Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Vi takker F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) for støtte og Carmela Vitale for at hjælpe med demonstrationen. Dette arbejde blev finansieret af IIT og Compagnia San Paolo (grant no. 9734 til LAC).

<ol>
	<li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+loss+of+P/Q-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice.">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li><li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+postnatal+loss+of+P/Q-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy,+dyskinesia,+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations.">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li><li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+P/Q-Type+Ca2++Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity.">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs.">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC/miR-155.">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins.">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li><li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition.">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845 (2014).</li><li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes.">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels.">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li><li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2+/calmodulin-dependent+facilitation+of+P/Q-type+Ca2++channels.">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li><li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P/Q-type+channel+alpha1(2.1)+subunits:+implications+for+current+density+and+Ca2+-dependent+inactivation.">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone:+a+designer's+guide+to+potent+multi-target+RNAi.">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Co udtryk af en optogenetic sonde og en miR mod en præsynaptiske gen af interesse tilbyder en kraftfuld tilgang for at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. For denne eksperimentelle tilgang er det vigtigt at identificere og karakterisere miRs, der er meget effektive og selektiv i banke ned gen interesse for indfødte systemer. Hvis det er muligt, bør to eller flere uafhængige miRs mod den samme mRNA interesse anvendes til kontrol for eventuel off target effekter. Rescue eksperimenter, hvor et miR-resistente gen er genindført i systemet, kan bruges som en kontrol for specificitet.
Ved hjælp af den samme konstruktion til at udtrykke en optogenetic sonde og en miR giver mulighed for at stimulere optisk kun de præsynaptiske neuroner, der er blevet manipuleret. Det er ikke muligt med elektrisk stimulering, fordi de ikke skelner mellem inficerede og ikke-inficeret neuroner, dermed producere blandet og fortyndet resultater. Fordi optiske stimulering kan fremkalde flere handling potentialer15, er det vigtigt at vælge kun de hurtigste optogenetic sonder, blandt en ekspanderende palet15,19,20,21. Derudover er det vigtigt at sikre, at optisk stimulation ikke fremkalde en direkte depolarisering af præsynaptiske boutons, for at undgå at omgå nogle af trinene af synaptisk transmission man ønsker at undersøge22.
Den eksperimentelle tilgang vi beskrive her, gør det muligt at evaluere parallelt fysiologiske relevansen af flere præsynaptiske gener af interesse inden for en begrænset periode (4-6 måneder). Det er dog vigtigt at huske at knockdowns sjældent nå op på 100%. RAAVs skal desuden udtrykkes i mindst to uger til at give mulighed for maksimal knockdown og fulde udtryk af optogenetic sonde, som kan repræsentere en tidsmæssig begrænsning, når undersøger tidlige udviklingsprocesser. Selvom flere tidskrævende, betinget knockout mus begrænset til præsynaptiske neuroner resulterer generelt i fuldstændig fjernelse af gen af interesse og tilbyder derfor en gyldig komplementære tilgang.
En specifik fordel af miR-teknologi er, at det giver udtryk for flere miRs fra samme initiativtageren. Denne egenskab er primært blevet brugt til at øge knockdown effektivitet ved at indsætte flere kopier af den samme miR eller forskellige miRs mod det samme mål-gen. Det kan dog bruges også til knockdown flere gener ved at udtrykke miRs mod forskellige mål gener7,23. Denne egenskab kan bruges til at lukke munden på flere præsynaptiske proteiner for at dissekere præsynaptiske signaling veje.
Her, har vi kombineret optogenetics med kunstige miRs at karakterisere gen knockdown virkning på præsynaptiske funktion i akutte hippocampus skiver. En lignende fremgangsmåde kan også bruges til at manipulere og sonde neuronal kredsløb i vivo. Desuden vil kombinere kunstige miRs med chemogenetic tilgange aktivere en afhøre neuronal kredsløb på længere tidsskalaer.

Denne protokol beskriver en ny tilgang for at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. Undersøge præsynaptiske funktion i intakt neuronal kredsløb udfordrende, fordi mange præsynaptiske boutons er for små og langt væk fra soma at tillade kombineret molekylære og elektrofysiologiske interventioner. Selv RNA-interferens tilbyder en kraftfuld og fleksibel metode til knockdown synaptic proteiner1, har denne tilgang været brugt sparsomt at undersøge præsynaptiske funktion, fordi det er vanskeligt at påvise effekten af knockdown ved hjælp af traditionelle elektrisk stimulering, der ikke skelner mellem manipuleret og naive præsynaptiske boutons2. Her, vi beskriver, hvordan du kombinere kunstige mikroRNA (miR)-medieret RNA-interferens med nyligt udviklede optogenetic teknologi til at opnå selektiv stimulation af manipulerede præsynaptiske boutons i akut hjernen skiver.
Mens betinget knockout mus i kombination med Elektrofysiologi kunne også bruges til at undersøge funktionen af præsynaptiske proteiner3,4, kræver vores strategi ikke udvikling og vedligeholdelse af genetisk modificeret mus linjer og også nemt kan være ansat for at vælte specifikke isoformer af et gen. I forhold til mere almindeligt brugte kort hårnål RNA'er (shRNAs), kunstige miRs, som vi anvender her, tilbyder vigtige fordele for knockdown i neuroner. I modsætning til shRNAs, kan de udtrykkes under kontrol af en polymerase II promotor1. Således, en enkelt promotor kan bruges til at drive udtryk for både miR og en optogenetic sonde, sammen med en fluorescerende reporter. På denne måde, kan størrelsen af konstruktionen holdes inden emballagen for rekombinante adeno-associeret virus (rAAV, figur 1A). Også, brug af en enkelt konstruktion og en enkelt promotor reducerer eksperimentel variation fordi det giver mulighed for udtryk for miR, optogenetic sonde og fluorescerende reporter i et fast forhold.
Vi har for nylig anvendt denne teknologi til at undersøge rollen, som alternativt splejset isoformer af præsynaptiske calcium kanaler i hippocampus5. En sådan strategi er generelt gælder for at studere den fysiologiske relevansen af andre presynaptically udtrykte proteiner i enhver hjernen kredsløb af interesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heat pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K4936-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices Prechamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera-based imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc&#8482; MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin ointment</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection micropipettes</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic salts &#38; detergents</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-creatine phosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>237911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGluconate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-GFM-00100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>Protran&#8482; 0.2 &#181;m NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular lubricant</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Lacrigel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044, P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mini-Protean III Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone iodine</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic apparatus</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1069</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

Formålet med denne protokol er at karakterisere effekten af gen knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt neuronal kredsløb. Vi beskriver en arbejdsproces på hvordan man kan kombinere kunstige mikroRNA (miR)-medieret RNA-interferens med optogenetics at opnå selektiv stimulation af manipulerede præsynaptiske boutons i akut hjernen skiver. Den eksperimentelle tilgang indebærer anvendelse af en enkelt viral konstruktion og en enkelt neuron-specifik initiativtager til at drive udtryk for både en optogenetic sonde og kunstige miR(s) mod præsynaptiske molekylærgenetisk. Når stereotactically injiceres i det pågældende område, hjernen, gør den udtrykte konstruktion det muligt at stimulere med lys udelukkende neuroner med reducerede udtryk for molekylærgenetisk under undersøgelsen. Denne strategi kræver ikke udvikling og vedligeholdelse af genmodificerede mus linjer og kan i princippet anvendes til andre organismer og enhver neuronal gen af valg. Vi har for nylig anvendt det for at undersøge, hvordan knockdown af alternative splice isoformer af præsynaptiske P/Q-type spænding-gated calcium kanaler (VGCCs) regulerer kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 ophidsende synapser i akut hippocampus skiver. En lignende fremgangsmåde kan også bruges til at manipulere og sonde neuronal kredsløb in vivo.

De procedurer, der er beskrevet ovenfor giver en robust metode til at vurdere hvordan synaptisk transmission påvirkes af knockdown synaptic proteiner i præsynaptiske neuroner. Repræsentative resultater på hvordan knockdown alternativ splejse isoformer af præsynaptiske Cav2.1 (P/Q-type) VGCCs regulerer kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 ophidsende synapser gives nedenfor som et eksempel.
Cav2.1 (P/Q-type) kanaler er de fremherskende præsynaptiske VGCCs på mest hurtig synapser i centralnervesystemet. Alternativ splicing af de gensidigt eksklusive exons 37a og 37b af poreformede α1 underenhed af Cav2.1 (α1A) producerer to store varianter, Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. For at afgøre, om Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] varierende regulere synaptisk transmission og plasticitet i rotte hippocampus pyramideformet neuroner, vi først udviklet isoform-specifikke miRs til knockdown selektivt Cav 2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb]5. Trods den korte størrelse (97 bp) og høj lighed (61.86% identitet på niveauet nukleotid) mellem exons 37a og 37b, vi kunne designe tre miR sekvenser mod rotte Cav2.1 [EFa] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) og to mod rotte Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) med forventet høj knockdown effektivitet. Som negativ kontrol (miR kontrol) brugte vi pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmid som indeholder en sekvens der ikke gør indskyde nogen kendte hvirveldyr genet. Baseret på en første skærmbillede i HEK 293 celler mod heterolog kanaler, vi valgt miR EFa1, miR EFa3 og miR EFb2 og klonede deres udtryk kassetter i 3' UTR af vektoren pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, som er beregnet til produktion af rAAVs og hvor de synapsin promotor drev udtryk for den ultrahurtig channelrhodopsin ChETA, den røde fluorescerende protein TdTomato og de indsatte miR (figur 1). Vi også duplikeres udtryk kassette af miR EFb2 at øge denne miR knockdown effektivitet.
Næste, vi forberedte rAAV1/2 for de ovennævnte fire konstruktioner, og kvantificeret deres knockdown effektivitet og selektivitet i primære rotte neuronal kulturer ved hjælp af isoform-specifikke qRT-PCR. miR EFa1 og miR EFa3 reduceret mRNA af indfødte Cav2.1 [EFa] af ~ 70%, men ikke de Cav2.1 [EFb], mens miR EFb reduceret mRNA af indfødte Cav2.1 [EFb] af ~ 60%, men ikke de Cav2.1 [EFa] (figur 2).
Vi så stereotactically injiceres hver af de fire rAAV1/2 CA3 område af hippocampus P18 rotter (figur 3A-C), med koordinater (A-P/M-L/D-V fra Bregma) −2.6 / ± 2.9 / −2.9. Femten til tyve-fire dage efter injektionen, vi forberedt akut hippocampus udsnit fra rAAV1/2-indsprøjtning rotter og brugt TdTomato fluorescens for at bekræfte udtryk og lokalisering af rAAVs (figur 3B). For at undersøge, om præsynaptiske knockdown enten Cav2.1 [EFa] eller Cav2.1 [EFb] berørt kortsigtede synaptisk plasticitet på CA3 til CA1 synapser, stimuleret vi selektivt inficerede CA3 neuroner med korte 473 nm laser lys pulser (2 ms-lange ; Figur 3 c), og indspillede de resulterende EPSCs af lappe pyramideformet neuroner i den proksimale til mediale tarmkanalen af regionen CA1 (figur 3 c). Vi fandt, at knockdown af Cav2.1 splice isoformer påvirkede svar til parret impuls stimulation i modsatte retninger: knockdown Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 eller miR EFa3) boostet parret puls facilitering (PPF) mens knockdown ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) afskaffet det (figur 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figur 1: Ordning af konstruktioner for kombinerede udtryk for ultrahurtig optogenetic sonde ChETA og isoform-specifikke miRs mod Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. (A) kort over rAAV konstruere pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, der indeholder en synapsin promoter (Syn), ultrahurtig channelrhodopsin ChETA sammenvokset til TdTomato, og i den proksimale 3' UTR, en Cav2.1 splice isoform-specifikke miR. Restriktionsenzymer vist er enkelt kuttere. (B) Top, ordning af udtryk kassette. Synapsin selskabet drev udtryk for både ChETA-TdTomato og en isoform-specifikke miR. Bunden, reverse supplement af 21-nukleotid target-sekvenser, der indgår i miR kassette. MiR EFb2 var to identiske miR kassetter udtrykt i tandem, ene efter den anden. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Figur 2. Evaluering af knockdown effektivitet og selektivitet af isoform-specifikke miRs for Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb]. Isoform-specifikke qRT-PCR analyse på RNA isoleret fra 17-18 DIV primære kulturer inficeret på 6 DIV med rAAVs udtrykker miRs målretning enten Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 og miR EFa3) eller Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Dataene er normaliseret til den negative kontrol (miR kontrol). miR EFa1 og miR EFa3 betydeligt og selektivt reducere mRNA Cav2.1 [EFa] (n = 8 og 7 kulturer, henholdsvis), mens miR EFb betydeligt og selektivt reducerer mRNA Cav2.1 [EFb] (n = 4 kulturer *** p < 0,001; envejs analyse af varians test efterfulgt af Tukey-Kramer post-test). Data præsenteres som betyder ± SEM. Dette tal er blevet tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Figur 3. Vurdering af rollen som Cav2.1 [EFa] og Cav2.1 [EFb] i native hippocampus ved målrettet stimulation af bankede-nede neuroner med optogenetics. (A) ordningen af udtryk kassette af rAAV konstruktioner bruges til i vivo infektion. (B) hippocampus sektion viser at TdTomato Fluorescens er begrænset til regionen CA3 og sine fremskrivninger. (C) eksperimentelle konfiguration: laserstråle var rettet på CA3 somata og patch klemme optagelser blev udført fra CA1 pyramideformet neuroner. (D) 2 ms-lang blå (473 nm) lys laserpulser skinnede på 20 Hz fremmane EPSCs hvis PPF er steget med miRs målretning Cav2.1 [EFa] og afskaffet af miR for Cav2.1 [EFb]. (E) Resumé af parret puls ratio for eksperimenter som (D), viser en stigning i PPF for miR EFa1 og miR EFa3 og et fald til miR EFb2, relativ til miR kontrol (n = 9-11 optagelser; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0,0004; analyse af Kovarians). Data præsenteres som betyder ± SEM. Dette tal er blevet tilpasset fra Thalhammer, A. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Denne protokol indeholder en arbejdsproces i at kombinere kunstige mikroRNA-medieret RNA-interferens med optogenetics at stimulere specifikt præsynaptiske boutons med reducerede udtryk for selektiv molekylærgenetisk inden for intakt neuronal kredsløb.

Ved at kombinere Optogenetics med kunstige MicroRNA at karakterisere effekter af genet Knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt Neuronal kredsløb

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Optagelse metoder til karakterisering af neurale aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Lugtesansen Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

A Procedure til implantering Organized Arrays af Microwires for Single-unit optagelser i Vågn op, fungerende dyr

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Optogenetics identifikation af en Neuronal Type med et glas Optrode i vågen mus

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

I Vivo Calcium billeddannelse af laterale-line hårcellerne i larve zebrafisk

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Kombination af adfærd og EEG for at studere virkningerne af mindfulness meditation på episodisk hukommelse

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...