Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

ونشكر ف. بينفيناتي (معهد Italiano دي تكنولوجيا، IIT) للدعم وحسام فيتالي للمساعدة مع هذه المظاهرة. تم تمويل هذا العمل من IIT ومؤسسة سان باولو (منحة رقم 9734 لأمريكا اللاتينية والكاريبي).

<ol>
	<li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+loss+of+P/Q-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice.">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li><li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+postnatal+loss+of+P/Q-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy,+dyskinesia,+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations.">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li><li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+P/Q-Type+Ca2++Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity.">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs.">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC/miR-155.">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins.">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li><li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition.">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845 (2014).</li><li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes.">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels.">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li><li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2+/calmodulin-dependent+facilitation+of+P/Q-type+Ca2++channels.">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li><li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P/Q-type+channel+alpha1(2.1)+subunits:+implications+for+current+density+and+Ca2+-dependent+inactivation.">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone:+a+designer's+guide+to+potent+multi-target+RNAi.">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

التعبير المشارك تحقيقا أوبتوجينيتيك ومير ضد جين presynaptic الاهتمام يقدم نهجاً قويا لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. لهذا النهج التجريبي، من المهم تحديد وتوصيف ميرس ذات كفاءة عالية وانتقائية في إسقاط جينات الاهتمام بنظم الأصلية. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي استخدام ميرس المستقلة اثنين أو أكثر ضد مرناً نفس الاهتمام لمراقبة الآثار خارج الهدف في نهاية المطاف. تجارب الإنقاذ، التي جين مقاوم مير مجددا في النظام، ويمكن استخدامها كعنصر تحكم لخصوصية.
باستخدام نفس بنية للتعبير عن أوبتوجينيتيك التحقيق، ومير يسمح لحفز بصريا فقط presynaptic الخلايا العصبية التي قد تم التلاعب بها. وهذا غير ممكن مع التحفيز الكهربائية نظراً لأنها لا تميز بين الخلايا العصبية المصابة وغير المصابة، وبالتالي نتائج مختلطة والمخفف. لأنه يمكن أن يستحث التحفيز البصرية متعددة إمكانات العمل15، من المهم أن تختار إلا أسرع تحقيقات أوبتوجينيتيك، بين توسيع لوح15،19،،من2021. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري ضمان أن التحفيز البصري الحث على عدم ديبولاريزيشن مباشرة من presynaptic boutons، لتجنب تجاوز بعض الخطوات لانتقال متشابك أحد يرغب في التحقيق في22.
النهج التجريبي الذي يصف لنا هنا، يجعل من الممكن لتقييم بالتوازي مع أهمية الفسيولوجية للجينات بريسينابتيك متعددة للفائدة خلال فترة زمنية محدودة (4 – 6 أشهر). ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن كنوكدوونس نادراً ما تصل إلى 100%. وعلاوة على ذلك، تحتاج رافس يعبر عنه لمدة أسبوعين على الأقل للسماح للتعبير ضربة قاضية وكامل القصوى للتحقيق أوبتوجينيتيك، التي قد تمثل قيداً وقت عند التحقيق في العمليات الإنمائية المبكرة. على الرغم من الفئران خروج المغلوب مضيعة للوقت، والشرطي أكثر محدودة للخلايا العصبية presynaptic، يؤدي عموما في إكمال إزالة الجينات للفائدة ونقدم لذلك اتباع نهج متكاملة صالحة.
ميزة معينة من التكنولوجيا مير أنه يمكن التعبير عن ميرس متعددة من نفس المروج. قد استخدمت هذه الخاصية أساسا لزيادة كفاءة ضربة قاضية بإدراج نسخ متعددة من نفس مير أو ميرس مختلفة ضد نفس الجين المستهدف. ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لضربة قاضية جينات متعددة بالإعراب عن ميرس ضد مستهدفة مختلفة الجينات7،23. يمكن استخدام هذه الخاصية لإسكات البروتينات presynaptic متعددة تشريح مسارات إشارات بريسينابتيك.
وهنا جمعنا بين أوبتوجينيتيكس مع ميرس مصطنعة لوصف آثار ضربة قاضية الجينات في الدالة بريسينابتيك في شرائح هيبوكامبال الحاد. يمكن أيضا استخدام نهجاً مماثلاً التلاعب والتحقيق في الدوائر العصبية في فيفو. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين ميرس الاصطناعية مع تشيموجينيتيك النهج سيمكن أحد باستجواب الدوائر العصبية على فترات زمنية أطول.

ويصف هذا البروتوكول نهجاً جديداً لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. التحقيق في الدالة بريسينابتيك في الدوائر العصبية سليمة هو التحدي نظراً لأن العديد من بتونس بريسينابتيك صغيرة جداً وبعيدا من سوما للسماح بالجمع بين التدخلات الجزيئية والكهربية. على الرغم من أن تدخل الجيش الملكي النيبالي يوفر وسيلة قوية ومرنة للبروتينات متشابك ضربة قاضية1، هذا النهج قد استخدمت ماما للتحقيق الدالة بريسينابتيك لأنه من الصعب الكشف عن آثار ضربة قاضية باستخدام التقليدية التحفيز الكهربائية، التي لا تميز بين التلاعب والسذاجة boutons بريسينابتيك2. هنا، نحن تصف كيفية الجمع بين ميكرورنا الاصطناعية (مير)-تدخل الجيش الملكي النيبالي مع التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا أوبتوجينيتيك لتحقيق التحفيز الانتقائي من boutons بريسينابتيك التلاعب في شرائح الدماغ الحادة بوساطة.
يمكن أيضا استخدام الفئران مشروطة بالضربة القاضية في تركيبة مع الكهربية للتحقيق في وظيفة البروتينات بريسينابتيك3،4، استراتيجيتنا لا يتطلب تطوير وصيانة وراثيا تعديل خطوط الماوس، ويمكن أيضا أن تستخدم بسهولة نهدم isoforms محددة من الجينات. النسبي لأكثر شيوعاً دبوس الشعر القصير المستخدمة الكشف (شرناس)، ميرس الاصطناعية، التي نستخدمها هنا، تقدم المزايا الرئيسية لضربة قاضية في الخلايا العصبية. وخلافا شرناس، يمكن أعربوا تحت سيطرة المروج الثاني بوليميراز1. وهكذا، يمكن استخدام مشجع واحد لمحرك التعبير عن مير وتحقيقا أوبتوجينيتيك، جنبا إلى جنب مع مراسل فلورسنت. وبهذه الطريقة، يمكن الاحتفاظ بحجم بناء المؤتلف فيروسات الغدد المرتبطة (راف، الشكل 1A) في حدود التعبئة والتغليف. أيضا، يقلل استخدام بنية واحدة ومروج واحدة تجريبية تقلب لأنه يسمح للتعبير عن مير والتحقيق أوبتوجينيتيك والمراسل الفلورسنت في نسبة ثابتة.
نحن مؤخرا تطبيق هذه التكنولوجيا دراسة دور isoforms المقسمة كبديل لقنوات الكالسيوم بريسينابتيك في الحصين5. هذه استراتيجية تنطبق بصورة عامة إلى دراسة أهمية الفسيولوجية للبروتينات الأخرى أعربت عن بريسينابتيكالي في أي دائرة الدماغ للفائدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heat pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K4936-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices Prechamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera-based imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc&#8482; MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin ointment</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection micropipettes</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic salts &#38; detergents</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-creatine phosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>237911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGluconate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-GFM-00100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>Protran&#8482; 0.2 &#181;m NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular lubricant</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Lacrigel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044, P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mini-Protean III Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone iodine</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic apparatus</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1069</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

والغرض من هذا البروتوكول لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. يمكننا وصف سير عمل في كيفية الجمع بين ميكرورنا الاصطناعية (مير)-تدخل الجيش الملكي النيبالي في أوبتوجينيتيكس لتحقيق التحفيز الانتقائي من boutons بريسينابتيك التلاعب في شرائح الدماغ الحادة بوساطة. النهج التجريبي الذي ينطوي على استخدام تركيبة فيروسية واحد ومروج العصبية محددة واحدة محرك التعبير عن كلا من المسبار أوبتوجينيتيك ومصطنعة miR(s) ضد gene(s) بريسينابتيك. عند حقن ستيريوتاكتيكالي في منطقة الدماغ للفائدة، بناء أعرب يجعل من الممكن لحفز مع الضوء حصرا الخلايا العصبية مع انخفاض التعبير عن gene(s) قيد التحقيق. هذه الاستراتيجية لا يتطلب تطوير وصيانة خطوط الماوس المعدلة وراثيا ويمكن من حيث المبدأ تطبيق للكائنات الحية الأخرى وأي الجينات الخلايا العصبية للاختيار. لقد قدمنا طلبا للتحقيق كيف ينظم ضربة قاضية isoforms الوصلة البديلة لقنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة P/Q-نوع بريسينابتيك (فجككس) قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى نهايات ضادات CA1 في شرائح هيبوكامبال الحادة مؤخرا. يمكن أيضا استخدامها نهجاً مماثلاً التلاعب والتحقيق في الدوائر العصبية فيفو.

الإجراءات المذكورة أعلاه توفر وسيلة قوية لتقييم انتقال متشابك كيف يتأثر بضربه قاضية للبروتينات متشابك في الخلايا العصبية بريسينابتيك. النتائج ممثلة في كيفية لصق ضربة قاضية لبديل isoforms presynaptic Cav2.1 فجككس (نوع-P/Q) ينظم قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى CA1 ضادات نقاط الاشتباك العصبي وترد أدناه كمثال.
Cav2.1 (نوع-P/Q) هي القنوات فجككس بريسينابتيك الغالبة في نهايات أكثر سرعة في الجهاز العصبي المركزي. البديلة الربط من exons التبادلية و 37a و 37b فرعية1 α تشكيل المسام Cav2.1 (α1A) تنتج الخيارين الرئيسية وكاليفورنياv2.1 [الجميع] وكاليفورنياv2.1 [EFb]16،17 ،18. لتحديد ما إذا كان Cav2.1 [الجميع] وكاليفورنياv2.1 [EFb] خلطات تنظيم انتقال متشابك واللدونه في الخلايا العصبية الهرمية هيبوكامبال الفئران، أولاً وضعنا ميرس isoform محددة لضربة قاضية بشكل انتقائي Caالخامس 2.1 [الجميع] أو Cav2.1 [EFb]5. وعلى الرغم من الحجم القصير (97 bp) والتشابه عالية (هوية 61.86% على مستوى النوكليوتيدات) بين exons 37a و 37b، يمكن أن نقوم بتصميم ثلاث متواليات مير ضد الفئران Cav2.1 [الجميع] (مير EFa1: تككتاتاجتجاتجكجككج؛ مير EFa2: أتجتككتاتاجتجاتجكج؛ مير EFa3: تجكاجكاكككتاتجاجا) واثنان ضد الفئران Cav2.1 [EFb] (مير EFb1: أتاكاتجتككججتاجكات؛ مير EFb2: أتكتجاتاكاتجتككججتا) مع توقع ارتفاع كفاءة ضربة قاضية. كمراقبة سلبية (مير التحكم)، استخدمنا بلازميد pcDNA6.2-غيغاواط/امجفب-مير-الراتب الذي يحتوي على تسلسل التي لا تستهدف أي الجينات الفقاريات المعروفة. استناداً إلى شاشة أولى في الخلايا HEK 293 ضد القنوات مغايرة، تحديد مير EFa1 ومير EFa3 مير EFb2 والمستنسخة على شرائط التعبير إلى 3 ' UTR ناقل بافسينتشيتاتدتميركس، الذي صمم لإنتاج رافس، وحيث محركات مروج سينابسين التعبير تشانيلرهودوبسين فائق السرعة ChETA والبروتين الأحمر نيون تدتوماتو مير المدرج (الشكل 1). ونحن أيضا تكرار كاسيت التعبير من مير EFb2 لزيادة كفاءة ضربة قاضية لهذا مير.
المقبل، على استعداد rAAV1/2 على بنيات الأربعة المذكورة أعلاه، وكمياً كفاءتها ضربة قاضية والانتقائية في الثقافات الخلايا العصبية الأولية الفئران استخدام محددة isoform qRT-بكر. مير EFa1 مير EFa3 تخفيض ومرناً الأصلي Cav2.1 [الجميع] ~ 70% ولكن ليس هذا المرجع المصدقv2.1 [EFb]، في حين خفضت مير EFb مرناً الأصلي Cav2.1 [EFb] ~ 60% ولكن ليس هذا المرجع المصدقv2.1 [الجميع] (الشكل 2).
نحن ثم ستيريوتاكتيكالي حقن كل من أربعة rAAV1/2 في منطقة CA3 الحصين الفئران p18 وبطاقات مجانية (الشكل 3 ألف-ج)، مع الإحداثيات (أ-ف/M-L/د-V، من بريجما) −2.6/± 2.9/−2.9. حقن بعد خمسة عشر إلى أربعة وعشرين يوما، إعداد شرائح هيبوكامبال الحاد من rAAV1/2-حقن الفئران وتستخدم تدتوماتو الأسفار تأكيد التعبير وإضفاء الطابع المحلي على رافس (الشكل 3B). للتحقيق في ما إذا كانت ضربة قاضية presynaptic Cav2.1 [الجميع] أو Cav2.1 [EFb] أثرت قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى نهايات CA1، نحن تحفز الخلايا العصبية CA3 المصابة بشكل انتقائي مع 473 نانومتر الليزر الخفيفة نبضات قصيرة (2 مللي طوله ; الشكل 3)، وسجلت ابسكس الناتجة من الترقيع الخلايا العصبية الهرمية في الدانية إلى المسالك الآنسي المنطقة CA1 (الشكل 3). وجدنا أن ضربة قاضية لكاليفورنياv2.1 الوصلة isoforms تتأثر الاستجابات لتحفيز نبض إقران في اتجاهين معاكسين: ضربة قاضية لكاليفورنياv2.1 [الجميع] (مير EFa1 أو مير EFa3) عزز نبض إقران التيسير (PPF) حين ضربة قاضية للمرجع المصدق v2.1 [EFb] (مير EFb2) بإلغائها (3D الشكل، هاء).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> الشكل 1: مخطط بنيات للتعبير مجتمعة أوبتوجينيتيك فائق السرعة مسبار ChETA وميرس isoform محددة ضد كاليفورنياv2.1 [الجميع] وكاليفورنياv2.1 [EFb]. (أ) خريطة راف بناء بافسينتشيتاتدتميركس، التي تحتوي على مروج سينابسين (Syn)، تشانيلرهودوبسين فائق السرعة تنصهر ChETA تدتوماتو، وفي الدانية 3 ' UTR، كاليفورنياv2.1 وصلة خاصة isoform مير. إنزيمات التقييد هو موضح يتم تقطيعه واحدة. (ب) نظام أعلى، من كاسيت التعبير. مروج سينابسين محركات التعبير ChETA-تدتوماتو ومير isoform محددة. أسفل، تكملة عكس تسلسل الهدف 21-النوكليوتيدات، التي تشكل جزءا من كاسيت مير. مير EFb2 أبديت اثنين مير متطابقة شرائط جنب واحدة تلو الأخرى. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> الرقم 2. تقييم كفاءة ضربة قاضية والانتقائية في ميرس isoform محددة لكاليفورنياv2.1 [الجميع] وكاليفورنياv2.1 [EFb]- تحليل محددة Isoform qRT-بكر في الجيش الملكي النيبالي معزولة عن الثقافات الأولية DIV 17-18 المصابين رافس معربا عن ميرس تستهدف أما Cav2.1 [الجميع] (مير EFa1 ومير EFa3) في الدرجة 6 أو Cav2.1 [EFb] (مير EFb2). يتم تطبيع البيانات إلى عنصر تحكم السلبية (مير التحكم). مير EFa1 ومير EFa3 إلى حد كبير وانتقائية خفض مرناً Cav2.1 [الجميع] (n = الثقافات 7 و 8، على التوالي)، في حين أن مير EFb كثيرا وانتقائية يقلل مرناً Cav2.1 [EFb] (n = 4 الثقافات؛ * * * ف < 0.001؛ واتجاه تحليل الفرق اختبار متبوعاً بالاختبار بعد توكي-كرامر). وترد البيانات يعني ± sem. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ثالهاممير، A. et al. 5- <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> الشكل 3. تقييم دور Cav2.1 [الجميع] وكاليفورنياv2.1 [EFb] في الحصين الأصلية التي تستهدف تحفيز الخلايا العصبية طرقت إلى أسفل مع أوبتوجينيتيكس- (أ) مخطط كاسيت التعبير من بنيات راف المستخدمة للعدوى في الجسم الحي . (ب) قسم هيبوكامبال تبين أن الأسفار تدتوماتو لا تقتصر على منطقة CA3 وإسقاطاتها. (ج) تكوين التجريبية: تم توجيه شعاع الليزر على سوماتى CA3، وأجريت تسجيلات المشبك التصحيح من CA1 الخلايا العصبية الهرمية. (د) 2 مللي طوله الأزرق (473 nm) نبضات ضوء الليزر أشرق في 20 هرتز استحضار ابسكس الذين PPF هو زاد ميرس استهداف Cav2.1 [الجميع] وألغى بموجب مير لكاليفورنياv2.1 [EFb]. (ه) ملخص لنسبة النبض إقران للتجارب كما هو الحال في (د)، تظهر زيادة في PPF مير EFa1 ومير EFa3 ونقصان مير EFb2، النسبي إلى محطة مير التحكم (n = تسجيلات 9-11؛ * p = 0.02؛ * * ف = 0.01؛ * * * ف < 0.0004؛ وتحليل التباين المشترك). وترد البيانات يعني ± sem. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ثالهامير، A. et al. 5- <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

يوفر هذا البروتوكول سير عمل في كيفية الجمع بين تدخل الجيش الملكي النيبالي microRNA بوساطة الاصطناعية مع أوبتوجينيتيكس لحفز على وجه التحديد presynaptic boutons مع انخفاض التعبير عن gene(s) انتقائية داخل الدوائر العصبية سليمة.

الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

رسم الدوائر العصبية المثبطة بواسطة المسح الضوئي ليزر ضوئي

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

طرق تسجيل متعددة الوحدات لوصف النشاط العصبي في الجراد (<em&gt; الجراد الصحراوي أمريكانا</em&gt;) الدوائر الشم

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

تحديد نوع الخلايا العصبية مع أوبترودي زجاج في الفئران مستيقظا أوبتوجينيتيكس

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

في تصوير الكالسيوم فيفو خلايا الشعر الخط الجانبي في الزرد اليرقات

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

الجمع بين السلوك وتخطيط كهربية الدماغ لدراسة آثار التأمل الذهني على الذاكرة العرضية

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...