Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Agradecemos a F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) para apoyo y Carmela Vitale para ayudar con la demostración. Este trabajo fue financiado por el IIT y la Compagnia San Paolo (beca Nº 9734 a LAC).

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Coexpresión de una sonda de optogenetic y un miR contra un gene presináptico de interés ofrece un poderoso enfoque para caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Para este enfoque experimental, es importante identificar y caracterizar miRs que son altamente eficientes y selectivos en derribar el gen de interés en sistemas nativos. Si es posible, miRs independientes dos o más contra el mismo ARNm de interés puede usarse para control de posibles efectos off-target. Experimentos de rescate, en la que un gen resistente a la miR es reintroducido en el sistema, pueden utilizarse como un control de especificidad.
Utilizando la misma construcción para expresar una optogenetic sonda y un miR permite estimular ópticamente sólo las neuronas presinápticas que han sido manipuladas. Esto no es posible con estímulos eléctricos porque no distinguen entre las neuronas infectadas y no infectadas, produciendo resultados mezclados y diluidos. Debido a estímulos ópticos pueden inducir múltiples potenciales de acción15, es importante elegir sólo las sondas de optogenetic más rápidas, entre una creciente paleta15,19,20,21. Además, es esencial para asegurar que la estimulación óptica no induce una despolarización directa de botones presinápticos, para evitar pasar por algunos de los pasos de la transmisión sináptica se desea investigar22.
El enfoque experimental que se describe aquí, es posible evaluar en paralelo la relevancia fisiológica de genes múltiples presinápticos de interés dentro de un período de tiempo limitado (4 a 6 meses). Sin embargo, es importante tener en cuenta que caídas rara vez llega a 100%. Además, rAAVs necesitan expresarse durante al menos dos semanas permitir la máxima precipitación y completa expresión de la sonda de optogenetic, que puede representar una restricción de tiempo, la investigación de procesos de desarrollo tempranos. Aunque más ratones knockout condicional, desperdiciador de tiempo limitados a las neuronas presinápticas, generalmente como resultado completar la eliminación del gen de interés y, por tanto, ofrecer un enfoque complementario válido.
Una ventaja específica de la tecnología de miR es que permite la expresión de múltiples miRs de la promotora de la misma. Esta propiedad se ha utilizado principalmente para aumentar la eficiencia de precipitación mediante la inserción de copias múltiples del mismo miR o miRs diferentes contra el mismo gene de la blanco. Sin embargo puede ser utilizado también para caída múltiples genes expresando miRs contra diferentes genes7,23. Esta propiedad podría usarse para silenciar a múltiples proteínas presinápticas para diseccionar las vías de señalización presinápticas.
Aquí hemos combinado optogenetics con miRs artificiales para caracterizar los efectos de la precipitación del gene en la función presináptica en rebanadas hippocampal agudas. Un enfoque similar podría utilizarse también para manipular y la punta de prueba circuitos neuronales en vivo. Además, combinando miRs artificiales con chemogenetic enfoques permitiría a interrogar los circuitos neuronales en escalas de tiempo más largo.

Este protocolo describe un nuevo enfoque para caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Investigar la función presináptica en circuitos neuronales intactas es difícil porque muchos botones presinápticos son demasiado pequeños y lejos del soma para permitir intervenciones moleculares y electrofisiológicas combinadas. A pesar de interferencia de ARN ofrece un medio potente y flexible a la precipitación de las proteínas sinápticas1, este enfoque se ha utilizado con moderación para investigar la función presináptica porque es difícil detectar los efectos de la precipitación utilizando estímulos eléctricos, que no distinguen entre manipularon e ingenuo botones presinápticos2. Aquí, describimos cómo combinar artificial microARN (miR)-mediada por ARN de interferencia con tecnología de optogenetic recientemente desarrollados para lograr la estimulación selectiva de manipuladas botones presinápticos en rebanadas de cerebro agudo.
Mientras que los ratones condicionales en combinación con electrofisiología podrían utilizarse también para investigar la función de proteínas presinápticas3,4, nuestra estrategia no requiere el desarrollo y mantenimiento de genéticamente modificar líneas de ratón y también se puede emplear fácilmente derribar a isoformas específicas de un gen. Relativa más comúnmente usado horquilla corta RNAs (shRNAs), miRs artificiales, que empleamos aquí, ofrecen ventajas fundamentales para la caída en las neuronas. A diferencia de shRNAs, puede ser expresados bajo el control de una polimerasa II promotor1. Así, un promotor solo puede utilizarse para impulsar la expresión de miR y una sonda de optogenetic, junto con un reportero fluorescente. De esta forma, el tamaño de la construcción se puede mantener dentro de los límites de empaquetado de virus adeno-asociado recombinantes (rAAV, figura 1A). Además, el uso de una construcción única y un único promotor reduce variabilidad experimental porque permite la expresión de la miR, la sonda de optogenetic y el reportero fluorescente en un cociente fijo.
Recientemente hemos aplicado esta tecnología para examinar el papel de los isoforms alternativomente empalmada de canales de calcio presinápticos en el hipocampo5. Esta estrategia es generalmente aplicable al estudio de la relevancia fisiológica de otras proteínas presynaptically expresadas en los circuitos cerebrales de interés.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heat pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K4936-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices Prechamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera-based imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc&#8482; MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin ointment</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection micropipettes</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic salts &#38; detergents</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-creatine phosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>237911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGluconate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-GFM-00100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>Protran&#8482; 0.2 &#181;m NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular lubricant</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Lacrigel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044, P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mini-Protean III Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone iodine</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic apparatus</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1069</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

El propósito de este protocolo es caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Se describe un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microARN (miR)-mediada por ARN de interferencia con optogenetics para lograr la estimulación selectiva de manipuladas botones presinápticos en rebanadas de cerebro agudo. El enfoque experimental involucra el uso de una sola construcción viral y solo enolase promotor para conducir la expresión de una sonda de optogenetic y miR(s) artificial contra genes presinápticos. Cuando stereotactically inyectado en la región cerebral de interés, el concepto expresado hace posible estimular con luz exclusivamente las neuronas con la reducida expresión de los genes investigados. Esta estrategia no requiere el desarrollo y mantenimiento de líneas de ratón modificados genéticamente y puede en principio aplicarse a otros organismos y a cualquier gen neuronal de elección. Recientemente hemos aplicado para investigar cómo la caída de isoformas de empalme alternativos de canales de calcio voltaje-bloqueado de P/Q-type presinápticos (VGCCs) regula la plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 sinapsis excitatorias en rebanadas hippocampal agudas. Un enfoque similar podría utilizarse también para manipular y probe el circuito neuronal in vivo.

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para evaluar la transmisión sináptica cómo se ve afectado por la caída de proteínas sinápticas de las neuronas presinápticas. Resultados representativos de cómo la caída de alternativa empalme isoformas de presinápticos de Cav2.1 (P/Q-type) VGCCs regula plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 las sinapsis excitatorias se indican a continuación como ejemplo.
CAv2.1 (P/Q-type) los canales son los VGCCs presinápticas predominantes en las sinapsis más rápidas en el sistema nervioso central. Alternativa de empalme de los exones excluyentes 37a y 37b de la formación de poros α1 subunidad de Cav2.1 (α1A) produce dos variantes principales, Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Para determinar si Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb] diferencialmente regulan la transmisión sináptica y plasticidad en las neuronas piramidales hipocampales de rata, primero desarrollamos específica de isoforma miRs a caída selectiva de Cav 2.1 [EPT] o Cav2.1 [EFb]5. A pesar del tamaño corto (97 bp) y la alta semejanza (61.86% de identidad en el nivel de nucleótido) entre los exones 37a y 37b, podríamos diseñar tres secuencias miR contra rata Cav2.1 [EPT] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) y dos contra rata Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) con eficacia prevista de precipitación alta. Como control negativo (Control de la miR), se utilizó el plásmido pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg que contiene una secuencia que no dirige ningún gen vertebrado conocido. En base a una primera pantalla en células HEK 293 contra canales heterólogos, miR EFa1, miR EFa3 y miR EFb2 seleccionados y clonados sus cassettes de expresión en el 3' UTR del vector pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, que está diseñado para la producción de rAAVs y donde la promotor sinapsina unidades de expresión de la ultrarrápida channelrhodopsin ChETA, la proteína fluorescente roja TdTomato y el miR insertado (figura 1). También duplica el cassette de la expresión de miR EFb2 para aumentar la eficiencia de la precipitación de este miR.
A continuación, preparamos rAAV1/2 para las construcciones de cuatro arriba y cuantificó su precipitación eficiencia y selectividad en cultivos neuronales de rata primaria mediante qRT-PCR específica de isoforma. miR EFa1 miR EFa3 reducido y mRNA de nativa de Cav2.1 [EPT] ~ 70% pero no de Cav2.1 [EFb], mientras que miR EFb reducido mRNA de nativa de Cav2.1 [EFb] ~ 60% pero no de Cav2.1 [EPT] (figura 2).
Entonces stereotactically inyectamos cada uno de los cuatro rAAV1/2 en el área CA3 del hipocampo de ratas P18 (Figura 3A-C), con coordenadas de −2.6 (A-P/M-L/D-V de Bregma) / ± 2.9 / −2.9. Después de la inyección quince a veinte y cuatro días, preparamos rebanadas hippocampal agudas de ratas rAAV1/2-inyectado y utiliza fluorescencia TdTomato para confirmar la expresión y localización de rAAVs (figura 3B). Para investigar si caída presináptico de Cav2.1 [EPT] o Cav2.1 [EFb] afectó la plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 sinapsis, nos estimulan selectivamente infectadas neuronas CA3 con breve 473 nm láser pulsos ligeros (2 ms de duración ; Figura 3) y las resultantes EPSCs por parches de neuronas piramidales en la proximal a la zona medial de la región CA1 (figura 3). Encontramos que la caída de Cav2.1 isoformas de empalme afectado las respuestas a la estimulación de junto-pulso en direcciones opuestas: caída de Cav2.1 [EPT] (miR EFa1 o miR EFa3) impulsado facilitación de junto-pulso (PPF) Considerando que la precipitación de Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) había abolido (figura 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de las construcciones de la expresión combinada de la sonda de optogenetic ultrarrápida ChETA y miRs de la isoforma específica contra Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [CEE]. (A) mapa de la rAAV construir pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, que contiene un promotor sinapsina (Syn), channelrhodopsin ultrarrápida ChETA fundido a TdTomato y en el proximal 3' UTR, un miR de Cav2.1 empalme isoforma específica. Enzimas de restricción que se muestra son solo fresas. Esquema superior, (B) del casete de expresión. El promotor sinapsina unidades de expresión de una isoforma específica miR y ChETA-TdTomato. Fondo, complemento reverso de las secuencias diana de 21 nucleótidos, que forman parte de la cinta de miR. Para miR EFb2 dos casetes miR idénticos fueron expresados en tándem uno tras otro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Figura 2. Evaluación de la eficacia de derribo y selectividad de miRs de la isoforma específica de Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb]. Análisis específica de isoforma qRT-PCR de RNA aislado de cultivos primarios de 17-18 DIV infectados en DIV 6 con rAAVs expresando miRs a cualquiera de los dos Cav2.1 [EPT] (miR EFa1 y miR EFa3) o Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Datos son normalizados para el control negativo (Control de la miR). miR EFa1 y miR EFa3 selectiva y significativamente reducen el mRNA de Cav2.1 [EPT] (n = 8 y 7 culturas, respectivamente), mientras que miR EFb significativamente y de forma selectiva reduce el mRNA de Cav2.1 [EFb] (n = 4 culturas; *** p < 0.001; una vía análisis de prueba de varianza seguida por el post-test de Tukey-Kramer). Los datos se presentan como media ± SEM. Esta figura ha sido adaptada de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Figura 3. Evaluación del papel de Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb] en el hipocampo nativo por dirigida la estimulación de las neuronas derribado con optogenetics. (A) esquema de la cassette de expresión de las construcciones de rAAV utilizado para la infección en vivo . (B) sección hipocampo mostrando esa fluorescencia TdTomato se limita a la región CA3 y sus proyecciones. Configuración Experimental (C) : rayo láser fue dirigido en CA3 somata, y realizaron grabaciones de abrazadera del remiendo de neuronas piramidales de CA1. (D) 2 ms de duración azul (473 nm) pulsos de luz láser brillados en 20 Hz evocan EPSCs cuya PPF es aumentado por miRs a Cav2.1 [EPT] y suprimido por el miR para Cav2.1 [CEE]. Extracto (E) de la relación de junto-pulso para experimentos como en (D), mostrando un incremento en PPF para miR EFa1 y miR EFa3 y una disminución para miR EFb2, comparado con miR Control (n = 9-11 grabaciones; * p = 0.02; ** p = 0,01; *** p < 0,0004; análisis de covarianza). Los datos se presentan como media ± SEM. Esta figura ha sido adaptada de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

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