Name: analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells at JoVE.com

وأيد هذا العمل منح التمويل من جمعية القلب الأمريكية (J.Q.K.).

عليها جميع الأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة أموري.
ملاحظة: الجزء الأول هو الإجراء التجريبي لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام قارئ لوحة.
1-الكواشف والحلول
<ol><li>جعل 500 مل من...

<ol>
	<li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria.">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li><li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria.">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li><li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart:+energetics+and+beyond.">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li><li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions.">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li><li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium:+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming.">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+Na+/Ca2++exchanger+is+essential+for+Ca2++homeostasis+and+viability.">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li><li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex.">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li><li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling.">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li><li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood.">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).</li><li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha.">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca(2+)+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria.">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li><li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria.">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li><li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans.">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141 (2010).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes.">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li><li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms.">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li><li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake.">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2++uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes.">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles.">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li></ol>

وهنا يصف لنا نهجين مختلفين لقياس المتقدرية Ca2 + التدفق. لوحة الكالسيوم المستندة إلى القارئ الأخضر-5N أسلوب شاشات اكستراميتوتشوندريال Ca2 + المستويات وهو Ca2 + امتصاص مقايسة التي مناسبة تماما للقياسات في الميتوكوندريا المعزولة. وفي حين أننا قد أظهرت نتائج تمثيلية من الميتوكون...

الميتوكوندريا هي المواقع الحاسمة من Ca2 + مخزن داخل الخلايا والإشارات. عقود أبحاث أظهرت أن الميتوكوندريا لديها القدرة على الاستيراد، وتنحية Ca2 + 1،2. الميتوكوندريا، ومع ذلك، ليست المواقع مجرد السلبي من Ca2 + مخزن. Ca2 + في حجرة المتقدرية يؤدي وظائف الإشارات الأساسية بما في ذلك تنظيم المخرجات الأيضية وتفعيل مسارات الموت المتقدرية يتوسط الخلية، التي تم استعراضها سابقا3. للتنظيم الأيضي، Ca2 + يعزز نشاط ثلاثة dehydrogenases المترجمة بمصفوفة دورة حمض تريكاربوكسيليك، فضلا عن مجمعات سلسلة التنفس، لزيادة إنتاج الطاقة المتقدرية4،5 . مع المتقدرية Ca2 + التحميل الزائد و dysregulated المتقدرية Ca2 + المناولة، المسام Ca2 + مشغلات نفاذية المتقدرية الانتقال افتتاح (MPTP)، مما يؤدي إلى بيرميبيليزيشن المتقدرية الغشاء الداخلي، تمزق الأغشية الخسارة المحتملة، خلل mitochondrial، تورم، وفي نهاية المطاف، الخلية وفاة6،7،،من89. وهكذا، Ca2 + إشارات المتقدرية تؤثر تأثيراً مباشرا الحياة الخلوية ومسارات الموت عن طريق السيطرة الأيضية ومحور MPTP الموت.
في السنوات الأخيرة، هناك وقد تم التوسع بسرعة الاهتمام بدراسة المتقدرية Ca2 + ديناميات المستحقة في جزء كبير لتحديد مكونات جزيئية من Ca2 + أونيبورتير المتقدرية المعقدة، الداخلية المتقدرية استيراد غشاء الناقل الذي وضع الأولية من Ca2 + إلى11،،من 10مصفوفة المتقدرية12. تحديد هذه الوحدات الفرعية الهيكلية والتنظيمية أونيبورتير قد أوجد إمكانية استهداف وراثيا المتقدرية Ca2 + تدفق تعدل وظيفة الميتوكوندريا والخلل وتيسير الدراسة مساهمة من أونيبورتير المعقدة والمتقدريه Ca2 + التدفق للمرض13،،من1415. والواقع أن mitochondrial Ca2 + إشارات قد تورط في الأسباب المرضية لمجموعة متنوعة من الأمراض بدءاً من أمراض القلب نيوروديجينيريشن، وسرطان16،،من1718، ،من 1920.
نظراً لأهمية أساسية المتقدرية Ca2 + إشارات في الأيض وموت الخلايا، وجنبا إلى جنب مع نطاق واسع من النظم البيولوجية أن Ca2 + إشارات المتقدرية الآثار، أساليب تقييم المتقدرية Ca2 + تدفق ذات أهمية كبيرة. وليس من المستغرب، وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات وأدوات لقياس Ca المتقدرية2 + . وتشمل هذه الأساليب التي تستخدم أدوات مثل Ca نيون2 +-الأصباغ الحساسة21،22 المرمزة وراثيا Ca2 + وأجهزة الاستشعار والموجهة إلى الميتوكوندريا، مثل cameleon وأيكوورين23، 24. والهدف من هذه المقالة هو تسليط الضوء على مختلف أساليب ونظم النموذجي الذي يمكن أن يقاس Ca2 + امتصاص المتقدرية. نحن نقدم طريقتين تجريبية لتقييم المتقدرية Ca2 + تدفق القدرة. استخدام الميتوكوندريا القلب على سبيل مثال، نحن بالتفصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس Ca المتقدرية2 + صبغ الإقبال على استخدام Ca2 + حساسة الكالسيوم الأخضر-5N مثالي للأنسجة المعزولة الميتوكوندريا14 . باستخدام خلايا 3T3 المستزرعة في المعاهد الوطنية للصحة، يصف لنا أيضا تحليل القائم على تصوير مجهرية [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد باستخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/ص25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>886000-0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Green-5N</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker green FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R1244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru360</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>557440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells

Ca2 + التعامل مع الميتوكوندريا وظيفة هامة في تنظيم العمليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية سواء في مجموعة واسعة نطاق من الخلايا. القدرة على قياس التدفق وافلوكس من Ca2 + من الميتوكوندريا بدقة مهم لتحديد دور المتقدرية Ca2 + المناولة في هذه العمليات. وفي هذا التقرير، نقدم طريقتين لقياس المتقدرية Ca2 + المناولة في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. أولاً أننا تفاصيل منصة المستندة إلى قارئ لوحة لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال على استخدام Ca2 + صبغة حساسة الكالسيوم الأخضر-5N. تنسيق المستندة إلى قارئ لوحة تلتف الحاجة إلى المعدات المتخصصة، وصبغ أخضر-5N الكالسيوم مثالي لقياس Ca2 + من الميتوكوندريا الأنسجة المعزولة. لطلبنا، يصف لنا قياس Ca2 + امتصاص المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القلب الماوس؛ ومع ذلك، يمكن تطبيق هذا الإجراء لقياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة أخرى مثل الكبد، والعضلات، والدماغ. وثانيا، يصف لنا تحليل القائم على الفحص المجهري [كنفوكل] لقياس المتقدرية Ca2 + في الخلايا بيرميبيليزيد استخدام Ca2 + حساسة صبغ Rhod-2/صباحا والتصوير المجهري ليزر المسح ثنائي الأبعاد باستخدام. يزيل هذا البروتوكول بيرميبيليزيشن صبغ سيتوسوليك التلوث، مما يسمح لتسجيل محددة من التغييرات في كاليفورنيا المتقدرية2 +. وعلاوة على ذلك، يسمح ليزر المسح المجهري للإطار معدلات عالية لالتقاط التغييرات السريعة في المتقدرية Ca2 + استجابة لمختلف العقاقير أو الكواشف المطبقة في الحل الخارجي. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على قياس المتقدرية Ca2 + الإقبال في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية مثل myocytes القلب والخلايا العصبية، وخطوط الخلية مخلدة.

ويبين الشكل 1 Ca المتقدرية2 + قياسات الامتصاص في الميتوكوندريا القلب معزولة باستخدام منصة المستندة إلى قارئ لوحة و Ca2 + صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. تحت ظروف التحكم (الشكل 1A)، علقت في المخزن المؤقت بوكل المحتوية على الكالسيوم الأخضر-5N ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells at JoVE.com

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca2 + استيراد الفحص باستخدام Ca2 + حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca2 + صبغ Rhod-2/م.

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

التجويف النيتروجين والطرد المركزي التفاضلي يسمح بمراقبة توزيع البروتينات الغشاء المحيطي في الخلايا المستزرعة

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

تحريض الخلايا الحمراء للدم باستخدام الكالسيوم الأيوني

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

القياس الكمي عالي الإنتاجية القائم على الصور لتخليق وتوزيع الحمض النووي للميتوكوندريا

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

المقايسات المستقلة عن الأكسجين لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الثدييات

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells

5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells (Video) | JoVE 

5-برومو-2&#39;-ديوكيوريدين (BrdU) وضع العلامات على الحمض النووي للميتوكوندريا في خلايا هيلا