Name: analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00
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この作品は、アメリカ心臓協会 (J.Q.K.) からの交付によって支えられました。

このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは、制度的動物のケアと使用エモリー大学委員会によって承認されています。
注: 最初の部分は、プレート リーダーを使用して分離心筋ミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +流入を測定する実験です。
1. 試薬および解決
<ol><li>500 mL のミトコンドリアの分離のための MS グリコールエーテ?...

<ol>
	<li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria.">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li><li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria.">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li><li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart:+energetics+and+beyond.">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li><li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions.">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li><li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium:+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming.">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li><li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2++trigger+site.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li><li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms.">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li><li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart.">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+Na+/Ca2++exchanger+is+essential+for+Ca2++homeostasis+and+viability.">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li><li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex.">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li><li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li><li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li><li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li><li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li><li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition.">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li><li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+document:+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure.">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li><li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling.">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li><li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood.">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).</li><li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha.">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li><li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca(2+)+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria.">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li><li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria.">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li><li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans.">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141 (2010).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators.">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes.">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li><li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms.">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li><li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li><li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake.">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li><li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy.">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li><li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2++uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes.">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li><li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles.">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li></ol>

ここでは、ミトコンドリアの Ca2 +流入を測定する 2 つの異なるアプローチについて述べる。プレート リーダー ベース カルシウム グリーン 5N 法モニター extramitochondrial Ca2 +レベルであり、Ca2 +取り込みアッセイは、分離ミトコンドリアでの測定に適しています。我々 は分離されたマウス心筋ミトコンドリアから代表的な結果を示している、このアッセイことが高いミ?...

ミトコンドリアは、細胞内 Ca2 +貯蔵とシグナル伝達の重要なサイトです。数十年の研究は、ミトコンドリアがインポートし、Ca2 + 1,2を隔離する能力を持っていることを示しています。しかし、ミトコンドリアは Ca2 +貯蔵の単なる受動的なサイトではありません。Ca2 +ミトコンドリアのコンパートメントで代謝の出力の調節などの基本的なシグナリング機能を実行し、ミトコンドリアを介した細胞死経路の活性化されている見直し以前3。代謝調節の Ca2 +活性を高めるトリカルボン酸だけでなく、呼吸鎖複合体、ミトコンドリアのエネルギー生産4,5 を増加する 3 マトリックス ローカライズ脱水素酵素の.ミトコンドリアの Ca2 +過負荷と調節不全ミトコンドリアの Ca2 +ハンドリング、Ca2 +トリガー ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (MPTP) 入り口、ミトコンドリア内膜の透過膜の潜在的な損失、ミトコンドリア機能障害、腫脹、破裂し、最終的には、細胞死6,7,8,9。細胞生命と死の経路を通じて代謝制御と MPTP 死の軸がこのように、ミトコンドリアの Ca2 +シグナリング直接影響します。
近年が急速に普及したためミトコンドリア Ca2 +動態の研究に関心のミトコンドリアの Ca2 +細胞複雑な分子成分の同定に大きい部分、ミトコンドリア内Ca2 +の主なモードは、膜輸送体は、ミトコンドリアのマトリックス10、11,12にインポートします。細胞の構造および調節サブユニットの同定はミトコンドリアの機能と機能障害を調節するためのミトコンドリアの Ca2 +流入をターゲット遺伝子の可能性をもたらしたし、の研究を促進、細胞複合体とミトコンドリア Ca2 +流入病13,14,15への貢献。確かに、様々 な神経変性疾患、および癌16,17,18、心臓病に至る疾患の病態に関与しているミトコンドリアの Ca2 +シグナル伝達 19,20。
ミトコンドリア Ca2 +代謝と細胞死のシグナル伝達の基本的な重要性を与えられ、生物学的システムの広い範囲と組み合わせるそのミトコンドリア Ca2 +シグナル伝達への影響、ミトコンドリアの Ca 2 +を評価する手法流入が大きな関心を集めています。当然ながら、さまざまな技術やミトコンドリア Ca2 +を測定するためのツールが開発されています。蛍光 Ca2 +などのツールを利用する方法が含まれます-敏感な染料21,22と遺伝子にコードされた Ca 2 +センサー cameleon、イクオリン23など、ミトコンドリアを対象と 24。この記事の目的は、さまざまな方法やミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定できるモデル システムを強調することです。ミトコンドリアの Ca2 +流入能力を評価する 2 つの実験的手法を提示します。例として心臓のミトコンドリアを使用、プレート リーダー ベースのプラットフォームの詳細に説明してミトコンドリア Ca2 +の測定を使用して、Ca2 +敏感な吸収色素分離組織のミトコンドリア14 に最適ですカルシウム グリーン 5N.共焦点顕微鏡イメージングを用いたのミトコンドリア Ca2 + Ca2 +敏感な染料ロード-2/午前25を用いたグリセリンの細胞の測定の測定について述べるも NIH 3T3 細胞を使用して、.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>886000-0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2850-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Green-5N</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C3737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker green FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhod-2, AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R1244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>8510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP364-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate magnesium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru360</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>557440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells

Ca2 +ミトコンドリアによって処理細胞の広範なスペクトルでの生理学的および病態生理学的プロセスを調節する重要な機能です。Ca2 +ミトコンドリアからの流出や流入を正確に計測する能力は、ミトコンドリア Ca2 +これらのプロセスでの処理の役割を決定するため重要です。本報告では、ミトコンドリアの Ca2 +ハンドリング分離ミトコンドリアや培養細胞での測定のための 2 つの方法を提案する.我々 はまず、Ca2 +敏感な染料カルシウム グリーン-5N を使用してミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを詳しく説明します。プレート リーダー ベースの形式は、特殊な装置の必要性を回避し、カルシウム グリーン 5N 色素は Ca2 +分離組織のミトコンドリアからの測定に最適です。アプリケーションでは、マウス心臓組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +吸収の測定について説明します。ただし、肝臓、骨格筋、脳など他の組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定するこの手順を適用することができます。第二に、共焦点顕微鏡を用いたミトコンドリア Ca2 + Ca2 +敏感な染料ロード-午前/2 を使用して、2 次元レーザー走査型顕微鏡を用いたイメージング グリセリン細胞の測定の測定について述べる。この透過プロトコルは、ミトコンドリア Ca2 +での変更の特定の録音を可能にする細胞内色素汚染を排除します。また、レーザ走査型顕微鏡高フレーム レートのミトコンドリア Ca2 +に様々 な薬や試薬の外部のソリューションの適用応答で急激な変化をキャプチャすることができます。このプロトコルは、初代培養細胞不死化細胞株や神経細胞、心筋細胞などを含む多くの細胞タイプのミトコンドリアの Ca2 +吸収を測定に適用できます。

図 1ミトコンドリア Ca2 +取り込み測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを使用して分離心筋ミトコンドリアで、Ca2 +カルシウム グリーン-5N を染めます。制御条件 (図 1 a) 心筋ミトコンドリアいたカルシウム グリーン-5N を含む KCl バッファー中に浮遊し、30 の追加 CaCl2 (0.6 mM CaCl2?...

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Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca2 +流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca2 +インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca2 +敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca2 +染料ロード-2/AM を用いた共焦点顕微鏡法について述べる。

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

カルシウムイオノフォアを用いた赤血球中の赤血球誘導

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

代謝標識および質量分析による老化および非分裂培養細胞におけるタンパク質代謝回転率の測定

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells

5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) Labeling of Mitochondrial DNA in HeLa Cells (Video) | JoVE 

HeLa細胞におけるミトコンドリアDNAの5-ブロモ-2&#39;-デオキシウリジン(BrdU)標識