Name: isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne Julia Geminn teknisk assistanse i mast celle forberedelse og dyrking. Dette arbeidet ble støttet av The Transregional samarbeid Research Centre (TR-SFB) 152.

Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til tysk lovgivning retningslinjer for behandling og bruk av forsøksdyr (offisielt godkjent av Karlsruhe regional council).
1. PMC isolasjon og dyrking av Intraperitoneal Lavage
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Isen</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL sprøyter</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G nåler</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G nåler</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Styrofoam blokk...

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells.">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li><li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice.">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li><li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity.">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li><li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

MC modeller kan brukes å studere MC omfatter degranulering, chemotaxis, vedheft, så vel som å belyse intracellulær signalnettverk signaltransduksjon trasé involvert i MC aktivisering. Noen forskere bruk menneskelige MCs modeller, for eksempel udødeliggjort linjer (LAD2 og HMC1) eller menneskelig MCs avledet fra ledningen blod progenitor celler (CD133 +) og perifert blod progenitor celler (CD34 +). Andre foretrekker gnager MC modeller, som foreviget (rotte basophilic leukemi RBL - 2H 3 MC linje) eller primære kulti...

MCs spille en fremtredende rolle under medfødt og ervervet immunreaksjoner. Spesielt MCs delta i drepe patogener, som bakterier og parasitter, og også redusere potensielt giftig endogene peptider eller komponenter av venoms (for gjennomgang se Galli et al. 20081). Fysiologiske rollen MCs i medfødte og adaptive immunitet er gjenstand for opphetet debatt. Derfor krever mange data avvik studier utført med ulike MC-mangelfull musen modeller en systematisk evaluering av immunologiske funksjoner av MCs utover allergi2. Eldre MCs er hovedsakelig lokalisert i vev og organer som huden, lungene og gut, og vanligvis finnes bare i små tall i blodet. MCs avledet fra blodkreft forløpere, som MC progenitors, og fullføre sine differensiering og modning i microenvironments av nesten alle Stangeriaceae vev1. T-cell-derived faktor interleukin (IL) -3 fremmer selektivt levedyktighet, spredning og differensiering av pluripotent innbyggere musen MCs fra deres blodkreft progenitors3. Stamcelle faktor (SCF) er produsert av strukturelle celler i vev og spiller en avgjørende rolle i MC utvikling, overlevelse, migrasjon og funksjon4. Egenskaper for personlige MCs kan variere avhengig av deres evne til å syntetisere og lagre ulike proteaser eller proteoglycans. I mus, er såkalte bindevev-type MCs forskjellig fra mucosal MCs etter deres anatomiske lokalisering, morfologi og innhold av heparin og proteaser5.
I MCs, en økning på gratis cytosolic Ca2 + ([Ca2 +]jeg) er uunnværlig for omfatter degranulering og produksjon av eicosanoids og syntese av cytokiner og aktivering av transkripsjonsfaktorer svar til antigen og ulike secretagogues6. En nedstrøms mål av disse stimuli er fosfolipase C, som hydrolyzes phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) og inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverer protein kinase C og IP3 utgivelser ioner av Ca2 + fra det endoplasmatiske retikulum. Utarming av disse butikkene aktiverer Ca2 + tilstrømningen gjennom plasma membranen Ca2 + kanaler, fører til lagre styres kalsium oppføring (SOCE). Denne prosessen er fremkalt gjennom samspillet av Ca2 +-sensor, stromal samhandling molekyl-1 (Stim1), i det endoplasmatiske retikulum med Orai17 samt gjennom aktivering av forbigående reseptor potensielle kanoniske (TRPC) proteiner (for gjennomgang se Freichel et al. 20148) i plasma membranen.
For å studere brukes fysiologiske rollen av disse kanalene, flere farmakologisk (anvendelse av kanal blokkere) eller genetiske metoder vanligvis. I sistnevnte tilfelle, undertrykkelse av protein uttrykk oppnås ved å målrette mRNA (knockdown) eller genomisk DNA redigering med global eller vev-spesifikke9 sletting i en ekson koding en pore danner delenhet i en kanal (knockout). Tilgjengeligheten av en blokkering med tilstrekkelig spesifisitet for disse kanalene er begrenset. I tillegg knockdown tilnærming krever nøye kontroll på sin effektiviteten bruker, f.eks., Western blot analyse, og er hemmet av mangel på spesifikke antistoffer for målkanalen protein i mange tilfeller. Dermed er bruk av knockout musen modeller fortsatt betraktet som gullstandarden for Slike analyser. En foretrukket i vitro modell for etterforskningen av MC funksjoner er dyrking av PMCs som kan være isolert ex vivo som en fullt moden populasjon (i motsetning til skille MCs i vitro fra, f.eks., bein margtransplantasjon celler)10 . Sammenlignet med benmarg avledet MCs (BMMCs), som er også ofte brukt til å studere MC funksjon i vitro, stimulering av FcεRI og beta-hexosaminidase er versjon økte 8-fold og 100-fold i PMCs, henholdsvis. I denne artikkelen beskriver vi en metode for isolasjon og dyrking av murine PMCs, som tillater for å få etter 2 uker med dyrking mange ren bindevev skriver MCs, tilstrekkelig for videre analyse.
Til tross for framskritt i utvikling og anvendelse av genetisk kodet kalsium indikatorer, er deres bruk fortsatt begrenset av vanskeligheter i levering av gener til målcellene, spesielt i høyt spesialiserte celler som primære kulturperler MCs. I tillegg mangler denne gruppen av fluorescerende indikatorer for [Ca2 +]jeg målinger fortsatt ratiometric fargestoffer med en høy dynamisk område. For disse grunner er den foretrukne metoden for ratiometric [Ca2 +]jeg måling fortsatt bruk av fluorescerende fargestoff "Fura-2"11.
For tiden, de vanligste tilnærming for vurdering av MC aktivisering og omfatter degranulering er måling av β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk megler, er en av MC granule komponentene som er co utgitt med histamin i konstant andel fra MCs12. Β-hexosaminidase kan lett og nøyaktig måles gjennom sin reaksjon med en bestemt underlaget, som produserer en målbar mengde et colorigenic produkt som er lett synlig i en microplate kolorimetrisk analysen. I denne artikkelen, er bruk av denne teknikken for analyse av PMCs omfatter degranulering svar på ulike stimuli rapportert.
Samling av høy affinitet plasmalemmal IgE reseptoren (FcɛRI) aktiveres i MCs en allsidig intracellulær signalveien, fører til en utgivelse av sekretoriske granule innhold i omkringliggende ekstracellulære plass. I tillegg til spesifikke antigen, mange andre stimuli kan aktivere MCs å løslate en variert rekke immunmodulerende meglere, som utfyller anaphylatoxins (f.eks., C3a og C5a)13, vasoconstrictor peptid endothelin 1 (ET1)14 , så vel som mange kationisk stoffer og narkotika provoserte pseudoallergic reaksjoner (f.eks., icatibant)15 ved binding til MRGPRX216. Intracellulær signalveier involvert i MRGPR-indusert MCs omfatter degranulering kjennetegnes dårlig i forhold til FcɛRI-mediert intracellulær signalering; disse veier bare begynte å studeres intensivt i løpet av de siste par år17 etter reseptor identifikasjon16. I stor grad, gjenstår plasma membranen ion kanalene involvert i kalsium oppføring etterfulgt av MRGPRX2 stimulering å bli forstått. Derfor denne artikkel fokuserer også på intracellulær kalsium signalering og omfatter degranulering av MCs stimulert med MRGPR agonister.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">RPMI Medium</td>
			<td style="width:273px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:212px;">21875034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R92157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PMC2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fura-2 AM&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNP-HSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-DNP-Antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penstrep</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound 48/80&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">N9376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoverWell Imaging Chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL635051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plate, v-shaped bottom&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plates, flat bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microtiter plate reader with &#34;i-control&#34; software&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat bottom plate&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:212px;">655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:212px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Culture Flasks (25 cm)</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>69160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cover slips glasses round; &#248; 25 mm; No. 1</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:212px;">440260-9900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HC Filter Set Fura 2&#160;</td>
			<td>AHF</td>
			<td style="width:212px;">H76-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monochromatic Light Source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Imaging Acquisition Program</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision 4.8.2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gravity fed solution application system</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>4-channel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:291px;">Bench Centrifuge</td>
			<td style="width:273px;">Heraeus</td>
			<td style="width:212px;">Megafuge 1.0R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

Mast celler (MCs), spille som en del av immunsystemet, en nøkkelrolle i å forsvare verten mot flere patogener og initiering av allergiske immunrespons. Aktivering av MCs via cross-linking av overflate IgE bundet til høy affinitet IgE reseptor (FcεRI), samt gjennom stimulering av flere andre reseptorer, starter økningen av gratis intracellulær Ca2 + nivået ([Ca2 +]jeg) som fremmer utgivelsen av inflammatoriske og allergiske meglere. Identifikasjon av molekylære bestanddeler involvert i disse signalveier er avgjørende for å forstå regulering av MC-funksjonen. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for isolering typen murine bindevev MCs av peritoneal lavage og dyrking av peritoneal MCs (PMCs). Kulturer av MCs fra ulike knockout musen modeller av denne metodikken representerer en nyttig tilnærming til identifisering av proteiner involvert i MC signalnettverk trasé. Dessuten, vi også beskriver en protokoll for enkelt celle Fura-2 tenkelig som en viktig teknikk for kvantifisering av Ca2 + signalering i MCs. fluorescens-basert overvåking av [Ca2 +]jeg er en pålitelig og brukte tilnærming til studere Ca2 + signalisering hendelser, inkludert lager-opererte kalsium oppføring, som er av største betydning for MC aktivisering. For analyse av MC omfatter degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release analysen. Mengden av β-hexosaminidase utgitt til kultur medium regnes som en omfatter degranulering markør for alle tre forskjellige sekretoriske delsett beskrevet i MCs. β-hexosaminidase kan enkelt kvantifiseres ved sin reaksjon med et colorigenic medium i en være ferdig innen plate kolorimetrisk analysen. Denne svært reproduserbar teknikken er kostnadseffektive og krever ingen spesialisert utstyr. Overall, gitt protokollen demonstrerer en høy avkastning av MCs uttrykke typisk MC overflate markører, vise typiske morfologiske og fenotypiske egenskapene til MCs og demonstrere svært reproduserbar Svar å secretagogues i Ca2 +- bildebehandling og omfatter degranulering analyser.

PMCs ble isolert fra 3 vill type mus (C57BL/6N) av intraperitoneal lavage og ytterligere kulturperler i RPMI medium supplert med 20% FCS og 1% penn-Strep i nærvær av vekstfaktorer (IL-3 på 10 ng/mL) og SCF på 30 ng/mL under sterilt fuktet forholdene på 37 ° C og 5% CO2. Mediet ble endret på dager 2 og 9 etter celle isolasjon. Cellen morfologi ble analysert med girkasse lys DIC imaging (se figur 1A, B). Cellen kontrasten og d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Her presenterer vi en protokoll for å isolere og dyrke murine peritoneal mastceller. Beskriver vi også to protokoller for deres funksjonell karakteristikk: en fluorescerende imaging intracellulær gratis Ca2 + konsentrasjon og en omfatter degranulering analysen basert på kolorimetrisk kvantifisering av den utgitte β-hexosaminidase.

Isolering av Peritoneum-avledet mastceller og deres funksjonell karakteristikk med Ca2 +-imaging og omfatter degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering og karakterisering av dendrittiske celler og makrofager fra musen Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Peptide-baserte Identifikasjon av Funksjonelle Motifs og deres Binding Partnere

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analysere funksjonene til mastceller In Vivo ved hjelp av 'Mast Cell Knock-in' Mus

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolering og karakterisering av nøytrofiler med anti-tumor egenskaper

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolasjon, karakterisering og Funksjonell Undersøkelse av Gingival immun Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...