Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Мы благодарим F. Бенфенати (Istituto Italiano ди Tecnologia, ИИТ) за поддержку и Carmela Витале за помощь с демонстрацией. Эта работа финансировалась ИИТ и Compagnia-Сан-Паоло (Грант № 9734 лак).

<ol>
	<li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+loss+of+P/Q-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice.">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li><li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+postnatal+loss+of+P/Q-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy,+dyskinesia,+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations.">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li><li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+P/Q-Type+Ca2++Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity.">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs.">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC/miR-155.">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins.">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li><li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition.">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845 (2014).</li><li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes.">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels.">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li><li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2+/calmodulin-dependent+facilitation+of+P/Q-type+Ca2++channels.">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li><li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P/Q-type+channel+alpha1(2.1)+subunits:+implications+for+current+density+and+Ca2+-dependent+inactivation.">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone:+a+designer's+guide+to+potent+multi-target+RNAi.">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Совместное выражение optogenetic зонд и мир против Пресинаптический гена интереса предлагает мощный подход к характеризуют эффект нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей. Этот экспериментальный подход важно определить и охарактеризовать Мирс, которые являются весьма эффективным и избирательно в стучать вниз Джин интерес к родной систем. Если возможно два или более независимых Мирс против же mRNA интереса должны использоваться для управления для возможного пробить эффектов. Спасательная эксперименты, в которых мир устойчивостью генов вновь в системе, может использоваться как элемент управления для характерности.
С помощью этой же конструкции выразить optogenetic зонд и мир позволяет для стимулирования оптически только Пресинаптический нейронов, которые были манипулировать. Это не возможно с электрической стимуляции, потому что они не делают различий между инфицированных и неинфицированных нейронов, таким образом производящ разреженных и смешанные результаты. Потому что оптический стимуляцию могут вызвать несколько потенциалы действия15, важно выбрать только быстрый optogenetic зонды, среди20,15,расширение палитры версии19,21. Кроме того важно обеспечить что оптический стимуляции не побудить прямой деполяризации Пресинаптический boutons, чтобы избежать, минуя некоторые из шагов синаптической передачи один хочет расследовать22.
Экспериментальный подход, мы описали здесь, делает возможным оценить параллельно физиологические актуальность нескольких Пресинаптический генов интерес в течение ограниченного периода времени (4 – 6 месяцев). Однако важно иметь в виду, что нокдаунов редко достигает 100%. Кроме того rAAVs должны быть выражены по крайней мере две недели для обеспечения максимальной нокдаун и полного выражения optogenetic зонд, который может представлять время ограничение при изучении процессов раннего развития. Хотя больше времени, условное нокаут мышей, ограничиваясь Пресинаптический нейронов, обычно приводят в полное удаление гена интереса и поэтому предлагаем действительный взаимодополняющий подход.
Конкретные преимущества технологии мир является, что он позволяет выражение несколько Мирс от же промоутер. Это свойство главным образом используется для повышения эффективности нокдаун, включив несколько копий же мир или различных Мирс против же целевого гена. Однако можно использовать также для нокдаун несколько генов выразить Мирс против различных целевых генов7,23. Это свойство может использоваться для замолчать несколько Пресинаптический белки вскрыть Пресинаптический сигнальных путей.
Здесь мы объединили Оптогенетика с искусственным Мирс охарактеризовать воздействие нокдаун гена на пресинаптическом функции в острой срезах гиппокампа. Аналогичный подход мог бы также использоваться для манипулировать и зонд нейронной схемы в естественных условиях. Кроме того объединение искусственных Мирс с chemogenetic подходы позволят один допросить нейронных цепей на длиннее время весы.

Этот протокол описывает новый подход к характеризуют эффект нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей. Расследование Пресинаптический функции в нетронутыми нейронных цепей является сложной задачей, потому что многие Пресинаптический boutons слишком малы и далеко от Сома разрешить комбинированных вмешательств молекулярной и электрофизиологические. Хотя система РНК-интерференции предлагает мощные и гибкие средства нокдаун синаптических белков1, этот подход был использован скупо расследовать Пресинаптический функция, потому что это трудно обнаружить эффекты нокдаун, с использованием традиционных электрическую стимуляцию, которые не делают различий между манипулировать и наивно Пресинаптический boutons2. Здесь мы опишем, как объединить искусственные микроРНК (мир)-опосредованной РНК-интерференции с недавно разработанных optogenetic технологии для достижения выборочной стимуляции манипулировать Пресинаптический boutons острой мозга ломтиками.
В то время как условного нокаут мышей в сочетании с электрофизиологии может также использоваться для изучения функции Пресинаптический белки3,4, наша стратегия не требует разработки и поддержания генетически изменение линии мыши и также могут быть легко использованы для сбить конкретных изоформ гена. Относительно более широко используемых шпильки короткие РНК (процессируются), искусственные Мирс, которые мы используем здесь, предлагают преимущества для нокдаун в нейронах. В отличие от процессируются они могут быть выражены под контролем полимеразы II промоутер1. Таким образом один промоутер может использоваться для привода выражение мир и optogenetic зонд, вместе с репортером флуоресцентные. Таким образом размер конструкции может храниться в пределах упаковки рекомбинантного адено связанные вирусов (rAAV, рис. 1A). Кроме того использование одной конструкции и один промоутер снижает экспериментальной изменчивость, потому что она позволяет для выражения мир, optogenetic зонд и флуоресцентные репортер в фиксированное соотношение.
Недавно мы применили эту технологию для изучения роли альтернативно сращивания изоформ Пресинаптический кальциевых каналов в гиппокампе5. Такая стратегия общеприменимых к изучению физиологические актуальность других пресинаптически выраженной белков в любой мозг цепи интерес.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heat pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K4936-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices Prechamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera-based imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc&#8482; MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin ointment</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection micropipettes</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic salts &#38; detergents</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-creatine phosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>237911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGluconate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-GFM-00100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>Protran&#8482; 0.2 &#181;m NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular lubricant</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Lacrigel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044, P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mini-Protean III Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone iodine</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic apparatus</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1069</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

Цель настоящего Протокола заключается в характеризуют эффект нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей. Мы описываем рабочего процесса о том, как объединить искусственные микроРНК (мир)-опосредованной РНК-интерференции с Оптогенетика для достижения выборочной стимуляции манипулировать Пресинаптический boutons острой мозга ломтиками. Экспериментальный подход предполагает использование одного вирусного конструкцию и один нейрон конкретных промоутер ехать на выражение optogenetic зонд и искусственные miR(s) против Пресинаптический gene(s). Когда вентрикуло вводят в регионе мозга интереса, выраженной конструкция делает возможным для стимулирования светом исключительно нейроны с сокращением выражением gene(s) под следствием. Эта стратегия не требует разработки и поддержания генетически модифицированные мыши линии и может в принципе применяться для других организмов и любой нейрональных ген выбора. Недавно мы применили его для расследования, как сногсшибательно альтернативных сращивания изоформ Пресинаптический P/Q-тип закрытого напряжения кальциевых каналов (VGCCs) регулирует краткосрочных синаптической пластичности в CA3 для СА1 возбуждающим синапсов в острой срезах гиппокампа. Аналогичный подход мог бы также использоваться для манипулировать и зонд нейронной схемы в естественных условиях.

Описанные выше процедуры предоставляют надежный метод для оценки как синаптической передачи зависит от нокдаун синаптических белков в пресинаптическом нейронов. Представитель результаты как нокдаун Альтернативный сплайсинг изоформ Пресинаптический Cav2.1 VGCCs (P/Q-тип) регулирует краткосрочных синаптической пластичности в CA3 СА1, возбуждающих синапсы, приводятся ниже в качестве примера.
CAv2.1 (P/Q-тип) каналы являются преобладающим Пресинаптический VGCCs на наиболее быстро синапсов в центральной нервной системе. Альтернативного сплайсинга из взаимоисключающих экзонов 37а 37b поры формирование Субблок1 α Cav2.1 (α1A) производит два основных варианта, Cav2.1 [ОДВ] и Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Чтобы определить ли Cav2.1 [ОДВ] и Cav2.1 [EFb] дифференциально регулировать синаптической передачи и пластичности в гиппокампе пирамидных нейронов крысы, мы впервые разработана Мирс изоформы специфичные для нокдаун выборочно Cav 2.1 [ОДВ] или Cav2.1 [EFb]5. Несмотря на короткий размер (97 bp) и высокий (61.86% идентификации на уровне нуклеотидов) сходство экзонов 37а и 37b, мы смогли бы создать три последовательности мир против крыс Cav2.1 [ОДВ] (мир EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; мир EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; Мир EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) и два против крыс Cav2.1 [EFb] (мир EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; мир EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) с прогнозируемой высокой эффективностью нокдаун. Как отрицательный контроль (мир управления) мы использовали плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP мир neg, содержащий последовательность, которая не цель любых известных позвоночных гена. Основываясь на первом экране в клетках ГЭС 293 против гетерологичных каналы, мы выбрали мир EFa1, мир EFa3 и мир EFb2 и клонировать их выражение кассеты в 3' УТР вектора pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, который предназначен для производства rAAVs и где Синапсин промоутер диски выражение сверхскоростной channelrhodopsin ChETA, красный флуоресцирующий белок TdTomato и вставленных мир (рис. 1). Мы также дублирует выражение кассеты мир EFb2 для увеличения нокдаун эффективности этот мир.
Далее мы готовились выше четырех конструкций rAAV1/2 и количественно их нокдаун эффективность и избирательности в первичной крыса нейрональных культур с помощью конкретных изоформы qRT ПЦР. Мир EFa1 и мир EFa3 уменьшена мРНК родной Cav2.1 [ОДВ] ~ 70%, но не Cav2.1 [EFb], в то время как мир EFb сокращены мРНК родной Cav2.1 [EFb] ~ 60%, но не Cav2.1 [ОДВ] (рис. 2).
Мы затем вентрикуло вводят каждый из четырех rAAV1/2 в районе CA3 гиппокампа крысы P18 (Рисунок 3А-C), с координатами (A-P/M-L/D-V от Bregma) −2.6 / ± 2.9 / −2.9. Пятнадцать-двадцать-четыре дня после инъекции, мы подготовили острый гиппокампа кусочки от rAAV1/2-вводили крысам и используется TdTomato флуоресценции для подтверждения выражение и локализации rAAVs (рисунок 3B). Расследовать, влияет ли Пресинаптический нокдаун Cav2.1 [ОДВ] или Cav2.1 [EFb] краткосрочных синаптической пластичности в CA3 к СА1 синапсы, мы стимулировали выборочно зараженных CA3 нейронов с кратким 473 Нм лазер световых импульсов (2 ms Лонг ; Рисунок 3 c) и записал результате EPSCs путем латать пирамидных нейронов проксимальнее медиального тракта области СА1 (рис. 3 c). Мы обнаружили, что нокдаун Cav2.1 сращивания изоформ пострадавших ответы на паре импульса стимуляции в противоположных направлениях: нокдаун Cav2.1 [ОДВ] (мир EFa1 или мир EFa3) увеличила упрощению паре пульс (ППС), тогда как нокдаун ЦС v2.1 [EFb] (мир EFb2) отменил его (рис. 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Рисунок 1: Схема конструкции для комбинированных выражение сверхскоростной optogenetic зонд ChETA и Мирс изоформы конкретных против Cav2.1 [ОДВ] и Cav2.1 [EFb]. (A) карта rAAV построить pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, содержащих Синапсин промоутер (Syn), сверхбыстрые channelrhodopsin ChETA плавленый TdTomato и в проксимальном 3' УТР, Cav2.1 сращивания изоформы специфичные мир. Показано энзимов ограничения являются одной фрезы. (B) сверху, схема выражение кассеты. Синапсин промоутер диски выражение ChETA-TdTomato и изоформы специфичные мир. Внизу, обратный дополнение 21-нуклеотида последовательности, которые являются частью мир кассеты. Для мир EFb2 две идентичных мир кассеты были выражены в тандеме, один после другого. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Рисунок 2. Оценка эффективности нокдаун и избирательности Мирс изоформы специфичные для Cav2.1 [ОДВ] и Cav2.1 [EFb]. Изоформы специфичные qRT ПЦР анализ на РНК, изолированных от 17-18 основных культур DIV инфицированных rAAVs, выражая МИРС, ориентации либо Cav2.1 [ОДВ] (мир EFa1 и мир EFa3) на 6 DIV или Cav2.1 [EFb] (мир EFb2). Данные нормализованы в отрицательный контроль (мир управления). Мир EFa1 и мир EFa3 выборочно и значительно уменьшить мРНК Cav2.1 [ОДВ] (n = 8 и 7 культур, соответственно), в то время как мир EFb выборочно и значительно уменьшает мРНК Cav2.1 [EFb] (n = 4 культур; *** p < 0,001; одностороннюю анализ дисперсия тест следуют Тьюки Креймер после тестирования). Данные представлены как означает ± SEM. Эта цифра была адаптирована из Thalhammer, а. и др. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> На рисунке 3. Оценка роли ЦСv2.1 [ОДВ] и Cav2.1 [EFb] в родной гиппокампе путем целенаправленных стимуляции разобранном нейронов с Оптогенетика. (A) схема выражение кассеты rAAV конструкции, используемые для инфекции в естественных условиях . (B) гиппокампа секции показаны что TdTomato флуоресценции ограничивается CA3 региона и его прогнозы. (C) экспериментальной конфигурации: лазерный луч был направлен на CA3 somata и патч зажим записи были выполнены из СА1 пирамидных нейронов. (D) 2 мс Лонг синий (473 Нм) световых импульсов лазерного светились на 20 Гц вызывают EPSCs которых PPF увеличилась на Мирс, ориентация Cav2.1 [ОДВ] и отменена мир для Cav2.1 [EFb]. (E) резюме паре импульсного коэффициента для экспериментов в (D), показывая рост в PPF мир EFa1 и мир EFa3 и снижение на мир EFb2, относительный мир управления (n = 9-11 записей; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0.0004; анализ ковариация). Данные представлены как означает ± SEM. Эта цифра была адаптирована из Thalhammer, а. и др. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Этот протокол обеспечивает рабочего процесса о том, как объединить искусственные микроРНК опосредованной РНК-интерференции Оптогенетика для стимулирования конкретно в пресинаптическом boutons с ограниченной выражением селективного gene(s) в пределах нетронутыми нейронных цепей.

Сочетание Оптогенетика с искусственных микроРНК охарактеризовать последствия нокдаун гена на пресинаптическом функции внутри нетронутыми нейронных цепей

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Сопоставление ингибирующих нейронов схем с Фотостимуляция лазерного сканирования

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-единицы Запись методы для характеристики нейронной активности в Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Обонятельные схемы

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Порядок Имплантация с организованной Массивы Микропровода с одноместным-единицы Recordings в Пробудитесь, Ведя Животные

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Оптогенетика идентификация типа нейронов с Optrode стекла в бодрствовать мышей

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

В естественных условиях кальция изображений боковой линии клетки волос в личиночной данио рерио

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Сочетание поведения и ЭЭГ для изучения влияния медитации осознанности на эпизодическую память

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Клин Фрагмент Подготовка для имитации In Vivo Нейрональной цепи подключения

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...