा, के लिए फ्लोरोसेंट संकेतकों के इस समूह [Ca2 +]मैं माप अभी भी एक उच्च गतिशील रेंज के साथ ratiometric रंगों का अभाव है । इन कारणों के लिए, ratiometric के लिए पसंदीदा विधि [Ca2 +]मैं माप अभी भी फ्लोरोसेंट डाई "फ्रा-2"11का उपयोग है ।
वर्तमान में, MC सक्रियण और दानेदार के मूल्यांकन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण β-hexosaminidase गतिविधि का माप है । β-hexosaminidase, एक एलर्जी मध्यस्थ, एम सी granules घटक है कि सह है में से एक है MCs12से लगातार अनुपात में हिस्टामिन के साथ जारी है । β-hexosaminidase आसानी से हो सकता है और सही ढंग से एक विशेष सब्सट्रेट, जो एक colorigenic उत्पाद है कि आसानी से एक microplate वर्णमिति परख में detectable है की एक औसत दर्जे का मात्रा पैदा करता है के साथ अपनी प्रतिक्रिया के माध्यम से मापा जाता है । इस अनुच्छेद में, उत्तेजनाओं की एक किस्म के जवाब में PMCs दानेदार के विश्लेषण के लिए इस तकनीक का एक आवेदन की सूचना दी है ।
उच्च संबध plasmalemmal IgE रिसेप्टर (FcɛRI) के एकत्रीकरण एक बहुमुखी intracellular संकेतन मार्ग MCs में सक्रिय करता है, आसपास के स्रावी अंतरिक्ष में extracellular granules सामग्री की रिहाई के लिए अग्रणी । विशिष्ट प्रतिजन के अलावा, कई अन्य उत्तेजनाओं इम्यूनोमॉड्यूलेटरी मध्यस्थों की एक विविध सरणी, जैसे पूरक anaphylatoxins जारी करने के लिए सक्रिय कर सकते हैं MCs (जैसे, C3a और C5a)13, vasoconstrictor पेप्टाइड endothelin 1 (ET1)14 , साथ ही कई cationic पदार्थ और pseudoallergic प्रतिक्रियाओं उत्तेजक दवाओं (जैसे, icatibant)15 MRGPRX216के लिए बाध्यकारी द्वारा । MRGPR-प्रेरित MCs दानेदार में शामिल Intracellular संकेतन रास्ते खराब FcɛRI-मध्यस्थता Intracellular संकेतन की तुलना में के रूप में विशेषता हैं; इन रास्ते ही गहन अध्ययन किया जा करने के लिए पिछले कुछ वर्षों के दौरान17 रिसेप्टर पहचान16के बाद शुरू कर दिया. मोटे तौर पर, प्लाज्मा झिल्ली आयन MRGPRX2 उत्तेजना के बाद कैल्शियम प्रवेश में शामिल चैनलों को समझा जा रह रहे हैं । इसलिए, वर्तमान लेख भी intracellular कैल्शियम संकेतन और MRGPR एगोनिस्ट के साथ उत्तेजित MCs की दानेदार बनाना पर केंद्रित है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">RPMI Medium</td>
			<td style="width:273px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:212px;">21875034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R92157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PMC2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fura-2 AM&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNP-HSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-DNP-Antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penstrep</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound 48/80&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">N9376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoverWell Imaging Chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL635051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plate, v-shaped bottom&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plates, flat bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microtiter plate reader with &#34;i-control&#34; software&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat bottom plate&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:212px;">655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:212px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Culture Flasks (25 cm)</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>69160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cover slips glasses round; &#248; 25 mm; No. 1</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:212px;">440260-9900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HC Filter Set Fura 2&#160;</td>
			<td>AHF</td>
			<td style="width:212px;">H76-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monochromatic Light Source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Imaging Acquisition Program</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision 4.8.2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gravity fed solution application system</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>4-channel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:291px;">Bench Centrifuge</td>
			<td style="width:273px;">Heraeus</td>
			<td style="width:212px;">Megafuge 1.0R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

मस्तूल कोशिकाओं (MCs), प्रतिरक्षा प्रणाली के एक भाग के रूप में, कई रोगजनकों के खिलाफ और एलर्जी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की दीक्षा में मेजबान बचाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । क्रॉस के माध्यम से MCs के सक्रियकरण सतह IgE उच्च संबध IgE रिसेप्टर (FcεRI) के लिए बाध्य, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई अन्य रिसेप्टर्स की उत्तेजना के माध्यम से, मुक्त intracellular Ca के उदय शुरू2 + स्तर ([ca2 +]मैं) भड़काऊ और एलर्जी मध्यस्थों की रिहाई को बढ़ावा देता है । इन संकेतन रास्ते में शामिल आणविक घटकों की पहचान MC समारोह के विनियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इस आलेख में, हम पेरिटोनियल लेवेज और पेरिटोनियल MCs (PMCs) की खेती द्वारा murine संयोजी ऊतक प्रकार MCs के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस पद्धति द्वारा विभिंन नॉकआउट माउस मॉडलों से MCs की संस्कृतियों MC संकेतन रास्ते में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, हम भी एक के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन एक सेल फ्रा-2 ca के ठहराव के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक के रूप में इमेजिंग के 2+ MCs में संकेतन प्रतिदीप्ति-आधारित मॉनिटरिंग [ca2 +]मैं एक विश्वसनीय और आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है अध्ययन सीए2 + स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि है, जो MC सक्रियण के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है सहित संकेत घटनाओं, । MC दानेदार के विश्लेषण के लिए, हम एक β-hexosaminidase रिलीज परख का वर्णन । β-hexosaminidase संस्कृति माध्यम में जारी की मात्रा MCs में वर्णित सभी तीन अलग स्रावी उपसेट के लिए एक दानेदार मार्कर के रूप में माना जाता है. β-hexosaminidase आसानी से quantified में एक colorigenic सब्सट्रेट के साथ अपनी प्रतिक्रिया द्वारा किया जा सकता है microtiter प्लेट वर्णमिति परख । यह अत्यधिक reproducible तकनीक लागत प्रभावी है और कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । कुल मिलाकर, प्रदान की प्रोटोकॉल MCs ठेठ MC सतह मार्करों व्यक्त की एक उच्च उपज दर्शाता है, ठेठ रूपात्मक और MCs के phenotypic सुविधाओं को प्रदर्शित करने, और 2 सीए में reproducible के लिए अत्यधिक secretagogues प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन+- इमेजिंग और दानेदार परख ।

PMCs 3 जंगली प्रकार चूहों से अलग थे (C57BL/6N) intraperitoneal लेवेज द्वारा और आगे RPMI माध्यम में प्रसंस्कृत 20% FCS और 1% कलम के साथ पूरक-Strep वृद्धि कारकों की उपस्थिति में (IL-3 पर 10 एनजी/एमएल और एससीएफ में बाँझ humidified शर्तों ?...

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Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

यहां, हम अलग और murine पेरिटोनियल मस्तूल कोशिकाओं की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम भी उनके कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन: intracellular मुक्त Ca के एक फ्लोरोसेंट इमेजिंग2 + एकाग्रता और एक दानेदार बनाना जारी β-hexosaminidase के वर्णमिति ठहराव के आधार पर परख ।

मूत्रमार्ग के अलगाव-प्राप्त मस्तूल कोशिकाओं और उनके 2 सीए के साथ कार्यात्मक लक्षण वर्णन+-इमेजिंग और दानेदार परख

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

कार्यात्मक कार्डिएक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलगाव

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

मानव नाल की नस Endothelial फ्लो शर्तों के तहत और न्युट्रोफिल स्थानांतरगमन के अध्ययन में उनके उपयोग के कक्ष के अलगाव

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

अलगाव और और माउस आंत से वृक्ष के समान कोशिकाओं मैक्रोफेज की विशेषता

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

प्रवाह कार्यात्मक और आण्विक अध्ययन के लिए प्राथमिक murine प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के cytometric अलगाव

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

कार्यात्मक रूपांकनों और उनके बंधन पार्टनर्स के पेप्टाइड आधारित पहचान

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

एक कार्बनिक विलायक के इस्तेमाल के बिना Triclosan का प्रभाव: आरबीएल-2H3 मस्त सेल degranulation पर रासायनिक प्रभाव का आकलन करने के लिए एक microplate परख

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

समय-समय पर एसिड शिफ़ धुंधला के साथ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में ग्लाइकोजन का पता लगाने के

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

'मस्त सेलनॉक-इन'चूहों का उपयोग कर वीवो में मस्त कोशिकाओं के कार्यों का विश्लेषण

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

विरोधी ट्यूमर गुण के साथ अलगाव और न्यूट्रोफिल की विशेषता

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

अलगाव, लक्षण और मसूड़ों का प्रतिरक्षा सेल नेटवर्क के कार्यात्मक परीक्षा

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...