Name: electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH give DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.

1. buffer forberedelse
<ol><li>Mærkning buffer (2 x PBS, pH 7,9): I 400 mL deioniseret vand (DD) vand, tilsættes 100 mL 10 x PBS, justere pH til 7,9 med NaOH.</li>
	<li>3 mM af Biotin: 1 mg Biotin i 588 µL af mærkning buffer opløses.</li>
	<li>3 mM af Sulfo-tag: opløses 150 nmol Sulfo-tag i 50 µL af mærkning buffer.</li>
	<li>Antigen buffer (5% BSA): I 500 mL 1 x PBS, tilføje 25 g af bovint serumalbumin (BSA).</li>
	<li>Forberede 0,5 M eddikesyre.</li>
	<li>1,0 M af Tris-HCl buffer pH 9,0: forberede 1 M Tris-HCl buffer, og justere pH til 9,0 med HCl.</li>
	<li>Coatingbuffer (3% Blocker A): I 500 mL 1 x PBS, tilsættes 15 g Blocker A.</li>
	<li>Vask buffer (0,05% Tween 20, PBST): I 5000 mL 1 x PBS, tilsættes 2,5 mL af Tween 20.</li>
	<li>Læsning buffer (2 x Læs Buffer T med overfladeaktivt stof): I 500 mL DD vand, tilsættes 500 mL 4 x Læs Buffer T med overfladeaktivt stof (Tabel af materialer).</li>
	<li>Gemme Biotin og Sulfo-tag i en-20 ° C fryser. Bemærk: Begge Biotin og Sulfo-tag løsninger bør altid være frisk fremstillede lige før proceduren mærkning.</li>
</ol>2. etiketten menneskelige Holmen Autoantigen med Biotin og Sulfo-tag
Bemærk: En høj koncentration af antigen, ≥0.5 mg/mL, anbefales til en mere effektiv mærkning reaktion.
<ol><li>Bestemme kindtand forholdet mellem menneskelige Holmen autoantigen Biotin og Sulfo-tag.<ol>
<li>Få antigen kindtand tal ved at dividere antigen vægten med molekylvægt.</li>
		<li>Bruge den molære forhold på 1:5 til antigen med mindre molekylvægt (≤10 kd) og det kindtand forholdet 1:20 for antigen med større Molekylær vægt (> 50 kd).</li>
		<li>Beregning af volumen for Biotin eller Sulfo-tag ved at dividere den molære antallet af dets koncentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland den menneskelige Holmen autoantigen med Biotin eller Sulfo-tag med den molære forhold på 1:5. Bemærk: Protein i enten tris eller glycin buffersystemer bør udveksles til 2 x PBS buffer med pH 7,9 bruger dimensionering spin kolonne.</li>
	<li>Da Biotin og Sulfo-tag er lysfølsomt, dække reaktion rør med aluminiumsfolie. Inkuber reaktion ved stuetemperatur (RT) for 1 h.</li>
	<li>Under inkubation, prime kolonnen spin af dosisdispensering 2 x PBS buffer i kolonnen tre gange. Der centrifugeres løsning på 1000 x g i 2 min. hver gang. Bemærk: I øjeblikket mærkning reaktionen, via bro, sker stadig og skal stoppes.</li>
	<li>Mærkning reaktionen standses ved rensning af mærket menneskelige Holmen autoantigen. For at rense, passere autoantigen igennem kolonnen spin og centrifugeres kolonnen ved 1000 x g i 2 min.</li>
	<li>Bestemme mærket antigen koncentrationen (µg/µL) ved hjælp af mængden af antigen protein og det endelige rumfang. Bemærk: Groft, der bliver 90-95% tilbageholdelse af mærket antigen efter hvert spin kolonne passere.</li>
	<li>Alikvot af mærket antigen og butikken mærket antigen ved-80 ° C.</li>
</ol>3. define de bedste koncentrationer og nøgletal for de to mærkede antigener til analysen (Checker bestyrelsen Assay)
<ol><li>Forbered to serumprøver, en høj positiv og en negativ, med en samlet maengde paa 200 µL for hver.</li>
	<li>Alikvot 4 µL serum og tilsæt 1 x PBS, indtil den endelige rumfang er 20 µL pr. brønd for en 96-brønd PCR plade. Bruge halvdelen af en plade for de høje positiv prøve og anden halvdelen til den negative prøve, som vist i figur 2A.</li>
	<li>Tilsæt 10 µL af Biotin og 10 µL af Sulfo-tag mærket antigen og adfærd serielle fortyndinger for de to forskelligt mærket antigener, som vist i figur 2A. Køre en vandret seriel fortynding for én mærket antigen og en lodret seriel fortynding for andre mærket antigenet.</li>
	<li>Fortsætte resten af analysen trinene beskrevet i 5.3 til 9.1.</li>
	<li>Beregn forholdet af signaler fra det høje positive prøve mod hver af de tilsvarende signaler fra det negative eksempel vist i figur 2B.</li>
	<li>Identificere de bedste koncentrationer for Biotin og Sulfo-tag mærket antigener ved at vælge et punkt med den højeste eller i nærheden af højeste forholdet mellem positive til negative. Overveje at lave baggrunden signalet fra den negative prøve at identificere forholdet. Bemærk: Assay dag 1 indeholder trin 4 til trin 6.</li>
</ol>4. Forbered Antigen bufferen ved hjælp af den korrekte koncentration af Biotin/Sulfo-tag mærket Antigen
<ol><li>Vælg den rationelle koncentration af hvert antigen baseret på checker bestyrelsen assay.</li>
	<li>Forbered 3 mL antigen løsning pr. plade, ved hjælp af rationelle koncentrationen af Biotin/Sulfo-tag mærket antigen til antigen buffer.</li>
</ol>5. der inkuberes serumprøver med mærket Antigen
Bemærk: Der er to protokoller i dette afsnit, en uden serum syrebehandling og en med serum syrebehandling. Alle islet autoantistof assays undtagen IAA assay bruge regelmæssig protokol uden serum syrebehandling fra trin 5.1 til 5.5, IAA assay springer disse trin og bruger protokollen med serum syrebehandling fra trin 5.6 til 5,9.
<ol><li>Alikvot 4 µL serum og tilsæt 1 x PBS, indtil den endelige rumfang er 20 µL pr. brønd for en 96-brønd PCR plade.</li>
	<li>Tilføj 20 µL af mærket antigen løsning pr. brønd.</li>
	<li>Dække PCR-plade med forsegling folie for at undgå lys.</li>
	<li>Sætte pladen på en shaker (lav hastighed) på RT for 2 h.</li>
	<li>Sætter pladen i 4 ° C køleskab, og der inkuberes natten over (18-24 h). Bemærk: Følgende protokol af skridt fra 5.6 til 5,9 er kun beregnet til IAA assay og andre autoantistof assays springe disse trin.</li>
	<li>Mix 15 µL serum med 18 µL af 0,5 M eddikesyre for hver serumprøven. Inkuber denne blanding på RT for 45 min.</li>
	<li>Forberede antigen løsning med rationel koncentrationen af Biotin og Sulfo-tag mærket antigen, baseret på checker bestyrelsen assay, ved hjælp af antigen buffer. I hver godt, mærket alikvot 35 µL af antigen buffer, som indeholder Biotin og Sulfo-tag antigen, ind i en ny PCR-plade.</li>
	<li>Inden 45 min inkubation (trin 5.6) trin er afsluttet, skal du tilføje 8.3 µL 1 M Tris pH 9,0 buffer til siden af hver brønd på antigen plade (trin 5.6). Det er vigtigt at begrænse blanding mellem Tris buffer og antigen. Straks overføre 25 µL serum, der er behandlet med syre, taktfast 5.6, i hver brønd og agitere for løsningen. Dække PCR-plade med forsegling folie for at undgå lys.</li>
	<li>Sætte pladen på en shaker (lav hastighed) på RT for 2 h. sætter pladen i 4 ° C køleskab og tillade plade til inkuberes natten (18-24 h).</li>
</ol>6. Forbered Streptavidin plade
<ol><li>Tag en streptavidin plade fra 4 ° C køleskab og tillade plade til at komme til RT.</li>
	<li>Når streptavidin pladen er på RT, tilsæt 150 µL af 3% Blocker A til hver brønd.</li>
	<li>Dække PCR-plade med forsegling folie.</li>
	<li>Inkuber tallerken i køleskabet 4 ° C natten over. Bemærk: Assay dag 2 omfatter Step 7 til trin 9.</li>
</ol>7. overførsel Serum/Antigen udruger til den Streptavidin plade
<ol><li>Den næste dag, tage ud på streptavidin pladen fra køleskabet og kassér buffer fra pladen. Sæt nogle tørt papirhåndklæder på bordet og tryk pladen op og ned, indtil der ikke er nogen mere buffer i brøndene.</li>
	<li>Fyld den tomme streptavidin plade med 150 µL af PBST pr. brønd og kassér PBST fra plade til i alt tre vasker.</li>
	<li>Overføre 30 µL serum/antigen udruger pr. brønd i streptavidin pladen.</li>
	<li>Dække pladen med folie for at undgå lys. Ryste pladen, ved en lav indstilling på RT for 1 h.</li>
</ol>8. vask pladen og tilføje Læs Buffer
<ol><li>Kassér udruger fra pladen. Tilsæt 150 µL af PBST pr. brønd og kassér PBST fra plade til i alt tre vasker.</li>
	<li>Efter vask, Tilføj 150 µL pr. brønd af læsning buffer. Bemærk: Det er vigtigt at undgå luftbobler i løsningen, fordi dette vil påvirke, hvordan pladen læses på plade læser maskine.</li>
</ol>9. Læs pladen og analysere Data
<ol><li>Tælle plade på plade læser maskine. Antistof værdier vises som tæller pr. sekund (CPS).</li>
	<li>Formidle antistof niveauer modtaget fra plade læser maskinen som en relativ indeks. Beregne indeks fra følgende ligning: Indeksere værdi = [CPS (sample) - CPS (negativ kontrol)] / [CPS (positiv kontrol) - CPS (negativ kontrol)].</li>
	<li>Identificere positiv og negativ antistof resultater ved hjælp af afgrænsningen for positivitet, defineret baseret på den 99: e fraktil for 100 raske kontrolpersoner (ikke-diabetiske individer uden nogen kendte autoimmune sygdomme og der har ingen familie historie af diabetes).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+Predictors+of+progression+from+the+appearance+of+islet+autoantibodies+to+early+childhood+diabetes:+The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY).">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li><li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+type+1+diabetes.">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin,+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies,+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes:+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young.">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li><li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Holmen autoantistoffer er i øjeblikket de mest pålidelige biomarkører for autoimmunitet af type 1 diabetes. De markerer starten på Holmen specifikke autoimmunitet og bestemme overt sygdom risici. ECL-analysen for Holmen autoantistoffer, er blevet udførligt valideret i flere nationale og internationale type 1 diabetes kliniske forsøg. Analysen har vist øget følsomhed og specificitet i forhold til nuværende 'guld' standard RBAs. ECL analysen har vist sin overlegne fordel for højere sygdom specificitet af diskriminerende høj-affinitet og højrisiko islet autoantistoffer fra lav risiko, lav-affinitet signaler genereret af RBA. Dette er især bemærket i emner, der er kun én islet autoantistof positive og har aldrig udviklet sig til type 1-diabetes. De fleste af disse lav affinitet autoantistoffer fandtes for at være tabt under opfølgning test udført i løbet af måneder til år, opfører sig som en» forbigående positiv.» Som tidligere hypotese, disse lav affinitet 'single' autoantistoffer sandsynligvis resulterede fra vaccination med en cross-reactive molekyle. Mens højere affinitet skyldes højere risiko islet autoantistoffer immunisering med islet antigener, selv. Derudover har ECL-assays vist evnen til at opstået før tidspunktet for 'serokonversion' fra nuværende standard radio-bindende assays (RBA) af år i børn med præ-diabetes, der blev fulgt til klinisk diabetes fra fødslen. En igangværende internationale kliniske forsøg, miljømæssige determinanter for Diabetes i den unge (TEDDY), afhænger af nøjagtig påvisning at lokalisere timing og udseendet af den første islet autoantistof 'serokonversion' til at markere starten af holmen autoimmunitet og til at identificere miljømæssige udløser. En mulig årsag til øget følsomhed i ECL assay er at analysen indfanger alle immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarere end den traditionelle RBA eller ELISA, som kun er afhængige af påvisning af IgG.
I ECL assays, for nogle særlige autoantistoffer ligesom IAA, synes binding af autoantistoffer til antigenet at blive hæmmet af nogle komponent i normalt humant serum. For at fjerne eller frigive denne hæmning, var behandling af serumprøver nødvendigt at gøre før serum blev inkuberet med antigen. Som vist i [figur 5], ECL-IAA assay, bindende aktiviteter både mus insulin monoklonalt antistof og patienters serum autoantistoffer med antigenet blev styrket. Forsuringen af serumprøver, bruges i antistof assays, er normalt anvendes til at fjerne tilknytningen af allerede eksisterende bundne komplekser. Mekanismen bag hvordan IAA signaler er hæmmet i humant serumprøver og udgivet af forsuring af serum vides ikke, men denne metode er blevet brugt i andre ECL baseret assays14,15.
I nogle tilfælde, når mærkning molekyler, er enten Biotin eller Sulfo-tag, den mærkning positionsinside af antigen proteinmolekyler på eller meget nær centrale epitoper af antistof bindende, som kan forstyrre den bindende aktivitet til antistoffer. Dette vil reducere assay følsomhed og kan helt nedrive analysen. For rutine mærkning procedure, er maksimering eller mætning ønskede for hver antigen protein molekyle til at generere maksimale aktivitet eller signal pr. mærket molekyle ved at maksimere mærkning kapacitet af alle mulige mærkning position. Umættede mærkning bør udføres ved at reducere det molære forholdet mellem mærkning molekyler (Biotin og Sulfo-tag) til antigen protein, hvis mærkning på antigenet bliver en mulig årsag til afbrydelse af antistof bindende aktivitet. Major epitoper kan være bedre reserverede og afbrydelse af antistof bindende aktivitet kan frigives ved hjælp af den umættede mærkning strategi i de fleste tilfælde.
Hvert assay bør omfatte en intern standard høje positive og negative kontrol for indeksberegningerne af ukendte prøver. En lav positiv kontrol nær assay's øvre grænse for normale kontrolelementer er vigtigt at medtage til overvågning af assay følsomhed. Laboratoriet bør holde nok delprøver af standard positive og negative kontroller til lang tids brug og alle delprøver skal opbevares ved-20 ° C. For assay kvalitetssikring, assays skal køres i dubletter for hver prøve og hvert positivt resultat bør bekræftes ved at gentage prøven i et separat assay. En tredje assay er nødvendig, når den anden genfremsatte assay ikke er enig med den første analysen og resultaterne af to undersøgelser, som er enige om (fx., +, + eller-, -), vil være den endelige bestemmelse af et positivt eller negativt resultat.
Med platformen til enkelt ECL assays, kan en multiplex assay udvides efter fra disse. Det kan samtidig bestemme op til 10 forskellige autoantistoffer i én enkelt godt med en lille mængde af serum. I øjeblikket er fire islet autoantistoffer herunder IAA, GADA, IA-2A og ZnT8A lig betydning for risiko Forudsigelsen af progression til T1D i begge slægtninge af patienter med T1D og den almindelige befolkning. De metoder, der anvendes til screening af disse 4 autoantistoffer ved hjælp af nuværende enkelt autoantistof målinger er besværligt og ineffektivt, især for store skala population screening. Vigtigere, op til 40% af patienter med T1D har en ekstra autoimmun tilstand16,17,18. Desværre, der er ingen nem og billig værktøj til at screene for disse betingelser. Multiplex ECL analysen er ikke kun i stand til at kombinere 4 nuværende store islet autoantistof assays til én, men også er i stand til yderligere kombinere flere autoantistof assays fra andre relevante autoimmune sygdomme. Dette gør det muligt at effektivt gennemføre high throughput screening for flere autoimmune sygdomme samtidig i stor skala populationer. I multiplex ECL analysen, som vist i [figur 6], vil hvert antigen-antistof kompleks dannet i væske-fase være tilbageholdende til en specifik linker kilde spot i samme godt. Signalmodtager på plade læser maskine er købedygtig anerkende signaler fra 10 forskellige kilder af steder. Dog kan steder med en ekstrem høj signal generere et højt assay baggrund og forårsage interferens til nærliggende steder gennem cross-talk. Af denne grund, bør de øvre grænse signaler til hver autoantistof assay begrænses til færre end 20.000 tæller. Vores erfaring, bør autoantistoffer med lavere baggrunde placeres relativt langt væk fra disse steder at have højere tæller når den spot kort er designet. For langsigtede undersøgelser ved hjælp af multiplex ECL assays, anbefales det, at den samme linker bruges til samme autoantistof analysen til at holde analysen konsekvent.

En nylig midlertidige klassifikationssystem er blevet oprettet for at hjælpe med diagnosticering af indledende faser af T1D hos patienter. Nøjagtig påvisning af menneskelige islet autoantistoffer spiller en vigtig rolle i at identificere og iscenesættelse præsymptomatiske type 1-diabetes, som tilstedeværelsen af holmen autoantistoffer indikerer tilstedeværelsen af β-celle autoimmunitet. På hvilke diabetes påvirker patienter fra den første forekomst af β-celle autoimmunitet symptomatisk sygdommen forbundet med antallet og typen af holmen autoantistoffer, er variabel2,3.
Alder af autoantistof serokonversion, titer og affinitet af holmen autoantistoffer kan påvirke den progression til symptomatisk type 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. For nylig, udviklede ECL assays har valideret flittigt, har påvist øget følsomhed, og er mere sygdoms-specifikke10,11,12,13. Disse assays forbedre forudsigelse og iscenesættelse af diabetes risiko gennem tidligere påvisning af holmen autoantistoffer. De mere præcist markerer indledningen af holmen autoimmunitet og ignorere de lav-affinity og lav risiko signaler ikke er relevante for diabetes.
I en ECL assay broen autoantistoffer i serum, hvis tilstede, den Sulfo-tag-konjugeret antigen til biotinylated opsamling antigen i den flydende fase. Efter bridging, er Biotin linker fanget i den faste fase og opdaget gennem ECL af Sulfo-tag på streptavidin belagt plade (figur 1).
I denne anmeldelse, er enkelt antistof ECL assays med menneskelige islet autoantistoffer primært udnyttes. Kort, multipleksede antistof assays baseret på enkelt ECL assays vil blive drøftet. Multiplex analysen kan bruges til at identificere flere, op til 10, autoantistoffer inden for en enkelt godt, ved hjælp af 15 µL serum. Denne enkle høj overførselshastighed assay kan bruges til at skærmen samtidig flere autoantistoffer til flere relevante autoimmune sygdomme i den almindelige befolkning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:292px;">Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td>
			<td style="width:151px;">AmideBio</td>
			<td style="width:137px;">Human Proinsulin, Rec</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant GAD65 protein</td>
			<td style="width:151px;">Diamyd</td>
			<td style="width:137px;">rhGAD65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant IA-2 protein</td>
			<td style="width:151px;">Creative BioMart</td>
			<td style="width:137px;">IA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:151px;">SIGMA-ALORICH</td>
			<td style="width:137px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well PCR plate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">L15SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba sizing spin column</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Twen-20</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ-Link Biotin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-tag</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocker A</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">R93AA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4x Read Buffer T with Surfactant</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>ThermoScience</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:137px;">14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Streptavidin plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD GOLD</td>
			<td style="width:137px;">L 15SA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td style="width:151px;">ThermoScience</td>
			<td style="width:137px;">PL208984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Plate Shaker</td>
			<td style="width:151px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:137px;">1296-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">QuickPlex SQ120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop centrifuge with bucket rotary</td>
			<td style="width:151px;">Beckman</td>
			<td style="width:137px;">Allegra X-15R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

Indkredse islet autoantistoffer forbundet med type 1 diabetes fører (T1D) vejen til projektet og afskrække denne sygdom i den almindelige befolkning. En roman ECL assay er en ikke-radioaktive flydende fase assay for Holmen autoantistoffer med højere følsomhed og specificitet end den nuværende 'guld' standard radio-bindende assay (RBA). ECL assays kan mere præcist definere udbrud af præsymptomatiske T1D ved at skelne de højrisiko, høj-affinitet autoantistoffer fra lav risiko, lav-affinitet autoantistoffer genereret i RBAs og konventionelle enzymmaerket assays (ELISA ). Antigen protein bruges i denne ECL assay er mærket med Sulfo-tag og Biotin, henholdsvis. Hver ECL autoantistof assay, der bruger et bestemt antigen protein behov en optimering skridt, før det kan bruges til laboratoriet. Dette trin er især vigtigt ved fastsættelsen af krav for serum syre behandlinger, koncentrationer og nøgletal for de to forskellige antigener mærket med Sulfo-tag og Biotin. For at udføre analysen, serum prøver er blandet med Sulfo-tag-konjugeret og biotinylated fange antigen protein i fosfatbufferet løsning (PBS), som indeholder 5% bovint serumalbumin (BSA). Bagefter, prøverne inkuberes natten over ved 4 ° C. Den samme dag, er en streptavidin-belagt plade forberedt med blocker buffer og inkuberes natten over ved 4 ° C. På andendagen, vaske streptavidin plade og overføre serum-antigen blandingen på pladen. Pladen anbringes på pladen shaker, sæt den på lav hastighed, og Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende, pladen er vasket igen, og læser buffer er tilføjet. Pladen er så tælles på plade læser maskine. Resultaterne formidles gennem et indeks, der genereres fra intern standard positive og negative kontrol serumprøver.

Figur 2 viser Kontrolprogram bord. Det er vist at 250 ng/mL af Biotin og 250 ng/mL Sulfo-tag mærket antigen er de mest rationelle koncentrationerne anvendes i analysen overvejer signaler fra det høje positive kontrolprøve, negativ kontrolprøve som analysens baggrund, og forholdet mellem positive til negative signaler. Med de optimerede koncentrationer af disse to mærket antigener, blev analysen udført med serumprøver fra 100 Nydiagnosticerede patienter med T1D og 100 raske kontrolpersoner. Indeksværdien for 0,023 var defineret som assay cut-off for positivitet. Dette repræsenterer 85% følsomhed i patienter og 99% specificitet i raske kontrolpersoner bruger modtager karakteristiske (ROC) koerselskurve vist i figur 3A. Analysen for de ukendte prøver blev gennemført med intern standard høj positiver, lave positive og negative kontrolprøver. Resultaterne af CPS tæller er vist i tabel 2A. Den gennemsnitlige CPS af høj og lav positive kontroller er fremhævet med rødt, 17903 [(19940+15866)/2] og 839 [(857+820)/2], og den negative kontrol er markeret med grønt, 168 [(170+165)/2]. Indekset for ukendte prøver beregnes ved "(CPSprøve-168)/(17903-168)." Tabel 2B viser de beregnede indeksværdier for alle prøver. De indeksværdier, der er større end 0,023 er skrevet i rødt, svarende til CPS værdier også skrevet med rødt i tabel 2A. Disse værdier bliver defineret som de positive resultater, der er større end den 99th fraktil for befolkningens sund kontrol. Når en irrationel antigen koncentration bruges, har analysen en høj baggrund, som vist i tabel 2 C. Lave niveauer af positive antistoffer vil blive savnet som værdier A2, A5, D1 og H4 fremhævet i grå i tabel 2D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Figur 1 : Illustration af en bivalent plade opsamling på en enkelt ECL-IAA assay. Holmen autoantistof i serum broer Sulfo-tag konjugeret antigen til biotinylated capture antigener, som er fanget i den faste fase på den streptavidin-belagt plade. Påvisning af plade-fanget Sulfo-tag konjugeret antigen opnås gennem ECL. Dette tal er blevet ændret fra Yu, mfl. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Figur 2 : The ROC kurve til bestemmelse af afskæringen af analysen positivitet. Den 99th fraktil for specificitet svarende til 85% følsomhed blev valgt og er repræsenteret som en indeksværdi på 0,023. Denne øvre grænse af analysen blev taget fra 100 raske kontrolpersoner. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Figur 3 : Illustration af normalt humant serum blokering ECL-IAA signaler. A: signaler fra ECL-IAA assays med en insulin monoklonalt antistof (MoAb) blev drastisk blokeret ved tilsætning af normalt humant serum. Når man sammenligner MoAb i PBS, blev signalet delvist restaureret når det humant serum blev behandlet med syre. B: signaler fra en ECL-IAA assay med 4 patient sera blev væsentligt forbedret med syrebehandling. Dette tal er blevet ændret fra Yu, mfl. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Figur 4 : Illustration af Mutiplex ECL assay. Antigen-antistof-komplekser er dannet i væske-fase med specifikke linkers. De specifikke antistof-antigen-linker komplekser er tilbageholdende på hver af de specifikke linker-steder i samme godt. Plade læser maskine er i stand til at skelne signalerne fra forskellige kilder af steder og giver CPS tæller på 10 forskellige kanaler, henholdsvis. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabel 1: Checker bestyrelsen assay bestemmer koncentrationer og nøgletal af Biotin og Sulfo-tag mærket antigener. A: rå CPS tæller for checker bord plade med høj positivt serum på halvdelen af plade og negativt serum på anden halvdelen. Koncentrationen af biotinylated antigen blev fortyndet vandret i serien og koncentrationen af Sulfo-tag mærket antigen blev fortyndet lodret i serien. B: ratio værdierne CPS tæller fra den høje positivt serum mod hver af deres tilsvarende CPS tæller fra den negativt serum. De gule fremhævet wells repræsenterer det bedste forholdet mellem positive til negative i panelet B. Dette forhold svarer til de 250 ng/mL Biotin og 250 ng/mL Sulfo-tag mærket antigen koncentrationer i panelet A med en acceptabel lav CPS tæller negativt serum. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af denne tabel.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabel 2: analyse af analyse resultater. A: rå CPS tæller fra assay pladen med de standard høj og lav positive kontroller fremhævet med rødt og de standard negative kontroller fremhævet med grønt. Hver prøve blev duplikeret i analysen. B: indeksværdier blev beregnet, som beskrevet i analysen protokol. Enhver indeksværdi, der blev større end 0,023 var defineret som et positivt resultat, fremhævet med rødt. C: rå CPS tæller fra assay pladen med det samme sæt af prøver, når en irrationel antigen koncentration blev brugt. Dette resulterede i en høj baggrund og nogle lave positiver normalt registreres, som vist i panelet B, blev konverteret til negativer, fremhævet i grå i panelet D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Her, præsenterede vi metoder til at opdage menneskelige islet autoantistoffer ved hjælp af electrochemiluminescence (ECL) assays. Den protokol, bruges til at forudsige type 1 diabetes, kan udvides ved for at opdage autoantistoffer til andre autoimmune sygdomme.

Electrochemiluminescence Assays til menneskelige Islet autoantistoffer

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualiseringen af ​​det immunologiske Synapse med Dual Color Time-gated stimuleret emission Nedbrydning (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Koncentration beslutsomhed gennem plakanalyser: ved hjælp af traditionel og Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidlig Virale Adgangskrav Analyser for identifikation og evaluering af antivirale forbindelser

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generation af tofarvede Antigen Microarrays til samtidig påvisning af IgG og IgM-autoantistoffer

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening Assays for at karakterisere romanen endotel regulerende myndigheder involveret i inflammatorisk reaktion

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Måling af Influenza neutraliserende antistof svar til A(H3N2) virus i menneskelige Sera af Microneutralization undersøgelser, som ved hjælp af MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

En Murine pancreas Islet celle-baseret Screening for Diabetogenic miljømæssige kemikalier

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...