Name: isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00
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Os autores gostaria de reconhecer a Julia Geminn para obter assistência técnica na preparação de mastócitos e cultivo. Este trabalho foi apoiado pela transregionais o centro de investigação colaborativa (TR-SFB) 152.

Todos os animais procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes da legislação alemã para cuidados e uso de animais de laboratório (oficialmente aprovado pelo Conselho regional de Karlsruhe).
1. PMC isolamento e cultivo por lavagem Intraperitoneal
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Gelo</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>seringas de 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Agulhas 27 G</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Agulhas de 20 G</t...

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells.">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li><li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice.">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li><li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity.">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li><li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

Modelos MC podem ser usados com sucesso para estudar MC degranulação, quimiotaxia, adesão, bem como para elucidar intracelular vias de transdução sinalização envolvidas na ativação de MC. Alguns pesquisadores uso modelos humanos MCs, tais como linhas imortalizadas (LAD2 e HMC1) ou MCs humanas derivados da medula sangue células progenitoras (CD133 +) e células progenitoras de sangue periférico (CD34 +). Outros preferem roedores modelos MC, tais como imortalizados (leucemia basophilic do rato RBL - 2H 3 MC linh...

MCs desempenham um papel proeminente durante respostas de imune inatas e adquiridas. Especificamente, MCs participarem na morte de patógenos, como bactérias e parasitas e também degradam peptídeos endógenos potencialmente tóxicos ou componentes de venenos (para revisão, consulte Galli et al . 20081). O papel fisiológico de MCs na inata e imunidade adaptativa é objecto de debate acalorado. Portanto, as inúmeras discrepâncias de dados nos estudos realizados com diferentes modelos de rato MC-deficientes exigem uma reavaliação sistemática de funções imunológicas de MCs além de alergia2. MCs maduros são localizadas principalmente em tecidos e órgãos como a pele, pulmão e intestino e normalmente são encontrados apenas em pequenas quantidades no sangue. MCs derivam de precursores hematopoiéticos, como progenitores de MC e completar a sua diferenciação e maturação no microambiente que de quase todos os tecidos vascularizados1. Fator derivado de T-células interleucina (IL) -3 promove seletivamente a viabilidade, proliferação e diferenciação de uma população de pluripotentes de rato MCs de seus progenitores hematopoiéticos3. Fator de célula-tronco (SCF) é produzido por células estruturais nos tecidos e desempenha um papel crucial no desenvolvimento da MC, sobrevivência, migração e função4. As propriedades de MCs individuais podem variar dependendo de sua capacidade de sintetizar e armazenar várias proteases ou proteoglicanos. Nos ratos, os tipo de tecido conjuntivo chamados MCs são distintos dos MCs da mucosa de acordo com sua localização anatômica, morfologia e conteúdo de heparina e proteases5.
No MCs, um aumento de livre citosólico Ca2 + ([Ca2 +]eu) é indispensável para a degranulação e a produção de eicosanoides, bem como para a síntese de citocinas e a ativação de fatores de transcrição em resposta ao antígeno e vários secretagogues6. Um grande alvo a jusante estes estímulos é a fosfolipase C que hidrolisa fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato diacilglicerol (DAG) e inositol 1, 4,5-triphosphate. DAG ativa a proteína quinase C e IP3 libera íons de Ca2 + do retículo endoplasmático. Esgotamento destas lojas ativa Ca2 + fluxo através da membrana plasmática Ca2 + canais, levando para armazenar a entrada de cálcio operados (SOCE). Este processo é evocado através da interação do Ca2 +-sensor, estromais interação molécula-1 (Stim1), no retículo endoplasmático com Orai17 , bem como através da ativação de canal potencial de (TRPC) canônico transitória do receptor proteínas (para revisão, ver Freichel et al . 20148) na membrana plasmática.
Para estudar o papel fisiológico desses canais, vários farmacológicos (aplicação de bloqueadores dos canais) ou abordagens genéticas são normalmente usadas. Neste último caso, supressão da expressão da proteína é alcançado pela segmentação do mRNA ("knockdown") ou edição de DNA genômico com exclusão global ou tecido-específica9 de um exon codificação um poro formando a subunidade de um canal (nocaute). A disponibilidade de um bloqueador com especificidade suficiente para estes canais é limitada. Além disso, a abordagem "knockdown" requer controle cuidadoso de sua efetividade, usando, por exemplo., Western blot análise e é dificultado pela indisponibilidade de anticorpos específicos para a proteína do alvo do canal em muitos casos. Assim, o uso de modelos de rato nocaute ainda é considerado como o padrão ouro para tal análise. Um modelo preferencial em vitro para a investigação das funções do MC é o cultivo da EPM que pode ser isolada ex vivo como uma população totalmente madura (em oposição a diferenciar MCs em vitro de, por exemplo., células da medula óssea)10 . Em comparação com MCs derivada de medula óssea (BMMCs), que também são comumente usados para estudar MC função em vitro, a estimulação de FcεRI e beta-hexosaminidase lançamento é aumento 8-fold e 100-fold na EPM, respectivamente. Neste artigo, descrevemos um método de isolamento e cultivo de murino PMCs, que permite para obter após 2 semanas de cultivo um elevado número de puro tecido conjuntivo digite MCs, suficientes para uma análise mais aprofundada.
Apesar dos recentes progressos no desenvolvimento e aplicação de indicadores de cálcio geneticamente codificado, seu uso é ainda limitado por dificuldades na entrega de genes nas células-alvo, especificamente, em células altamente especializados como principais culturas MCs. Além disso, este grupo de indicadores fluorescentes para [Ca2 +]eu medições ainda carece de corantes ratiometric com uma alta gama dinâmica. Por estas razões, o método preferido para a medição ratiometric [Ca2 +]eu ainda é o uso do corante fluorescente "Fura-2"11.
Atualmente, os mais usados abordagem para a avaliação da ativação de MC e degranulação é a medição da atividade de β-hexosaminidase. Β-hexosaminidase, um mediador alérgico, é um dos componentes do grânulo de MC que é co lançado com histamina em proporção constante de MCs12. Β-hexosaminidase pode ser prontamente e com precisão medido através de sua reação com um substrato específico, que produz uma quantidade mensurável de um produto de colorigenic que é facilmente detectável em um ensaio colorimétrico de microplacas. Neste artigo, é relatada uma aplicação desta técnica de análise de degranulação PMCs em resposta a uma variedade de estímulos.
Agregação de receptor de IgE plasmalemmal de alta afinidade (FcɛRI) ativa no MCs versátil via de sinalização intracelular, levando a uma liberação do conteúdo do grânulo secretor no espaço extracelular circundante. O antígeno específico, além de muitos outros estímulos podem ativar MCs para liberar um diversificado leque de mediadores de imunomoduladores, como anafilatoxinas do complemento (ex., C3a e C5a)13, a vasoconstritor peptídeo endotelina 1 (ET1)14 , como bem como numerosas substâncias catiônicas e drogas provocando reações pseudoallergic (EG., Icatibanto)15 por ligação a MRGPRX216. Vias de sinalização intracelulares envolvido na degranulação induzida por MRGPR MCs caracterizam-se mal em comparação com FcɛRI mediada por sinalização intracelular; essas vias só começaram a ser estudada intensamente durante os últimos poucos anos17 após o receptor identificação16. Em grande parte, os canais iônicos de membrana plasmática envolvidos na entrada de cálcio, seguida de estimulação MRGPRX2 permanecem para ser compreendido. Portanto, o presente artigo centra-se na sinalização intracelular do cálcio e degranulação de MCs estimulada com agonistas MRGPR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">RPMI Medium</td>
			<td style="width:273px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:212px;">21875034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R92157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PMC2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fura-2 AM&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNP-HSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-DNP-Antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penstrep</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound 48/80&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">N9376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoverWell Imaging Chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL635051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plate, v-shaped bottom&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plates, flat bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microtiter plate reader with &#34;i-control&#34; software&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat bottom plate&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:212px;">655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:212px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Culture Flasks (25 cm)</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>69160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cover slips glasses round; &#248; 25 mm; No. 1</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:212px;">440260-9900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HC Filter Set Fura 2&#160;</td>
			<td>AHF</td>
			<td style="width:212px;">H76-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monochromatic Light Source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Imaging Acquisition Program</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision 4.8.2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gravity fed solution application system</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>4-channel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:291px;">Bench Centrifuge</td>
			<td style="width:273px;">Heraeus</td>
			<td style="width:212px;">Megafuge 1.0R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

Mastócitos (MCs), como parte do sistema imunológico, um papel fundamental na defesa do hospedeiro contra vários patógenos e no início da resposta imune alérgica. A ativação de MCs através do cross-linking de superfície IgE ligado ao receptor de IgE de alta afinidade (FcεRI), bem como através da estimulação de vários outros receptores, inicia a ascensão do livre intracelular Ca2 + nível ([Ca2 +]eu) que promove a liberação de mediadores inflamatórios e alérgicos. A identificação dos constituintes moleculares envolvidos nessas vias de sinalização é crucial para a compreensão da regulação da função MC. Neste artigo, descrevemos um protocolo para o isolamento do tipo murino tecido conjuntivo MCs pela lavagem peritoneal e cultivo de MCs peritoneais (EPM). Culturas de MCs de vários modelos de rato nocaute por esta metodologia representam uma abordagem útil para a identificação das proteínas envolvidas na MC vias de sinalização. Além disso, podemos também descrever um protocolo para unicelulares Fura-2 de imagens como uma técnica importante para a quantificação de Ca2 + sinalização no MCs. baseada em fluorescência monitoramento de [Ca2 +] é um confiável e comumente usado abordagem estudo de Ca2 + sinalização de eventos, incluindo a entrada de cálcio operada a loja, que é de extrema importância para a ativação do MC. Para a análise de MC degranulação, descrevemos um ensaio de liberação de β-hexosaminidase. A quantidade de β-hexosaminidase lançado no meio de cultura é considerada como um marcador de degranulação para todos os três diferentes secretoras subconjuntos descrito no MCs. β-hexosaminidase facilmente pode ser quantificado pela sua reação com um substrato de colorigenic em um ensaio colorimetric da placa da microplaca. Esta técnica altamente reprodutível é cost-effective e exige nenhum equipamento especializado. No geral, o protocolo fornecido demonstra um alto rendimento de MCs expressando marcadores de superfície típicas MC, exibindo características fenotípicas e morfológicas típicas da MCs e demonstrando respostas altamente reprodutíveis para secretagogues de Ca2 +- ensaios de imagem e degranulação.

EPM foram isoladas a partir de 3 ratos de tipo selvagem (C57BL/6N) por lavagem intraperitoneal e mais cultivadas em meio RPMI suplementado com FCS de 20% e 1% caneta-Strep na presença de fatores de crescimento (IL-3 a 10 ng/mL) e SCF em 30 ng/mL em estéreis humedecidas condições no 37 ° C e 5% CO2. O meio foi mudado nos dias 2 e 9, após o isolamento da célula. A morfologia celular foi analisada usando transmissão luz imagem DIC (consulte a Figura 1<...

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Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar os mastócitos peritoneais murino. Também descrevemos dois protocolos para a sua caracterização funcional: uma imagem fluorescente de enciclopédia Ca2 + concentração intracelular e um ensaio de degranulação baseado na quantificação colorimétrica de β-hexosaminidase a liberado.

Isolamento do peritônio-derivado de mastócitos e sua caracterização funcional com Ca2 +-imagens e ensaios de degranulação

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Um Ensaio de microplacas para avaliar os efeitos químicos de RBL-2H3 degranulação dos mastócitos: Efeitos do Triclosan, sem utilização de solventes orgânicos

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...