Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Biz F. Benfenati (Istituto Italiano di teknoloji, IIT) destek ve Carmela Vitale için gösteri ile yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Bu eser IIT ve Compagnia San Paolo (hibe No 9734 LAC) tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+loss+of+P/Q-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice.">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li><li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+postnatal+loss+of+P/Q-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy,+dyskinesia,+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations.">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li><li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+P/Q-Type+Ca2++Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity.">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs.">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC/miR-155.">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins.">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li><li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition.">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845 (2014).</li><li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes.">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels.">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li><li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2+/calmodulin-dependent+facilitation+of+P/Q-type+Ca2++channels.">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li><li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P/Q-type+channel+alpha1(2.1)+subunits:+implications+for+current+density+and+Ca2+-dependent+inactivation.">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone:+a+designer's+guide+to+potent+multi-target+RNAi.">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bir optogenetic sonda ve miR ilgi presynaptic bir gen karşı ortak ifadesi gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım sunmaktadır. Bu deneysel yaklaşım için tanımlamak ve son derece verimli ve yerel sistemler ilgi gen aşağı knocking seçici miRs karakterize önemlidir. Mümkünse, iki veya daha fazla bağımsız miRs ilgi aynı mRNA karşı kontrol etmek için nihai hedef kapalı efektleri kullanılmalıdır. Kurtarma deneyler, hangi miR dayanıklı bir gen sisteminde yeniden ortaya çıkar bir denetim olarak özgüllük için kullanılabilir.
Bir optogenetic ifade etmek için aynı yapıyı kullanarak sonda ve bir miR sağlar optik manipüle sadece presynaptic nöronlar uyarıcı için. Bu nedenle karışık ve seyreltilmiş sonuçlar üreten bulaşmış ve sigara enfekte nöronlar arasında ayrım yapmamak için bu elektrik elektrodlar ile mümkün değildir. Optik elektrodlar birden çok aksiyon potansiyelleri15neden olabilir çünkü bir genişleyen paleti15,19,20,21arasında sadece en hızlı optogenetic sondalar seçmek önemlidir. Buna ek olarak, optik stimülasyon presynaptic boutons doğrudan bir depolarizasyon teşvik değil, sinaptik iletimi adımlardan bazıları atlayarak önlemek için bir22araştırmak dilek sağlamak için önemlidir.
Biz burada, tarif deneysel yaklaşım paralel olarak sınırlı sürede (4-6 ay) birden çok presynaptic genler ilgi fizyolojik uygunluğunu değerlendirmek mümkün kılar. Ancak, nakavtlar nadiren % 100 ulaşmak aklınızda tutmanız önemlidir. Dahası, rAAVs maksimal devirme ve tam ifade bir süre sınırlaması ne zaman erken gelişimsel süreçleri soruşturma temsil edebilir optogenetic soruşturma için izin vermek en az iki hafta boyunca ifade edilmesi gerekir. Genellikle daha fazla zaman alıcı, koşullu nakavt fareler presynaptic nöronlar için sınırlı sonuçlanır rağmen faiz gen kaldırmayı tamamlamak ve bu nedenle geçerli tamamlayıcı bir yaklaşım sunuyoruz.
Birden fazla miRs aynı organizatörü üzerinden ifade sağlar miR teknolojinin belirli bir avantaj sağlıyor. Bu özellik, birden çok kopyasını aynı miR veya farklı miRs karşı aynı hedef gen ekleyerek devirme verimliliğini artırmak için esas olarak kullanılmıştır. Ancak olabilir karşı farklı hedef genlerin7,23miRs ifade ederek nakavt için birden çok gen kullanılıyor. Bu özellik presynaptic sinyal yolları incelemek için birden çok presynaptic proteinler susturmak için kullanılabilir olur.
Burada, akut Hipokampal dilimler presynaptic işlevinde gen nakavt etkilerini karakterize etmek için yapay miRs ile optogenetics birleştirdik. Benzer bir yaklaşım, değiştirmek ve nöronal devreler vivo içindeyoklama için de kullanılabilir. Buna ek olarak, yapay miRs chemogenetic ile birleştirerek yaklaşımlar bir uzun zaman ölçeklerde nöronal devreler sorgulamaya sağlayacak.

Bu iletişim kuralı gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize etmek için yeni bir yaklaşım açıklar. Presynaptic işlevinde olduğu gibi nöronal devreler araştıran pek çok presynaptic boutons çok küçük olduğundan ve uzak kombine moleküler ve Elektrofizyolojik müdahaleler izin vermek için soma meydan okuyor. RNA müdahale devirme sinaptik proteinler1için güçlü ve esnek bir araç içerse bu yaklaşım idareli giriþi özelliðini kullanarak nakavt etkileri tespit etmek zordur çünkü presynaptic işlevi araştırmak için kullanılmıştır arasında ayrım yapmamak elektrik elektrodlar manipüle ve saf presynaptic boutons2. Burada, biz nasıl yapay mikroRNA (miR) birleştirmek açıklayın-akut beyin dilimleri içinde işlenmiş presynaptic boutons seçici uyarılması elde etmek için son zamanlarda geliştirilen optogenetic teknolojisi ile RNA müdahale aracılı.
Koşullu nakavt fareler Elektrofizyoloji ile birlikte aynı zamanda presynaptic proteinler3,4işlevi araştırmak için kullanılabilir gibi görünse, bizim strateji geliştirme ve bakım genetik olarak gerektirmez fare satırları değiştirilmiş ve aynı zamanda kolayca belirli bir gen izoformlarının vurmak için istihdam edilebilir. Göreli daha yaygın olarak kullanılan kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs), biz burada istihdam, yapay miRs nöronlar içinde nakavt için önemli avantajlar sunuyoruz. ShRNAs, onlar bir polimeraz II organizatörü1kontrol altında ifade edilebilir. Böylece, tek bir organizatörü miR ve floresan bir muhabir ile birlikte bir optogenetic sonda ifadesi sürücü için kullanılabilir. Bu şekilde, yapı boyutu rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV, şekil 1A) ambalaj sınırları içinde tutulabilir. Ayrıca, miR, optogenetic sonda ve sabit bir oranda floresan muhabir ifadesi izin veren bir yayın için tek bir yapı ve tek bir organizatörü kullanımı deneysel değişkenliği azaltır.
Son zamanlarda presynaptic kalsiyum kanal Hipokampus5alternatif olarak spliced izoformlarının rolünü incelemek için bu teknolojiyi başvurdum. Bu tür bir strateji genellikle fizyolojik alaka ilgi herhangi bir beyin devre presynaptically ifade diğer proteinlerin eğitim için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Temperature Controller with heat pad</td>
			<td>WPI</td>
			<td>ATC2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K4936-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain slices Prechamber</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BSC-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera-based imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc&#8482; MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin ointment</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>54459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection micropipettes</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inorganic salts &#38; detergents</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2-creatine phosphate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>237911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGluconate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser</td>
			<td>Laserglow Technologies</td>
			<td>LRS-0473-GFM-00100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>Protran&#8482; 0.2 &#181;m NC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IM-H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular lubricant</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Lacrigel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044, P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cOmplete&#8482;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Mini-Protean III Cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone iodine</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiazol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect Reverse 
			Transcription Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>205311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic apparatus</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1069</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

Bu iletişim kuralı gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize amacıdır. Biz nasıl yapay mikroRNA (miR) birleştirmek için bir iş akışı tarif-RNA müdahale ile optogenetics akut beyin dilimleri içinde işlenmiş presynaptic boutons seçici uyarılması ulaşmak için aracılık. Deneysel bir tek viral yapı ve bir optogenetic sonda ve yapay miR(s) presynaptic gene(s) karşı ifade sürücü için tek bir nöron özel organizatörü kullanımını gerektirir. Stereotactically faiz beyin bölgesi enjekte edildiğinde ifade yapısı ışıkla sadece nöronlar gene(s) soruşturma altında azaltılmış ifade ile teşvik olanak sağlar. Bu strateji geliştirme ve genetiği değiştirilmiş fare satırlarının Bakım gerektirmez ve diğer organizmalar ve nöronal herhangi bir gen seçim için prensip olarak uygulanabilir. Biz son zamanlarda nasıl CA3 adlı kısa vadeli sinaptik plastisite CA1 eksitatör sinapslarda akut Hipokampal dilimleri içinde için alternatif splice izoformlarının presynaptic P/Q-tipi voltaj kalsiyum kanal (VGCCs) nakavt düzenleyen araştırmak için başvurdum. Benzer bir yaklaşım, değiştirmek ve nöronal devresi içinde vivoyoklama için de kullanılabilir.

Yukarıda açıklanan yordamlar nasıl sinaptik iletimi değerlendirmek için sağlam bir yöntem presynaptic nöronlar sinaptik proteinlerin nakavt etkiler sağlar. Nasıl alternatif nakavt splice izoformlarının presynaptic Cav2.1 temsilcisi sonuçlarında (P/Q-tipi) VGCCs CA3 CA1 eksitatör sinapslarda örnek olarak aşağıda verilmiştir için kısa vadeli sinaptik plastisite düzenlemektedir.
CAv2.1 (P/S-type) kanallar vardır, merkezi sinir sistemi içinde en hızlı sinapslarda baskın presynaptic VGCCs. Alternatif Uçbirleştirme dışlayan ekzonlar 37a ve 37b bir gözenek oluşturan α1 alt Cav2.1 (α1A) birimi üreten iki ana çeşidi, Cav2.1 [EFa] ve Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. CAv2.1 [EFa] ve Cav2.1 [EFb] differentially sinaptik iletimi ve sıçan Hipokampal piramidal nöronların plastisite düzenleyen olup olmadığını belirlemek için ilk izoformu özgü miRs nakavt için seçmeli olarak geliştirdiğimiz Cav 2.1 [EFa] veya Cav2.1 [EFb]5. Kısa boyutuna karşın (97 bp) ve yüksek benzerliği (%61.86 kimlik nükleotit düzeyinde) arasında ekzonlar 37a 37b, biz tasarım ve üç miR dizileri karşı Cav2.1 [EFa] fare (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) ve iki fare Cav2.1 [EFb] karşı (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) öngörülen yüksek devirme verimlilik ile. (MiR denetim) negatif kontrol bilinen herhangi bir omurgalı gen hedef değil bir sıra içeren pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negatif plazmid kullandık. İlk ekran Contegra kanalları karşı HEK 293 hücrelerdeki bağlı olarak, seçili miR EFa1, miR EFa3 ve miR EFb2 ve içine 3' UTR rAAVs üretimi için tasarlanmış vektör pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, onların ifade kaset klonlanmış ve nerede synapsin organizatörü ultrafast channelrhodopsin ChETA, kırmızı floresan protein TdTomato ve eklenen miR (şekil 1) ifade ediyor. Biz de miR bu miR devirme verimliliğini artırmak için EFb2 ve ifade kaset çoğaltılamaz.
Ardından, rAAV1/2 yukarıdaki dört yapıları için hazırlanan ve devirme etkinlik ve seçicilik izoformu özgü qRT-PCR kullanarak birincil fare nöronal kültürlerde sayılabilir. miR EFb mRNA yerel Cav2.1 [EFb] ~ 60 oranında ama bu Cav2.1 [EFa] (Şekil 2) azaltılmış iken miR EFa1 ve miR EFa3 mRNA yerel Cav%2.1 ~ 70 [EFa] ama bu Cav2.1 [EFb], azaltılmış.
Biz daha sonra stereotactically her biri dört rAAV1/2 P18 fareler (şekil 3A-C), Hipokampus CA3 alanına (A-P/M-L/D-V Bregma gelen) −2.6 koordinatları ile enjekte / ± 2.9 / −2.9. On beş yirmi dört gün sonrası enjeksiyon, akut Hipokampal dilimler rAAV1/2-Injected sıçanlarından emir hazırlanmış ve TdTomato floresan ifade ve rAAVs (3B rakam) lokalizasyonu onaylamak için kullanılan. Presynaptic nakavt [EFb] Cav2.1 [EFa] veya Cav2.1 CA3 adlı kısa vadeli sinaptik plastisite CA1 sinapslarda için etkilenen olup olmadığını araştırmak için biz seçmeli olarak enfekte CA3 nöronlar kısa 473 nm lazer ışık darbeleri (2 ms-uzun ile uyarılmış ; Şekil 3 c) ve piramidal nöronların proksimal medial yolu CA1 bölgesinin (şekil 3 c) için yama tarafından elde edilen EPSCs kaydedildi. Cav2.1 splice izoformlarının nakavt yanıt için eşleştirilmiş-nabız stimülasyon ters yönde etkilenen bulduk: nakavt [EFa] (miR EFa1 veya miR EFa3) Cav2.1 artırdığını eşleştirilmiş-nabız kolaylaştırma (PPF) ise Ca'nın devirme v2.1 [EFb] (miR EFb2) o (şekil 3D, E) kaldırıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Resim 1: Şeması yapıları ultrafast optogenetic sonda ChETA ve izoformu özgü miRs Cav2.1 [EFa] ve Cav2.1 [EFb] karşı kombine ifade için. (A) rAAV haritası oluşturmak pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, synapsin organizatörü (Syn) içeren, TdTomato ve içinde proksimal 3' UTR, bir Cav2.1 splice izoformu özgü miR ChETA ultrafast channelrhodopsin erimiş. Kısıtlama gösterilen tek kesiciler enzimlerdir. (B) en iyi, düzeni ifade kaset. Synapsin düzenleyici ChETA-TdTomato ve bir izoformu özgü miR ifade ediyor. Alt, miR kaset parçası 21-nükleotit hedef sıralarının geriye doğru tamamlayıcı. MiR EFb2 için iki özdeş miR kaset birbiri ardına bir tandem ifade edildi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Şekil 2. Devirme verimliliği ve izoformu özgü miRs Cav2.1 [EFa] ve Cav2.1 [EFb] selectivity değerlendirilmesi. 17-18 DIV birincil kültürler 6 DIV ya Cav2.1 [EFa] (miR EFa1 ve miR EFa3) hedefleme miRs ifade rAAVs ile enfekte izole RNA izoformu özgü qRT-PCR analiz veya Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Veri negatif kontrol (miR denetim) normalleştirilmiş. miR EFa1 miR EFa3 önemli ölçüde ve seçmeli olarak azaltmak ve mRNA Cav2.1 [EFa] (n = 8 ve 7 kültürleri, sırasıyla), miR EFb önemli ölçüde ve seçmeli olarak azaltır [EFb] mRNA Cav2.1 iken (n 4 kültürler; = *** p < 0,001; tek yönlü analizi Varyans testi) Tukey Kramer sonrası test tarafından takip. Veri ± SEM demek olarak sunulan Bu rakam Thalhammer, A. ve ark. adapte edilmiş 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Şekil 3. Rolü Cav2.1 [EFa] ve Cav2.1 [EFb] tarafından yerel Hipokampus değerlendirirken hedef çaldı aşağı nöronlar optogenetics ile uyarılması. Vivo enfeksiyonu için kullanılan rAAV yapıları ve ifade kaset (A) şeması. ((B)) Hipokampal bölümünde gösterilen TdTomato floresan CA3 bölge ve onun projeksiyonlar ile sınırlıdır. (C) deneysel yapılandırma: lazer ışını CA3 somata Yönetmen: ve yama kelepçe kayıtları CA1 piramidal nöronların gerçekleştirilen. (D) 2 ms-uzun mavi (473 nm) lazer ışık darbeleri 20 Hz parlıyordu uyandırmak kimin PPF Cav2.1 [EFa] hedefleme miRs tarafından arttı ve miR Cav2.1 [EFb] tarafından kaldırılmış EPSCs. (E) gösterilen bir artış miR denetim göreli PPF miR EFa1 ve miR EFa3 ve bir düşüş miR EFb2, için için özetini eşleştirilmiş-nabız oranı (D), olduğu gibi deneyler için (n = 9-11 kayıtları; * p 0,02; = ** p = 0,01; *** p < 0.0004; Kovaryans analizi). Veri ± SEM demek olarak sunulan Bu rakam Thalhammer, A. ve ark. adapte edilmiş 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Bu iletişim kuralı, yapay mikroRNA aracılı RNA müdahale optogenetics özellikle presynaptic boutons selektif gene(s) sağlam nöronal devreler içinde azaltılmış ifade ile uyarmak için birleştirmek bir iş akışı sağlar.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Lazer Tarama Photostimulation tarafından inhibitör nöronal devreler Haritalama

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Bir cam Optrode uyanık farelerde nöronal türüyle Optogenetics tanımlaması

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Farkındalık Meditasyonunun Epizodik Hafıza Üzerindeki Etkilerini İncelemek için Davranış ve EEG'yi Birleştirmek

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...