Name: isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

Författarna vill erkänna Julia Geminn för tekniskt bistånd i mastcellen förberedelse och odling. Detta arbete stöds av The transregionala Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.

Alla djur förfaranden utfördes enligt tysk lagstiftning riktlinjerna för skötsel och användning av försöksdjur (officiellt godkänd av Karlsruhe regionala rådet).
1. PMC isolering och odling av Intraperitoneal Lavage
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Ice</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL sprutor</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G injektionsnålar</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G injektionsnålar</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
	...

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells.">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li><li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice.">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li><li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity.">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li><li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

MC-modeller kan användas framgångsrikt att studera MC degranulering, Kemotaxis, vidhäftning, samt för att belysa intracellulära transduktion signalvägar involverade i MC aktivering. Vissa forskare använder mänskliga MCs modeller, såsom förevigade linjer (LAD2 och HMC1) eller mänskliga MCs härrör från sladd blod stamceller (CD133 +) och perifera stamceller (CD34 +). Andra föredrar gnagare MC-modeller, som förevigade (råtta basofila leukemi RBL - 2H 3 MC linje) eller primär odlade (mus ben-märg-härledda...

MCs har en framträdande roll under medfödda och förvärvade immunsvaret. Specifikt, MCs delta i dödandet av patogener, såsom bakterier och parasiter, och också försämra potentiellt giftiga endogena peptider eller komponenter av serotoninreceptorerna (för granskning se Galli et al. 20081). MCs fysiologiska roll i medfödd och adaptiv immunitet är föremål för livlig debatt. Därför, många data avvikelserna i de studier som utförts med olika MC-brist musmodeller kräver en systematisk omvärdering av immunfunktionerna för MCs bortom allergi2. Mogen MCs är oftast lokaliserade i vävnader och organ som hud, lunga och tarm, och finns vanligen endast i litet numrerar i blodet. MCs härleda från hematopoetisk prekursorer, såsom MC progenitorceller, och slutföra sin differentiering och mognad i mikromiljö av nästan alla vaskulariserad vävnad1. T-cell-derived faktor interleukin (IL) -3 främjar selektivt den livskraft, proliferation och differentiering av pluripotenta befolkningen på mus MCs från deras hematopoetiska progenitorceller3. Stem cell faktor (SCF) är producerad av strukturella celler i vävnader och spelar en avgörande roll i MC utveckling, överlevnad, migration och funktion4. Egenskaper för enskilda MCs kan variera beroende på deras förmåga att syntetisera och lagra olika proteaser eller proteoglykaner. Hos möss särskiljs så kallade bindväv-typ MCs från slemhinnor MCs enligt deras anatomiska lokalisering, morfologi och innehåll av heparin och proteaser5.
I MCs, en ökning med gratis cytosoliska Ca2 + [Ca2 +]jagär oumbärlig för degranulering och produktion av eikosanoider, liksom för syntesen av cytokiner och aktivering av transkriptionsfaktorer som svar på antigen och olika secretagogues6. Ett större nedströms mål på dessa stimuli är fosfolipas C, som hydrolyserar fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate diglyceridolja (DAG) och inositol 1,4,5-trisphosphate. DAG aktiverar proteinkinas C och IP3 släpper joner av Ca2 + från endoplasmatiska retiklet. Utarmning av dessa butiker aktiveras Ca2 + inflöde genom plasmamembranet Ca2 + kanaler, vilket leder till att lagra manövrerade kalcium inträde (SOCE). Denna process frammanas genom samverkan mellan den Ca2 +-sensor, stromal interaktion celladhesionsmolekyl-1 (Stim1), i det endoplasmatiska retiklet med Orai17 samt genom aktivering av transient receptor potential kanoniska (TRPC) kanal proteiner (för granskning se Freichel o.a. 20148) i plasmamembranet.
Den fysiologiska roll dessa kanaler, flera farmakologiska (tillämpning av kalciumantagonister) eller genetiska metoder används vanligtvis för att studera. I det senare fallet, undertryckande av proteinuttryck uppnås genom att rikta mRNA (knockdown) eller genomiskt DNA redigering med globala eller vävnadsspecifika9 radering av ett exon kodning en por bildar subuniten av en kanal (knockout). Tillgången till en blockerare med tillräcklig specificitet för dessa kanaler är begränsade. Dessutom den knockdown metoden kräver noggrann kontroll av dess effektivitet använder, t.ex., Western blot analys och hämmas av avsaknad av specifika antikroppar för riktade kanal protein i många fall. Användningen av knockout musmodeller anses således fortfarande den gyllene standarden för sådan analys. En rekommenderad in vitro- modell för utredning av MC funktioner är odling av PMCs som kan vara isolerad ex vivo som en fullt mogen population (i motsats till att differentiera MCs i vitro från, t.ex., benmärgsceller)10 . Jämfört med benmärg härrör MCs (BMMCs), som används också ofta att studera MC funktion i vitro, stimulering av FcεRI och beta-hexosaminidase ökar frisättningen 8-fold och 100-fold i PMCs, respektive. I den här artikeln beskriver vi en metod för isolering och odling av murina PMCs, vilket gör för att få efter 2 veckors odling ett stort antal rena bindväv skriver MCs, tillräckligt för vidare analys.
Trots senaste framsteg i utvecklingen och tillämpningen av genetiskt kodade kalcium indikatorer begränsas deras användning fortfarande av svårigheter i leverans av gener till målcellerna, särskilt i högt specialiserade celler såsom primära odlade MCs. Dessutom saknar denna grupp av fluorescerande indikatorer för [Ca2 +]jag mätningar fortfarande proportionerlig färgämnen med en high dynamic range. Av dessa skäl är den föredragna metoden för proportionerlig [Ca2 +]jag mätning fortfarande den fluorescerande färgämnet ”Fura-2”11.
För närvarande den vanligaste metoden för utvärdering av MC aktivering och degranulering är mätning av β-hexosaminidase aktivitet. Β-hexosaminidase, en allergisk medlare, är ett av de MC granule komponenter som är co släppt med histamin i konstant andel från MCs12. Β-hexosaminidase kan lätt och exakt mätas genom dess reaktion med ett visst substrat, som producerar en mätbar mängd en colorigenic produkt som enkelt kan upptäckas i en mikroplattan kolorimetriska analys. I denna artikel redovisas en tillämpning av denna teknik för analys av PMCs degranulering svar på olika stimuli.
Aggregering av hög affinitet plasmalemmal IgE-receptorn (FcɛRI) aktiveras i MCs en mångsidig intracellulära signalväg, leder till en frisättning av sekretoriska granule innehåll i den omgivande extracellulära. Förutom de specifika antigenen, många andra stimuli kan aktivera MCs för att släppa ett varierande utbud av immunmodulerande medlare, såsom komplement anaphylatoxins (t.ex., C3a och C5a)13, den kärlsammandragande peptiden endotelin 1 (ET1)14 , as well as talrika katjoniska substanser och droger provocera pseudoallergic reaktioner (t.ex., ikatibant)15 genom bindning till MRGPRX216. Intracellulära signalvägar involverade i MRGPR-inducerad MCs degranulering kännetecknas dåligt jämfört med FcɛRI-medierad Intracellulär signalering; dessa vägar bara börjat studeras intensivt under de senaste par år17 efter den receptor identifiering16. I hög grad, återstår de plasmamembran-jonkanalerna som är involverade i kalcium posten följt av MRGPRX2 stimulering förstås. Därför denna artikel fokuserar också på intracellulära Kalciumsignalering och degranulering av MCs stimuleras med MRGPR agonister.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">RPMI Medium</td>
			<td style="width:273px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:212px;">21875034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R92157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PMC2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fura-2 AM&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNP-HSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-DNP-Antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penstrep</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound 48/80&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">N9376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoverWell Imaging Chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL635051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plate, v-shaped bottom&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plates, flat bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microtiter plate reader with &#34;i-control&#34; software&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat bottom plate&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:212px;">655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:212px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Culture Flasks (25 cm)</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>69160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cover slips glasses round; &#248; 25 mm; No. 1</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:212px;">440260-9900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HC Filter Set Fura 2&#160;</td>
			<td>AHF</td>
			<td style="width:212px;">H76-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monochromatic Light Source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Imaging Acquisition Program</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision 4.8.2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gravity fed solution application system</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>4-channel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:291px;">Bench Centrifuge</td>
			<td style="width:273px;">Heraeus</td>
			<td style="width:212px;">Megafuge 1.0R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

Mastceller (MCs), spela som en del av immunförsvaret, en nyckelroll i försvaret värden mot flera patogener och i inledningen av det allergiska immunsvaret. Aktivering av MCs via tvärbindningen av ytan IgE bundet till hög affinitet IgE receptor (FcεRI) samt genom stimulering av flera andra receptorer, initierar uppkomsten av gratis intracellulära Ca2 + nivån ([Ca2 +]jag) som främjar frisättning av inflammatoriska och allergiska mediatorer. Identifiering av molekylära beståndsdelar inblandade i dessa signalvägar är avgörande för att förstå regleringen av MC funktion. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för isolering av murina bindväv typ MCs av peritoneal lavage och odling av peritoneal MCs (PMCs). Kulturer av MCs från olika knockout mus-modeller av denna metodik utgör en användbar metod för identifiering av proteiner involverade i MC signalering vägar. Dessutom vi också beskriva ett protokoll för enstaka cell Fura-2 imaging som en viktig teknik för kvantifiering av Ca2 + signalering i MCs. fluorescens-baserad övervakning av [Ca2 +]jag är en pålitlig och vanligen används förhållningssätt till studera Ca2 + signalering händelser, inklusive store manövrerade kalcium inträde, som är av yttersta vikt för MC-aktivering. För analys av MC degranulering beskriver vi en β-hexosaminidase release assay. Beloppet för β-hexosaminidase släpptes i odlingsmediet är ansedd som en degranulering markör för alla tre olika sekretoriska undergrupper beskrivs i MCs. β-hexosaminidase kan enkelt kvantifieras genom dess reaktion med ett colorigenic substrat i en mikrotiter plattan kolorimetriska analys. Denna mycket reproducerbara teknik är kostnadseffektiv och kräver ingen specialutrustning. Sammantaget det medföljande protokollet visar en hög avkastning av MCs uttrycka typiska MC yta markörer, Visa typiska morfologiska och fenotypiska drag, MCs och visar mycket reproducerbara Svaren till secretagogues i Ca2 +- Imaging och degranulering analyser.

PMCs isolerades från 3 vildtyp möss (C57BL/6N) av intraperitoneal lavage och ytterligare odlade i RPMI medium kompletteras med 20% FCS och 1% penna-Strep i närvaro av tillväxtfaktorer (IL-3 vid 10 ng/mL) och SCF vid 30 ng/mL under sterila tilluften villkor på 37 ° C och 5% CO2. Medium bytte dag 2 och 9 efter cell isolering. Cellmorfologi analyserades med överföring ljus DIC imaging (se figur 1A, B). Cell kontrast och granul...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays at JoVE.com

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och odla murina peritoneal mastceller. Vi beskriver också två protokoll för deras funktionell karakterisering: en fluorescerande avbildning av intracellulära gratis Ca2 + koncentration och en degranulering analys baserat på kolorimetriska kvantifiering av de utgivna β-hexosaminidase.

Isolering av Peritoneum-derived mastceller och deras funktionella karakterisering med Ca2 +-imaging och degranulering analyser

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av humana navelvenendotelceller och deras användning i studier av neutrofilinhibitorfaktor Transmigration Under flödesförhållanden

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Isolering och karakterisering av dendritiska celler och makrofager från mus tarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Peptid-baserad identifiering av funktionella motiv och deras bindningspartners

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En mikroplatta analys för att bedöma Kemiska Effekter på RBL-2H3 mastcelldegranulering: Effekter av Triclosan utan användning av ett organiskt lösningsmedel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Analysera funktionerna hos mastceller in vivo med hjälp av' mastcell knock-in' möss

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolering och karakterisering av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...