Name: electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH gi DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.

1. buffer forberedelse
<ol><li>Merking buffer (2 x PBS, pH 7.9): I 400 mL destillert deionisert (DD) vann, legge til 100 mL 10 x PBS, justere pH å 7.9 med NaOH.</li>
	<li>3 mM av Biotin: oppløse 1 mg av Biotin i 588 µL av merking buffer.</li>
	<li>3 mM Sulfo-Tag: oppløse 150 nmol av Sulfo-koden i 50 µL av merking buffer.</li>
	<li>Antigen buffer (5% BSA): 500 mL 1 x PBS, legge til 25 g av bovin Serum Albumin (BSA).</li>
	<li>Forberede 0,5 M eddiksyre løsning.</li>
	<li>1,0 M av Tris-HCl buffer pH 9.0: forberede 1 M Tris-HCl buffer, og justere pH å 9.0 med HCl.</li>
	<li>Belegg buffer (3% blokkering A): 500 mL 1 x PBS, legge til 15 g blokkering A.</li>
	<li>Vaske bufferen (0,05% mellom 20, PBST): 5000 mL 1 x PBS, legge til 2,5 mL mellom 20.</li>
	<li>Lese buffer (2 x lesebufferen T med surfactant): 500 mL DD vann, legge til 500 mL 4 x lesebufferen T med Surfactant (Tabell for materiale).</li>
	<li>Lagre Biotin og Sulfo-tag i 20 ° C fryser. Merk: Begge Biotin og Sulfo-taggen bør alltid være fersk forberedt før merking prosedyren.</li>
</ol>2. merke den menneskelige Holme Autoantigen med Biotin og Sulfo-kode
Merk: En høy konsentrasjon av antigen, ≥0.5 mg/mL, anbefales en mer effektiv merking reaksjon.
<ol><li>Finn molar forholdet mellom menneskelig Holme autoantigen til Biotin og Sulfo-koden.<ol>
<li>Få antigen molar nummeret ved antigen vekten med Molekylvekten.</li>
		<li>Bruke molar forholdet 1:5 for antigenet med mindre molekylvekt (≤10 kd) og molar forholdet 1:20 for antigenet med større molekylvekt (> 50 kd).</li>
		<li>Beregne volumet for Biotin eller Sulfo-koden ved å dele hvor molar konsentrasjonen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bland den menneskelige Holme autoantigen med Biotin eller Sulfo-tag med molar forholdet 1:5. Merk: Proteinet i tris eller glysin buffer systemer bør byttes 2 x PBS buffer med pH 7.9 bruker størrelse spinn kolonnen.</li>
	<li>Siden Biotin og Sulfo-tag er følsomt for lys, dekke reaksjonen rør med aluminiumsfolie. Inkuber reaksjonen ved romtemperatur (RT) 1t.</li>
	<li>Under incubation, prime kolonnen spinn ved dispensering 2 x PBS buffer i kolonnen tre ganger. Sentrifuge løsningen på 1000 x g i 2 minutter hver gang. Merk: Foreløpig merking reaksjon, gjennom bro, fortsatt, og må stoppes.</li>
	<li>Stopp merking reaksjonen av rensing merket menneskelige Holme autoantigen. For å rense, passerer autoantigen gjennom kolonnen spinn og sentrifuge kolonnen 1000 x g i 2 minutter.</li>
	<li>Fastslå merket antigen konsentrasjon (µg/µL) bruker mengde antigen protein og det siste bindet. Merk: Omtrent, vil det være 90-95% oppbevaring av merket antigen når hvert spinn kolonnen passerer.</li>
	<li>Aliquot merket antigen og lager merket antigen på-80 ° C.</li>
</ol>3. definere beste konsentrasjoner og prosenter for de to merket antigener for analysen (kontrolløren styret analysen)
<ol><li>Forberede to serumprøver, en høy positiv og en negativ, med et totalt volum på 200 µL for hver.</li>
	<li>Aliquot 4 µL av serum og legge 1 x PBS til det siste bindet er 20 µL per brønn for en 96-brønns PCR plate. Bruke halvparten av en plate for høy positiv prøven og den andre halvparten for negative prøven, som vist i figur 2A.</li>
	<li>Legge til 10 µL av Biotin og 10 µL Sulfo-tag merket antigen og gjennomføre føljetong fortynninger for de to annerledes merket antigener, som vist i figur 2A. Kjøre en horisontal føljetong feil for en merket antigen og en vertikal føljetong fortynning for andre merket antigen.</li>
	<li>Fortsette resten av analysen fremgangsmåten beskrevet i 5.3 til 9.1.</li>
	<li>Beregne forholdet mellom signaler fra høy positiv prøven mot hver av tilsvarende signaler fra negativ eksempel vist i figur 2B.</li>
	<li>Identifisere de beste konsentrasjonene for Biotin og Sulfo-tag merket antigener ved å velge et punkt med den høyeste eller nær høyeste forholdet mellom positive til negative. Vurdere lav bakgrunn signal fra negativ eksempel identifisere forholdet. Merknad: Analysen dag 1 inneholder trinn 4 til trinn 6.</li>
</ol>4. forberede Antigen bufferen med riktig konsentrasjonen av Biotin/Sulfo-tag merket Antigen
<ol><li>Velg rasjonell konsentrasjonen av hver antigen basert på kontrolløren styret analysen.</li>
	<li>Forberede 3 mL antigen løsning per plate, bruke rasjonell konsentrasjonen av Biotin/Sulfo-tag merket antigen for antigen bufferen.</li>
</ol>5. ruge serumprøver med merket Antigen
Merk: Det er to protokollene i denne delen, uten serum syre behandling og med serum syre behandling. Alle Holme autoantibody analyser unntatt IAA analysen bruker vanlige protokollen uten serum syre behandling fra trinn 5.1 til 5,5, mens IAA analysen hopper fremgangsmåten og bruker protokollen med serum syre behandling fra trinn 5.6 til 5,9.
<ol><li>Aliquot 4 µL av serum og legge 1 x PBS til det siste bindet er 20 µL per brønn for en 96-brønns PCR plate.</li>
	<li>Legge til 20 µL av merket antigen løsning per brønn.</li>
	<li>Dekk PCR platen med tetting folie for å unngå lys.</li>
	<li>Sette platen på en shaker (lav hastighet) på RT 2 h.</li>
	<li>La platen i 4 ° C kjøleskapet og ruge over natten (18-24 h). Merk: Følgende protokollen trinn fra 5,6 til 5,9 er kun ment for IAA analysen og andre autoantibody analyser hoppe over disse trinnene.</li>
	<li>Mix-15 µL av serum med 18 µL av 0,5 M eddiksyre for hver serum prøve. Inkuber denne blandingen på RT i 45 minutter.</li>
	<li>Forberede antigen løsningen med rasjonell konsentrasjonen av Biotin og Sulfo-tag merket antigen, basert på kontrolløren styret analysen, bruker antigen buffer. I hver Vel, merket aliquot 35 µL av antigen buffer, som inneholder Biotin og Sulfo-tag antigen, i en ny PCR-plate.</li>
	<li>Før 45 min inkubasjon (trinn 5.6) trinnet er fullført, kan du legge 8.3 µL 1 M Tris pH 9.0 bufferen ved siden av hver brønn på antigen plate (trinn 5.6). Det er viktig å begrense blanding mellom Tris bufferen og antigen. Umiddelbart overføre 25 µL av serum, som behandles med syre, i trinn 5.6, i hver brønn og agitere løsningen. Dekk PCR platen med tetting folie for å unngå lys.</li>
	<li>Sette platen på en shaker (lav hastighet) på RT for 2 h. sette platen i 4 ° C kjøleskapet og la platen å ruge over natten (18-24 h).</li>
</ol>6. klargjør Streptavidin platen
<ol><li>Ta en streptavidin plate fra 4 ° C kjøleskapet og la platen å komme til RT.</li>
	<li>Når streptavidin platen er RT, legger du til 150 µL av 3% blokkering A i hver brønn.</li>
	<li>Dekk PCR platen med tetting folie.</li>
	<li>Inkuber platen i 4 ° C kjøleskap over natten. Merk: Analysen dag 2 inneholder trinn 7 til trinn 9.</li>
</ol>7. overføring Serum/Antigen Ruger til Streptavidin Plate
<ol><li>Neste dag, ta ut streptavidin platen fra kjøleskap og kast bufferen fra platen. Fastsatt noen tørr papirhåndklær på bordet og trykk platen opp ned til ingen mer buffer i brønnene.</li>
	<li>Fyll den tomme streptavidin platen med 150 µL av PBST per brønn og kast PBST fra platen for totalt tre vasker.</li>
	<li>Overføring 30 µL av serum/antigen Ruger per godt inn i streptavidin-plate.</li>
	<li>Dekk platen med folie å unngå lys. Riste platen, på en lav innstilling, på RT 1t.</li>
</ol>8. vaske platen og legge lesebufferen
<ol><li>Forkast Ruger fra platen. Tilsett 150 µL av PBST per brønn og forkaste PBST fra platen for totalt tre vasker.</li>
	<li>Etter vasking, legger du til 150 µL per brønn lesing bufferen. Merk: Det er viktig å unngå luftbobler i løsningen fordi dette vil påvirke hvordan platen leses på plate leser maskinen.</li>
</ol>9. lese platen og analysere Data
<ol><li>Telle plate plate leser maskinen. Antistoff vises som teller per sekund (CPS).</li>
	<li>Formidle antistoff nivåene mottatt fra platen leser maskinen som en relativ indeks. Beregne indeksen fra følgende ligning: Indeksere verdi = [CPS (eksempel) - CPS (negativ kontroll)] / [CPS (positiv kontroll) - CPS (negativ kontroll)].</li>
	<li>Identifisere positive og negative antistoff resultater med cut-off for positivitet, definert basert på den 99nde persentilen av 100 sunn control fag (ikke-diabetikere personer uten noen kjente autoimmune sykdommer og som har ingen familiehistorie med diabetes).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes:+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment.">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+Predictors+of+progression+from+the+appearance+of+islet+autoantibodies+to+early+childhood+diabetes:+The+Environmental+Determinants+of+Diabetes+in+the+Young+(TEDDY).">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li><li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEDDY+Study+Group.+The+6+year+incidence+of+diabetesassociated+autoantibodies+in+genetically+at-risk+children:+the+TEDDY+study.">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li><li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics.">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li><li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+type+1+diabetes.">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin,+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies,+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes:+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young.">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li><li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+high-affinity+immune+responses+to+(pro)insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes.">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li><li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Yu, L. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li><li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients.">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li><li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays.">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li><li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+&#34;subspecificity&#34;+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody &#34;subspecificity&#34; in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+autoimmune+disease+found+in+33%+of+patients+at+type+1+diabetes+onset.">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Holme autoantistoffer er de mest pålitelige biomarkers for autoimmunitet av type 1 diabetes. De markerer starten på Holme bestemt autoimmunitet og bestemme utilslørt sykdom risiko. ECL analysen, for Holme autoantistoffer, er grundig validert i flere nasjonale og internasjonale type 1 diabetes kliniske forsøk. Analysen har vist økt sensitivitet og spesifisitet sammenlignet med nåværende "gull" standard RBAs. ECL analysen har vist sin overlegne fordelen for høyere sykdom spesifisitet av kresne høy affinitet og høy risiko Holme autoantistoffer fra lav-risiko, lav-affinitet signaler generert av RBA. Dette er spesielt lagt merke til i fag som er bare enkelt Holme autoantibody positiv har aldri kommet til type 1 diabetes. De fleste av disse lav affinitet autoantistoffer fant tapt under oppfølging tester gjort innen måneder til år, oppfører seg som en "forbigående positiv." Som tidligere hypotese, disse lave affinitet "single" autoantistoffer sannsynlig skyldes immunisering med et cross-reactive molekyl. Mens høyere affinitet skyldes høyere risiko Holme autoantistoffer immunisering med Holme antigener seg. I tillegg har ECL-analyser vist evnen til å antedate av 'serokonversjon' fra gjeldende standard radio-bindende analyser (RBA) år hos barn med pre-diabetes, som ble fulgt til kliniske diabetes fra fødselen. En pågående internasjonale kliniske, The miljømessige determinanter av Diabetes i de unge (TEDDY), avhengig av nøyaktig påvisning å finne tidsberegningen og utseendet på den første Holme autoantibody 'serokonversjon' for å markere begynnelsen av Holme autoimmunitet og identifisere miljømessige utløsere. En mulig årsak til økt følsomhet i ECL analysen er at analysen fanger alle immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarere enn tradisjonelle RBA eller ELISA som stole bare på deteksjon av IgG.
I ECL analyser, for noen bestemt autoantistoffer som IAA, synes binding av autoantistoffer til antigenet å være hemmet av en komponent i normal humant serum. For å fjerne eller løslate denne hemming, var syre behandling av serumprøver nødvendig før serum ble inkubert med antigen. Som vist i [figur 5], ECL-IAA analysen, bindende aktiviteter både mus insulin monoklonale antistoffer og pasienter serum autoantistoffer antigen ble kraftig forbedret. Forsuring av serumprøver, brukes i antistoff analyser, brukes vanligvis til å fjerne eksisterende bundet komplekser. Mekanismen bak hvordan IAA signaler er hemmet i koagulasjon og utgitt av forsuring av serum er ikke kjent, men denne metoden er brukt i andre ECL basert analyser14,15.
I noen tilfeller, når merking molekyler, er Biotin eller Sulfo-tag, merking positionsinside av antigen protein molekyler på, eller nær viktige epitopes av antistoff binding, noe som kan påvirke aktiviteten binding til antistoffer. Dette vil redusere analysen følsomhet kan helt rive ned analysen. For rutine merking prosedyre, er maksimere eller metning ønskelig for hvert antigen protein molekyl generere maksimal aktivitet eller signal per merket molekyl maksimere merking kapasitet på hver mulig merking posisjon. Umettet merking skal utføres ved å redusere molar forholdet mellom merking molekyler (Biotin og Sulfo-tag) til antigen protein hvis merking på antigenet blir en mulig årsak til avbrytelse av antistoff binding aktivitet. Major epitopes kan være bedre reservert avbrudd antistoff binding aktivitet kan frigis ved hjelp av umettet merking strategien i de fleste tilfeller.
Hver analysen bør inneholde en standard høy positive og negative internkontroll for indeksen beregninger av ukjent prøver. En lav positiv kontroll nær analysens øvre grense for vanlige kontroller er viktig å inkludere for overvåking av analysen følsomhet. Laboratoriet bør holde nok dele standard positive og negative kontroller for langsiktig bruk og alle dele bør lagres på 20 ° C. For analysen kvalitetssikring, analyser må kjøres i duplikater for hver prøve og hver positivt resultat skal bekreftes ved å gjenta eksemplet i en separat analysen. En tredje analysen er nødvendig når andre bekreftende analysen ikke enig med første analysen og resultatene av to analyser, som er enig (f.eks., +, + eller-, -), blir den endelige fastsettelsen av et positivt eller negativt resultat.
Med plattformen satt for enkelt ECL analyser, kan en multiplex analysen utvides ved fra disse. Det kan samtidig avgjøre til 10 forskjellige autoantistoffer i én enkelt godt med en liten mengde serum. Foreløpig er fire Holme autoantistoffer inkludert IAA, GADA, IA-2A og ZnT8A like viktig for risiko prediksjon av progresjon til T1D i begge slektninger av pasienter med T1D og befolkningen generelt. Metodene benyttet for screening disse 4 autoantistoffer ved å bruke gjeldende enkelt autoantibody mål er arbeidskrevende og ineffektive, spesielt for storskala befolkningen screening. Viktigere, opp til 40% av pasienter med T1D har en autoimmun tilleggsbetingelse16,17,18. Dessverre, det er ingen enkel og billig verktøy til skjermen for disse betingelsene. Multiplex ECL analysen er ikke bare i stand til å kombinere 4 gjeldende store Holme autoantibody analyser i en, men også er i stand til å ytterligere kombinere flere autoantibody analyser fra andre relevante autoimmune sykdommer. Dette gjør det mulig å effektivt gjennomføre høy gjennomstrømning screening for flere autoimmune sykdommer samtidig i store populasjoner. I multiplex ECL analysen, som vist i [figur 6], vil hver antistoff-antigen komplekset dannet i væske-fase dempes til et bestemt koblingsfunksjonalitet kilde sted i samme godt. Signalmottakeren på plate leser maskinen er kunne kjenne signalene fra 10 forskjellige kilder av flekker. Men kan stedene med en ekstremt høy signal generere høy analysen bakgrunn og forårsake interferens til nærliggende steder gjennom kryss-snakk. Derfor bør øvre grense signalene for hver autoantibody analysen begrenses til mindre enn 20.000 teller. I vår erfaring, bør autoantistoffer med lavere bakgrunn plasseres relativt langt borte fra de stedene har høyere teller når stedet kartet er utformet. For langsiktige studier med multiplex ECL analyser, anbefales det at samme linker brukes til samme autoantibody analysen for å holde analysen konsekvent.

Et siste oppsetning klassifikasjonssystem er opprettet for å bistå med diagnose av innledende stadier av T1D hos pasienter. Nøyaktig påvisning av menneskelig Holme autoantistoffer spiller en viktig rolle i å identifisere og iscenesettelse presymptomatic type 1 diabetes, som tilstedeværelse av Holme autoantistoffer indikerer tilstedeværelse av β-celle autoimmunitet. På hvilke diabetes påvirker pasienter fra den første forekomsten av β-celle autoimmunitet til symptomatisk sykdom, forbundet med antall og type av Holme autoantistoffer, er variabel2,3.
Autoantibody serokonversjon, titer og affinitet av Holme autoantistoffer kan påvirke hastigheten på progresjon til symptomatisk type 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Nylig utviklet ECL analyser har blitt grundig validert, har vist økt følsomhet, og er mer sykdom-spesifikke10,11,12,13. Disse analyser forbedre prediksjon og iscenesettelse av diabetes risiko gjennom tidligere oppdagelse av Holme autoantistoffer. De mer presist merke initiering av Holme autoimmunitet og ignorere lav-affinitet og lav risiko signalene ikke er relevant for diabetes.
I ECL analysen bro autoantistoffer i serum, hvis Sulfo-tag-konjugerte antigen til biotinylated fange antigen i flytende fase. Etter bygge bro, er Biotin linker fanget i solid fase og oppdaget gjennom ECL av Sulfo-koden på streptavidin belagt plate (figur 1).
I denne anmeldelsen benyttes hovedsakelig enkelt antistoff ECL analyser med menneskelige Holme autoantistoffer. Kort, multiplekset antistoff analyser basert på enkelt ECL analyser vil bli diskutert. Multiplex analysen kan brukes til å identifisere flere, opptil 10, autoantistoffer i én Vel, bruke 15 µL av serum. Denne enkle høy gjennomstrømning analysen kan brukes til skjermen, samtidig, flere autoantistoffer for flere relevante autoimmune sykdommer i befolkningen generelt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:292px;">Human recombinant proinsulin protein(PINS)</td>
			<td style="width:151px;">AmideBio</td>
			<td style="width:137px;">Human Proinsulin, Rec</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant GAD65 protein</td>
			<td style="width:151px;">Diamyd</td>
			<td style="width:137px;">rhGAD65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human recombinant IA-2 protein</td>
			<td style="width:151px;">Creative BioMart</td>
			<td style="width:137px;">IA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:151px;">SIGMA-ALORICH</td>
			<td style="width:137px;">A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well PCR plate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin coated plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">L15SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba sizing spin column</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Twen-20</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HCl</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:151px;">Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ-Link Biotin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-tag</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Blocker A</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">R93AA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4x Read Buffer T with Surfactant</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-PEG4-Biotin</td>
			<td>ThermoScience</td>
			<td>21329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sulfo-TAG</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R91AO-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well polymerase chain reaction (PCR) plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:137px;">14230232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-Well Streptavidin plate</td>
			<td style="width:151px;">MSD GOLD</td>
			<td style="width:137px;">L 15SA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td style="width:151px;">ThermoScience</td>
			<td style="width:137px;">PL208984</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Plate Shaker</td>
			<td style="width:151px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:137px;">1296-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Reader</td>
			<td style="width:151px;">MSD</td>
			<td style="width:137px;">QuickPlex SQ120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Benchtop centrifuge with bucket rotary</td>
			<td style="width:151px;">Beckman</td>
			<td style="width:137px;">Allegra X-15R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrochemiluminescence assays for human islet autoantibodies

Isolerer Holme autoantistoffer forbundet med type 1 diabetes leder (T1D) vei til prosjektet og avskrekke denne sykdommen i befolkningen generelt. En roman ECL analysen er en nonradioactive væske fase analysen for Holme autoantistoffer med høyere sensitivitet og spesifisitet enn gjeldende "gull" standard radio-bindende analysen (RBA). ECL analyser kan mer presist definere utbruddet av presymptomatic T1D av skille de høy risiko, høy affinitet autoantistoffer fra lav-risiko, lav-affinitet autoantistoffer generert i RBAs og konvensjonelle enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISA ). Antigen protein brukes i denne ECL analysen er merket med Sulfo-tag og Biotin, henholdsvis. Hver ECL autoantibody analysen som bruker et bestemt antigen protein trenger en optimalisering trinn før den kan brukes for laboratorium søknad. Dette er spesielt viktig å bestemme kravene for serum syre behandlinger, konsentrasjoner og prosenter av de to forskjellige antigener merket med Sulfo-tag og Biotin. For å utføre analysen, serum prøver er blandet med Sulfo-tag-konjugerte og biotinylated fange antigen protein i fosfat bufret løsning (PBS), inneholder 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Etterpå er prøvene ruges natten på 4 ° C. Samme dag, er en streptavidin-belagt plate forberedt med blokkering buffer og ruges natten på 4 ° C. På den andre dagen, vask streptavidin plate og overføre serum-antigen blandingen på platen. Plasser platen på plate shaker, sette den på lav hastighet og ruge ved romtemperatur 1t. Deretter platen vaskes igjen, og leseren bufferen er lagt. Plate så telles på plate leser maskinen. Resultatene er formidlet gjennom et stikkordregister som genereres fra standard positive og negative internkontroll serumprøver.

Figur 2 viser sjakkbrett. Det vises at 250 ng/mL av Biotin og 250 ng/mL Sulfo-tag merket antigen er de mest rasjonell konsentrasjonene i analysen vurderer signalene fra høy positiv kontroll prøven, negativ kontroll prøven som analysens bakgrunn, og forholdet mellom positiv til negativ signaler. Med de optimaliserte konsentrasjonene av disse to merket antigener, ble analysen utført med serumprøver fra 100 nydiagnostiserte pasienter med T1D og 100 sunn kontroller. Indeksverdien for 0.023 ble definert som cut-off analysen for positivitet. Dette representerer 85% følsomhet i pasienter og 99% spesifisitet i sunn kontroller som bruker mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurven vises i figur 3A. Analysen for ukjent prøvene ble gjennomført med interne standard høy positive, lav positive og negative kontroll prøver. Resultatene teller CPS vises i tabell 2A. Gjennomsnittet CPS høyt og lavt positiv kontroller er uthevet i rødt, 17903 [(19940+15866)/2] og 839 [(857+820)/2], og negative kontrollene er uthevet i grønt, 168 [(170+165)/2]. Indeksen for ukjent prøver beregnes ved "(CPSprøve-168)/(17903-168)." Tabellen 2B viser beregnet indeksverdier for alle utvalg. Indeksverdiene som er større enn 0.023 er skrevet i rødt, tilsvarer CPS verdiene også skrevet i rødt i tabellen 2A. Disse verdiene defineres som de positive resultatene som er større enn det 99te persentilet av befolkningen sunn kontroll. Når en irrasjonell antigen konsentrasjon, vil analysen ha en høy bakgrunn, som vist i tabell 2 C. Lave nivåer av positiv antistoffer vil bli savnet som verdiene A2, A5, D1 og H4 vises i grått i tabellen 2D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Figur 1 : Illustrasjon av en bivalent plate fangst på en enkelt ECL-IAA analysen. Holme autoantibody i serum broene Sulfo-taggen konjugert antigenet biotinylated fange antigen, som er fanget i solid fase på tallerkenen streptavidin-belagt. Påvisning av plate-fanget Sulfo-tag konjugert antigenet gjøres gjennom ECL. Dette tallet har blitt endret fra Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Figur 2 : The ROC kurve for å bestemme cut-off av analysen positivitet. Den 99th persentilen av spesifisitet tilsvarer 85% følsomhet ble valgt og vises som en indeksverdi på 0.023. Dette øvre grense for analysen ble tatt fra 100 sunn kontroller. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Figur 3 : Illustrasjon av normal humant serum blokkere ECL-IAA signaler. A: signalene fra ECL-IAA analyser med en insulin monoklonalt antistoff (MoAb) ble drastisk blokkert med tillegg av vanlig humant serum. Når du sammenligner MoAb i PBS, ble signalet delvis restaurert når den humant serum ble behandlet med syre. B: signaler fra ECL-IAA analysen med 4 pasienten sera ble betydelig forbedret med syre behandling. Dette tallet har blitt endret fra Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Figur 4 : Illustrasjon av Mutiplex ECL analysen. Antistoff-antigen komplekser dannes i væske-fase med bestemte linkers. De spesifikke antistoffer-antigen-linker kompleksene er behersket på hver av de spesifikke linker-stedene i samme godt. Plate leser maskinen kan skille signalene fra ulike kilder for flekker og gir CPS teller på 10 forskjellige kanaler, henholdsvis. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabell 1: kontrolløren styret analysen bestemmer konsentrasjoner og prosenter av Biotin og Sulfo-tag merket antigener. A: rå CPS teller for kontrolløren styret plate med høy positiv serum på halv plate og negative serum på den andre halvparten. Konsentrasjonen av biotinylated antigen ble utvannet vannrett i serien og konsentrasjonen av Sulfo-tag merket antigen ble utvannet loddrett i serien. B: forholdet verdier CPS teller fra høy positiv serum mot hver av deres tilsvarende CPS teller fra negative serum. Gul uthevede brønnene representerer det beste forholdet mellom positive til negative i panelet B. Dette forholdet tilsvarer den 250 ng/mL Biotin og 250 ng/mL Sulfo-tag merket antigen konsentrasjoner i panelet A med en akseptabel lav CPS teller for negative serum. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabell 2: analyse av analyseresultatene. A: rå CPS teller fra analysen plate med de høyt og lavt positiv standardkontrollene som uthevet i rødt og de negative standardkontrollene som uthevet i grønt. Hvert utvalg ble duplisert i analysen. B: indeksverdier ble beregnet, som beskrevet i analysen protokollen. Noen indeksverdien som var større enn 0.023 ble definert som et positivt resultat, uthevet i rødt. C: rå CPS teller fra analysen plate med samme sett av prøver når en irrasjonell antigen konsentrasjon ble brukt. Dette resulterte i en høy bakgrunn og noen lav positive normalt oppdaget, som vist i panelet B, ble konvertert til negativer, vises i grått i panelet D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies at JoVE.com

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Her presentert vi metodene for å oppdage menneskelige Holme autoantistoffer bruker electrochemiluminescence (ECL) analyser. Protokollen, som brukes til å forutsi type 1 diabetes, kan utvides ved for å oppdage autoantistoffer for andre autoimmune sykdommer.

Electrochemiluminescence analyser for menneskelig Holme autoantistoffer

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Analyser for identifisering av nye antivirale midler mot blåtungevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Visualisering av den immunologiske Synapse av Dual Color Time-gated Stimulert Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Viral Konsentrasjon Bestemmelse Gjennom platebedømmelser: Ved hjelp av tradisjonelle og Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidlig Viral Entry Analyser for identifisering og evaluering av Antiviral Forbindelser

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Generering av To-farge Antigen Mikromatriser for samtidig påvisning av IgG og IgM autoantistoffer

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

Screening analyser betegner romanen Endothelial regulatorer involvert i inflammatorisk respons

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Måle influensa nøytralisere antistoff Svar å A(H3N2) virus i menneskelig Sera av Microneutralization søk ved hjelp av MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

En Murine bukspyttkjertelen Holme celle-basert Screening for Diabetogenic miljø kjemikalier

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...