Name: analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus American Heart Association (J.Q.K.).

Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Emory University genehmigt.
Hinweis: Der erste Teil ist die Versuchsdurchführung zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten kardialen Mitochondrien mit einem Teller-Reader.
(1) Reagenzien und Lösungen
<ol><li>500 mL MS-EGTA-Puffer für die mitochondriale Isolierung zu machen: 225 mM Mannit, 75 mM Saccharose, 4 5 mM-(2-h...

<ol>
	<li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria.">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li><li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria.">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li><li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart:+energetics+and+beyond.">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li><li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions.">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li><li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium:+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming.">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+Na+/Ca2++exchanger+is+essential+for+Ca2++homeostasis+and+viability.">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li><li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex.">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li><li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling.">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li><li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood.">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).</li><li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha.">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca(2+)+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria.">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li><li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria.">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li><li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans.">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141 (2010).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes.">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li><li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms.">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li><li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake.">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2++uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes.">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles.">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li></ol>

Hier beschreiben wir zwei verschiedene Ansätze zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom. Die Platte Leser-basierte Kalzium grün-5N Methode Monitore Extramitochondrial Ca2 + Ebenen und ist ein Ca2 + Aufnahme Assay, der gut geeignet für Messungen in isolierten Mitochondrien ist. Während wir repräsentative Ergebnisse aus isolierten murinen kardialen Mitochondrien gezeigt haben, kann dieser Assay Mitochondrien isoliert von Geweben mit hoher mitochondriale Fülle einschließlich Lebe...

Mitochondrien sind kritische Websites der intrazellulären Ca2 + -Lager- und Signaltechnik. Jahrzehntelange Forschungen haben gezeigt, dass Mitochondrien die Fähigkeit haben zu importieren und sequester Ca2 + 1,2. Mitochondrien, sind jedoch nicht nur passive Websites von Ca2 + -Lager. Ca2 + auf die mitochondriale Kompartiment führt grundlegende Signalisierung Funktionen einschließlich der Regulierung metabolische Ausgabe und Aktivierung von mitochondrialen vermittelte Zelle Tod wegen, wurde zuvor3überprüft. Für die Stoffwechselregulation erhöht Ca2 + die Aktivität von drei Matrix-lokalisierte Dehydrogenases Tricarboxylic Säure Zyklus sowie die Atmungskette komplexe, Erhöhung der Mitochondrien Energie Produktion4,5 . Mit mitochondrialen Ca2 + Überlastung und Dysregulated mitochondriale Ca2 + Handling Ca2 + Trigger mitochondrialen Permeabilität Übergang pore (MPTP) Öffnung, was zu inneren mitochondrialen Membran Permeabilisierung, Membran Verlustrisiko, mitochondriale Dysfunktion, Schwellungen, Bruch und letztlich Zelle Tod6,7,8,9. Daher wirkt sich mitochondriale Ca2 + Signalisierung direkt zelluläre Leben und Tod Wege durch metabolische Kontrolle und MPTP-Tod-Achse.
In den letzten Jahren, es wurde rasch erweitert Interesse an der Erforschung der mitochondrialen Ca2 + Dynamik im großen Teil zur Identifizierung der molekularen Bestandteile der mitochondrialen Ca2 + Uniporter Komplex, eine mitochondrial Inner Membran-Transporter, der eine primäre Ca2 + ist in der mitochondrialen Matrix 10,11,12importieren. Identifizierung von diesen strukturellen und regulatorischen Untereinheiten der Uniporter hat die Möglichkeit, gezielt genetisch mitochondriale Ca2 + Zustrom zu modulieren, mitochondriale Funktion und Dysfunktion hervorgebracht und erleichtert das Studium der der Beitrag der Uniporter komplex und mitochondriale Ca2 + Zustrom Krankheit13,14,15. In der Tat hat die mitochondriale Ca2 + Signalisierung in den Pathologien von den unterschiedlichsten Krankheiten wie Herzerkrankungen, Neurodegeneration und Krebs16,17,18verwickelt, 19,20.
Angesichts der grundlegenden Bedeutung der mitochondrialen Ca2 + signalisieren in den Stoffwechsel und Zelltod und kombiniert mit der großen Reichweite von biologischen Systemen auswirkt, mitochondriale Ca2 + Signalisierung, Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom von großem Interesse sind. Nicht überraschend, wurden eine Vielzahl von Techniken und Instrumenten zur mitochondrialen Ca2 + Messung entwickelt. Dazu gehören Methoden, die nutzen Sie Tools wie z. B. fluoreszierende Ca2 +-empfindlichen Farbstoffen21,22 und genetisch codierte Ca2 + Sensoren gezielt zu den Mitochondrien, wie z. B. Cameleon und Aequorin23, 24. Das Ziel dieses Artikels ist, markieren Sie verschiedene Methoden und Modellsysteme in denen mitochondrialen Ca2 + Aufnahme gemessen werden kann. Wir präsentieren zwei experimentelle Methoden zur Beurteilung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom Kapazität. Mit kardialen Mitochondrien als Beispiel, wir ausführlich eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N, die ideal geeignet ist für isolierte Gewebe Mitochondrien14 . Mit kultivierten Zellen der NIH-3 t 3, erläutern wir im folgenden eine konfokalen Mikroskopie Imaging-basierte Test zur Messung der mitochondrialen Ca2 + in permeabilized Zellen mit der Ca2 + sensibler Farbstoff Rhod-2/AM25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>886000-0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Green-5N</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker green FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R1244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru360</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>557440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells

Ca2 + Handhabung durch Mitochondrien ist eine kritische Funktion reguliert physiologische und pathophysiologische Prozesse in einem breiten Spektrum von Zellen. Die Fähigkeit, genau den Zustrom und Ausfluss von Ca2 + von Mitochondrien zu messen ist wichtig für die Bestimmung der Rolle der mitochondrialen Ca2 + Umgang in diesen Prozessen. In diesem Bericht stellen wir Ihnen zwei Methoden zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Handhabung in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Wir beschreiben zunächst eine Platte Leser-basierte Plattform zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme über die Ca2 + sensibler Farbstoff Kalzium grün-5N. Leser-basierte Plattenformat umgeht die Notwendigkeit für spezielle Ausrüstung und Kalzium grün-5N Farbstoff ist ideal geeignet zur Messung von Ca2 + aus isolierten Gewebe Mitochondrien. Für unsere Anwendung beschreiben wir die Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in den Mitochondrien von Herzgewebe Maus isoliert; Allerdings kann dieses Verfahren angewendet werden, zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in den Mitochondrien isoliert von anderen Geweben wie z. B. Leber, Skelettmuskel und Gehirn. Zweitens, beschreiben wir eine konfokale Mikroskopie-basierten Test zur Messung der mitochondrialen Ca2 + in permeabilized Zellen mithilfe des Ca2 + sensibleren Farbstoffs Rhod-2/AM und imaging mit 2-dimensionale Laserscanning-Mikroskopie. Dieses Protokoll Permeabilisierung beseitigt cytosolischen Farbstoff Kontamination, spezifische Aufzeichnung der Veränderungen der mitochondrialen Ca2 +ermöglicht. Laserscanning-Mikroskopie ermöglicht darüber hinaus hohe Bildraten erfassen schnelle Veränderungen mitochondrialen Ca2 + als Reaktion auf verschiedene Medikamente oder Reagenzien in die externe Lösung angewendet. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um mitochondrialen Ca2 + Aufnahme in vielen Zelltypen, einschließlich Primärzellen wie kardialen Myozyten Neuronen und immortalisierte Zelllinien zu messen.

Abbildung 1 zeigt mitochondriale Ca2 + Aufnahme Messungen in isolierten kardialen Mitochondrien mit der Platte Leser-basierte Plattform und die Ca2 + Kalzium grün-5N färben. Unter Kontrolle Bedingungen (Abbildung 1A), kardialen Mitochondrien in KCl-Puffer, enthält Kalzium grün-5N ausgesetzt waren und dann vor der Herausforderung, sequentielle Impulse von CaCl2 (5 μl einer 0,6 mm CaCl2</s...

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Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca2 + Import Assay mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca2 + Farbstoffs Rhod-2/AM.

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

Induktion der Eryptose in roten Blutkörperchen mit einem Calcium-Ionophor

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells

5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells (Video) | JoVE 

5-Brom-2&#39;-Desoxyuridin (BrdU) Markierung von mitochondrialer DNA in HeLa-Zellen