Name: analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק למימון איגוד הלב האמריקאי (J.Q.K.).

כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת אמורי.
הערה: החלק הראשון הוא ההליך ניסיוני. למדידת מיטוכונדריאלי Ca2 + זרם בתוך המיטוכונדריה לב מבודד שימוש בקורא צלחת.
1. נוגדנים ופתרונות
<ol><li>להפוך 500 מ"ל...

<ol>
	<li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria.">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li><li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria.">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li><li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart:+energetics+and+beyond.">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li><li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions.">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li><li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium:+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming.">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+Na+/Ca2++exchanger+is+essential+for+Ca2++homeostasis+and+viability.">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li><li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex.">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li><li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling.">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li><li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood.">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).</li><li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha.">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca(2+)+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria.">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li><li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria.">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li><li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans.">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141 (2010).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes.">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li><li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms.">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li><li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake.">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2++uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes.">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles.">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li></ol>

כאן, אנו מתארים שתי גישות שונות כדי למדוד Ca מיטוכונדריאלי2 + זרם. הצלחת סידן המבוסס על הקורא ירוק-5N שיטת צגים extramitochondrial Ca2 + רמות, Ca2 + ספיגת assay זה גם מתאים מידות המיטוכונדריה מבודד. בעוד אנחנו הראו תוצאות נציג מבודד מאתר המיטוכונדריה הלב, וזמינותו הזה יכול להיות מותאם בקלות ?...

המיטוכונדריה הם אתרים קריטיות של Ca תאיים2 + אחסון איתות. עשורים של מחקרים הוכיחו כי המיטוכונדריה יש את היכולת לייבא sequester Ca2 + 1,2. המיטוכונדריה, לעומת זאת, הם לא רק פסיבי אתרים של Ca2 + אחסון. Ca2 + -תא מיטוכונדריאלי מבצע היסוד פונקציות איתות לרבות ויסות חילוף החומרים פלט, הפעלה של מסלולים מוות תא מיטוכונדריאלי בתיווך, אשר כבר נבדקו בעבר3. עבור רגולציה חילוף החומרים, Ca2 + מגביר את הפעילות של שלוש dehydrogenases מטריקס מותאם לשפות אחרות של מחזור חומצה tricarboxylic, כמו גם קומפלקסי שרשרת הנשימה, כדי להגדיל את האנרגיה מיטוכונדריאלי ייצור4,5 . Ca מיטוכונדריאלי2 + עומס, dysregulated מיטוכונדריאלי Ca2 + טיפול, Ca2 + גורמים מפעילים חדירות מיטוכונדריאלי המעבר הנקבוביות הפתיחה (MPTP), המוביל אל permeabilization מיטוכונדריאלי הממברנה הפנימית, אובדן פוטנציאל ממברנה, תפקוד מיטוכונדריאלי, נפיחות, קרע וסלולרי בסופו של דבר, למוות6,7,8,9. לפיכך, Ca2 + איתות מיטוכונדריאלי משפיעה במישרין על החיים הסלולר והן מוות שבילים דרך בקרה מטבולית וציר MPTP-מוות.
בשנים האחרונות, שם במהירות הרחבה עניין במחקר של מיטוכונדריאלי Ca2 + דינמיקה עקב חלק גדול לזיהוי של המרכיבים מולקולרית מיטוכונדריאלי Ca2 + uniporter מורכבים, של הפנימית מיטוכונדריאלי טרנספורטר קרום זה מצב ראשי של Ca2 + לייבא לתוך מטריצה מיטוכונדריאלי 10,11,12. זיהוי של אלה subunits מבנית ותקינה של uniporter לדרדר את האפשרות של פילוח גנטי מיטוכונדריאלי Ca2 + זרם לווסת מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי, יעברו חקר התרומה של uniporter מיטוכונדריאלי ומורכבת Ca2 + זרם המחלה13,14,15. אכן, Ca2 + איתות מיטוכונדריאלי היה מעורב של פתולוגיות של מערך מגוון של מחלות ועד מחלות לב הקשורים ניוון מוחיים, וסרטן16,17,18, 19,20.
את החשיבות הבסיסית של מיטוכונדריאלי Ca2 + איתות של חילוף החומרים, מוות של תאים, בשילוב רחב של מערכות ביולוגיות הזה Ca2 + איתות מיטוכונדריאלי משפיע, שיטות להערכת מיטוכונדריאלי Ca2 + זרם הם עניין רב. באופן לא מפתיע, פותחו מגוון רחב של טכניקות וכלים למדידת Ca מיטוכונדריאלי2 + . אלה כוללים שיטות לנצל כלים כגון Ca פלורסנט2 +-צבעי רגיש21,22 ו מקודד גנטית Ca2 + חיישנים ממוקד המיטוכונדריה, כגון cameleon ו aequorin23, 24. המטרה של מאמר זה היא כדי להדגיש שיטות שונות ומערכות מודל שבו ניתן למדוד Ca מיטוכונדריאלי2 + ספיגת. אנו מציגים שתי שיטות נסיוניות להעריך Ca מיטוכונדריאלי2 + זרם קיבולת. באמצעות הלב המיטוכונדריה כדוגמה, אנחנו פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת Ca מיטוכונדריאלי2 + ספיגת באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N זה מתאים באופן אידיאלי עבור רקמה מבודדת המיטוכונדריה14 . שימוש בתרבית תאים 3T3 NIH, נתאר גם וזמינותו של דימות מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת מיטוכונדריאלי Ca2 + בתאים permeabilized באמצעות Ca2 + רגיש לצבוע רוד-2/AM25.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>886000-0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Green-5N</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker green FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R1244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru360</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>557440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells

Ca2 + טיפול על ידי המיטוכונדריה היא פונקציה קריטית ויסות תהליכים פיזיולוגיים והן pathophysiological, בקשת רחבה של תאים. היכולת למדוד במדויק את זרם ואת בזרימת של Ca2 + של המיטוכונדריה חשובה לקביעת בתפקיד מיטוכונדריאלי Ca2 + טיפול בתהליכים אלה. בדו ח זה, אנו מציגים שתי שיטות המדידה של Ca2 + טיפול מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד והן תאים בתרבית. אנחנו קודם פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת מיטוכונדריאלי Ca2 + ספיגת באמצעות של Ca2 + צבע רגיש סידן הירוק-5N. הפורמט מבוסס על הקורא צלחת עוקף את הצורך ציוד מיוחד, הצבע הירוק-5N סידן מתאימה באופן אידיאלי למדידת Ca2 + של המיטוכונדריה רקמה מבודדת. עבור היישום שלנו, אנו מתארים את המדידה של Ca2 + ספיגת מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מן העכבר רקמת הלב; עם זאת, ניתן להחיל הליך זה למדוד מיטוכונדריאלי Ca2 + ספיגת בתוך המיטוכונדריה מבודד לרקמות אחרות כגון הכבד, שרירי השלד, המוח. שנית, אנו מתארים assay מבוסס-מיקרוסקופ קונפוקלי למדידת מיטוכונדריאלי Ca2 + תאים permeabilized באמצעות Ca2 + רגיש לצבוע רוד-2/AM והדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקה בלייזר 2-ממדי. פרוטוקול permeabilization זה מבטל זיהום צבע cytosolic, המאפשר הקלטה ספציפית של שינויים ב Ca מיטוכונדריאלי2 +. יתר על כן, מיקרוסקופיה סריקה בלייזר מאפשר קצב גבוה ללכוד את השינויים המהירים מיטוכונדריאלי Ca2 + בתגובה סמים או ריאגנטים ליישם את הפתרון חיצוניים שונים. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי למדוד מיטוכונדריאלי Ca2 + ספיגת סוגי תאים רבים, כולל ראשי תאים כגון של תאי שריר הלב ונוירונים, שורות תאים מונצח.

איור 1 מציג Ca מיטוכונדריאלי2 + ספיגת מדידות מבודד המיטוכונדריה הלב באמצעות הפלטפורמה המבוססת על הקורא צלחת, Ca2 + סידן ירוק-5N צבע. בתנאים שליטה (איור 1 א'), המיטוכונדריה הלב היו מושעה אשלגן כלורי מאגר המכיל סידן ירוק-5N והזמנו ואז עם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells at JoVE.com

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

אינדוקציה של אירוטוזה בתאי דם אדומים באמצעות היואופלפור סידן

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells

5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells (Video) | JoVE 

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) תיוג של DNA מיטוכונדריאלי בתאי HeLa